利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法及其裝置的製作方法

2023-07-29 20:24:41

專利名稱：利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法及其裝置的製作方法
技術領域：
本發明涉及的是ー種利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法及其裝置。
背景技術：
黃黴素(Flavomycin)又名默諾黴素(Moeno_mycin)、黃磷酯素 (Flavophospolipl)、斑伯黴素(Bam-bermycin),是德國赫斯特公司在20世紀70年代初期開發的ー種新型抗生素類促生長劑。黃黴素主要由五個微生物活性物質組成，其中默諾黴素A為主要成分，此種抗生素通過真菌的厭氧發酵形成，存在於菌絲體中，可通過提取分離。對純化後的抗生素進行理化分析表明，它是ー種含磷的糖酷，不同於現有的任何ー種抗生素。具有用量小、促生長效果顯著，性能穩定，不與其它添加劑產生拮抗作用，不易產生耐藥性，無汙染、無殘留、安全性高等特點。黃黴素在國外畜牧水產養殖業已得到普遍應用，而在我國的應用剛剛起步，科技工作者將紫外(UV)、微波物、離子注入劑和化學[9]誘變技術引進了誘變育種領域。為了提高黃黴素等微生物菌種的生產能力，應用合理的篩選程序及適當的篩選辦法把優良的菌種選育出來，開發新的誘變方法為ー個有益的嘗試，我們用高壓電暈電場作為新的誘變源對黃黴素產生菌進行了研究。自從人們發現電場生物效應後，電場對生物體的影響成為了研究的熱點，並且在許多領域得到了應用，電子束輻照可以對食物進行保鮮。電場處理能明顯提高植物愈傷組織誘導率和分化率。而利用高壓電暈電場對微生物進行誘變的方法尚未見報導。本試驗用我們研究設計的針-板高壓電暈電場處理裝置，以出發菌08-28菌種進行電場誘變處理，以期得到性能穩定、優良高產的黃黴素生產菌種，從而證實高壓電暈電場裝置可以對微生物進行誘變。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足提供ー種利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法及其裝置。本發明的技術方案如下ー種利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法，誘變電壓為21kV，針尖距離為8mm,誘變時間為4min。所述的方法中採用的高壓電暈電場裝置，針尖間距為20mm，針板間距是25mm，針尖直徑d < O. 01mm。黃黴素產生菌08-28對電場很敏感，隨著誘變劑量的增大菌種致死率也隨之增大，誘變電壓為21kV，針尖距離為8mm，誘變時間為4min時是最佳誘變劑量。經過電場誘變處理、篩選及傳代培養得到了「誘變3號」菌株，其產黃黴素的能力相對原始菌株最高提高了 I. 92倍。說明高壓電暈電場處理黃黴素產生菌有較好的誘變效果。


圖I為聞壓電暈電場實驗裝直；a :針尖間距；d :針板間距；A :電流表；V :電壓表；圖2為負電暈放電的伏安特性；圖3為正電暈放電的伏安特性；圖4為極板間溫度與電壓的關係；圖5為誘變致死率曲線。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。I.材料和方法I. I 材料I. I. I菌種出發菌種08-28 (斑駁鏈黴菌S. bambergiensis)內蒙古中牧生物藥業有限公司提供。
I. 1.2試劑黃黴素標準品(Img相當於1395黃黴素單位)，中國獸醫藥品監察所；硫酸鏈黴素(650μ g/mg)，進ロ ；Ager，Japan ;糊精、K2HP043H20，天津市風船化學試劑科技有限公司；FeS04*7H20、葡萄糖、MgS04*7H20，天津市四通化工廠；甲酸銨、蛋白腖、天津市光復精細化工研究所；酵母浸粉，北京奧博星生物技術責任有限公司；抗壞血酸，天津市化學試劑三廠；牛肉浸膏，天津市英博生化試劑有限公司；澱粉酶，北京雙旋微生物培養基製品廠；Tris-Base, Sigma ;以上試劑均為分析純。甲醇(色譜純)，天津市光復精細化工研究所；こ腈(色譜純)，天津市永大化學試劑有限公司；大豆粉、玉米漿、玉米澱粉，市售。I. I. 3 色譜柱選用 Agilent HC-C18 色譜柱(250X4. 6mm)。I. I. 4儀器AKTA Purifier 10蛋白純化儀(通用電氣中國醫療集団)JY92-II型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；數顯恆溫水浴鍋(蘇州威爾實驗用品有限公司)；KQ-100DE型數控超聲波清洗器(崑山市超聲儀器有限公司)；pH計(梅特勒-託利多儀器上海有限公司)；G154DWS型高溫滅菌鍋(美國獨資致微廈門儀器有限公司)；BS110S型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；高速冷凍離心機(USA)；恆溫搖床(上海智城分析儀器製造有限公司)；低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)；生化培養箱(湖北省黃石市恆豐醫療機械有限公司)。I. I. 5培養基斜面及平板分離培養基(g/100mL):糊精I. 5g, K2HPO4 ·3Η20 O. 05g，蔗糖 O. 3g，MgSO4 · 7H20 0.04g，酵母浸粉 0. 3g，FeSO4 · 7H20 0. Olg，大豆蛋白腖 0. 5g，NaCl0. 05g，牛肉浸膏0. lg，瓊脂粉I. 2g。使用超純水配製，定容至配製體積，用lmol/L的NaOH和 lmol/L 的 HCl 調節 pH 至 6. 8-7. O。種子搖瓶培養基(g/1 OOmL):玉米漿0. 3g，K2HPO4 O. Ig,大豆粉3. Og,輕質CaCO3O. 25g，葡萄糖4. 0g。注超純水配製，配製時，先將玉米漿和大豆粉加水混合，在100°C下加熱糊化30min ;再加入其他成分，定容至配製體積調節pH至6. 8-7. O, CaCO3單獨稱量且分裝到每個搖瓶中。發酵搖瓶培養基(g/1OOmL):玉米漿O. 9g，FeSO4 · 7H20 O. 00004g,大豆粉 3. 4g，CoSO4 · 7H20 0. 0001g,玉米澱粉 3. 2g, ZnSO4 · 7H20 0. 0002g,大豆色拉油 4. 0g, CuSO4 · 5H20O. 0005g, (NH4)2SO4 0. 3g, CaCO3 0. 5g, K2HPO4 0. Olg,澱粉酶，0. 0000064g, MgSO4 · 7Η20O. 05g,消泡劑 O. 02ml/100ml。以上均為121°C滅菌30min。1.1.6培養條件斜面及平板分離培養基37°C恆溫培養72h_96h，單菌落直徑在3_5mm。種子搖瓶培養基37°C恆溫培養24h，搖床轉速250_260r/min。發酵搖瓶培養基37°C恆溫培養170h，搖床轉速250_260r/min。I. I. 7菌懸液的製備取平板分離培養基上生產良好的單菌落，在無菌狀態下接至種子藥瓶中。待培養完成後，將已滅菌的玻璃珠和碎玻璃片倒入三角瓶中，包紮好，放在搖床上(250-260r/min) 振蕩30分鐘後，梯度稀釋平板計數，菌絲段濃度約為8*107個/ml，封ロ待用。I. 2 方法I. 2. I平板分離取一定量出發菌液08-28進行梯度稀釋並塗布在平板分離培養基上，37°C恆溫培養3-4d，以去除雜菌。I. 2. 2抗性菌株的篩選挑選單菌落製成菌懸液並分別塗布於含有鏈黴素(濃度為O-l.Ou/ml)的平板培養基上37°C恆溫培養3-4d。觀察不同平板上的菌落生長情況，記錄鏈黴素的最低作用濃度，即為菌株對鏈黴素的最小抑制濃度，此濃度下生長的菌株即為抗性菌株。I. 2. 3高壓電暈電場的設計實驗裝置示意圖如圖I所示。直流高壓電源分正、負，電壓從O到30kV連續可調，針尖間距a = 20mm,針-板間距d = 25mm，用解析度為10 μ A、精度為0.8%的μΑ表檢測放電電流，Q-3V型電壓表用來檢測外加電壓。放電介質為常壓空氣，相対溼度為30%，溫度為20 25で。1.2. 4誘變處理將篩選出的鏈黴素抗性菌株接於種子搖瓶培養基中，在37°C，260rpm條件下培養24h。培養完成後,加適量滅菌後的的玻璃珠於種子搖瓶中，搖床中振蕩30min後,在無菌工作檯中向半徑為3. 5cm且已滅好菌的培養皿中加入3ml振蕩好的菌液。將菌液置於電場針尖下，調節電壓使針尖放電。取相同量的原始菌液與誘變後的菌液按梯度塗布於平板分離培養基中，記錄菌落個數。在同一梯度下計算致死率致死率=(原始菌落數-誘變後菌落數)*100% /原始菌落數。誘變後進行培養並測定效價。I. 2. 5效價檢測(I)樣品處理黃黴素標準品取標準品適量用50%的甲醇溶液稀釋至不同濃度，O. 22um有機濾膜過濾，超聲脫氣lOmin。原始菌及誘變菌發酵液取適量發酵液,用50%甲醇溶液稀釋，加抗壞血酸80mg，用三羥甲基氨基甲烷約IOOmg調節pH至8. 1±0. 1，用細胞粉碎機超聲萃取15min，放置室溫約30min，用離心機以12000RPM高速離心20min，取上清液用O. 22um有機濾膜過濾並收
集樣品。(2) BufferA 的配製製備O. 2%的甲酸銨溶液(10%的磷酸調節pH至4. 9)-こ腈(體積比55 45)，用O. 22um有機濾膜過濾，低頻超聲脫氣約lOmin。
(3)檢測方法平衡分析柱後，設置流速為O. 5mL/min,檢測波長為258nm。取樣品適量(大於2倍樣品環體積)注入至IOOul的樣品環中，用蛋白純化儀記錄色譜圖至黃黴素A組分峰保留時間的2倍。2結果與分析2. I高壓電暈電場的特性多次實驗結果表明當針尖間距是20mm,針-板間距是25mm時不影響放電的穩定性，此時放電能量密度較高，所以一般選擇針尖間距為20mm，針-板間距是25mm，針尖直徑d < O. 01mm。為得到較高的突變率，對微生物進行誘變處理時可根據具體菌種設置針-板間距。本次誘變經多次試驗，確定針-板間距為8mm為合適的間距。外加電壓為O到30kv連續可調，實驗測得正負電暈放電伏安特性如圖2和圖3所示。從圖中可以看出無論是正電暈還是負電暈，針對板電暈放電的放電電流隨外加電壓升高而增加，正電暈放電的電壓範圍較窄，負電暈放電的電壓範圍較寬，在相同外加電壓下負電暈的放電電流大，曲線平滑，且負電暈放電的穩定性好。由於極板間存在微小電流，會使極板間空氣溫度逐漸上升。為了確定極板間空氣的溫度，我們使用DALI 700B紅外熱像儀進行了測量。用22°C室溫進行調零，每隔Ikv測量一次溫度，每次調整好電壓之後，等待一分鐘的時間，以使極板間達到熱平衡，拍照並儲存照片。根據軟體測出圖像上所選區域的中值溫度，其電壓與溫度的曲線如圖4所示。電壓在20kv之前溫度隨電壓的增加而線性升高，電壓在20kv之後溫度基本趨於穩定，此時溫度大約比室溫高10°C左右。2. 2菌株對鏈黴素的耐受性實驗將出發菌種的菌液塗布在含不同濃度鏈黴素的平板培養基上，觀察不同平板上的生長情況如表I所示。表I出發菌株在含不同濃度鏈黴素平板培養基上的生長情況 鏈黴素濃
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50
度(u/ml)
生長情況 ++++++ I I Ill ト-H-H I I -H-H--H- -HH-+++ +-HH-+ -H-H-+ -HH-H- Ill 卜+ -H-H- HH-H-
鏈黴素濃
0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00
度 Cu/ml)
生長情況 ++++ +-H-+++±-----注+生長良好，土微弱生長，-不生長結果表明，在鏈黴素濃為度O O. 60u/ml的範圍內，與不加鏈黴素的平板相比，菌株基本不受影響。隨著濃度増加，菌株逐漸減少，且菌落相對較小，當鏈黴素濃度達到O. 75u/ml時，平板上基本無菌落生長。由此表明，O. 75u/ml是黃黴素產生菌08-28對鏈黴素的最小抑制濃度。在此濃度下生長出來的菌落，具有抗性高，生產代謝能力強等特點。因此，選用此濃度下生長的菌株進行誘變處理。2. 3誘變處理的致死率及最佳誘變條件的確定不同電場處理劑量下的致死率如圖5所示。參考文獻表明通過致死率曲線可以找到誘變劑量-致死率-突變率三者最佳結合點，致死率達到75% 85%時為較合適的誘變劑量。因此確定電場處理條件為電壓21kV時間4min。2. 4黃黴素產量檢測結果2. 4. I標準品色譜圖及標準曲線將黃黴素標準品經過處理後注入到蛋白純化儀中，得到的色譜圖。由於不同質量濃度的黃黴素，其色譜圖峰面積大小不同，且在一定範圍內，峰面積(X)隨黃黴素濃度(y)的增減而增減。由此，可以得到一條直線，擬合直線方程為 y = O. 5113X+73. 678。2. 4. 2發酵篩選和高產菌株的穩定性試驗通過對黃黴素標準品的檢測，確定黃黴素出峰位置。將每個原始菌株和誘變菌株分別用3個發酵搖瓶進行發酵培養，經過170h後，用蛋白純化儀進行黃黴素色譜檢測，對圖像積分得出峰面積，並計算出峰面積的平均值，由標準曲線方程得到對應的效價值。通過進行發酵搖瓶驗證，其中原始菌4株，正突變8株，負突變18株，除原始菌外，其它誘變條件均為誘變電壓為21kV，針尖距離為8mm，誘變時間為4min。部分結果如表2所示。表2篩選結果
權利要求
1.ー種利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法，其特徵在於，誘變電壓為2IkV,針尖距離為8mm,誘變時間為4min。
2.權利要求I所述的方法中採用的高壓電暈電場裝置，其特徵在於，針尖間距為20mm，針板間距是25mm,針尖直徑d < O. 01mm。
全文摘要
本發明公開了一種利用高壓電暈電場對黃黴素產生菌進行誘變的方法，誘變電壓為21kV，針尖距離為8mm，誘變時間為4min。所述的方法中採用的高壓電暈電場裝置，針尖間距為20mm，針板間距是25mm，針尖直徑d＜0.01mm。黃黴素產生菌08-28對電場很敏感，隨著誘變劑量的增大菌種致死率也隨之增大，誘變電壓為21kV，針尖距離為8mm，誘變時間為4min時是最佳誘變劑量。經過電場誘變處理、篩選及傳代培養得到了「誘變3號」菌株，其產黃黴素的能力相對原始菌株最高提高了1.92倍。說明高壓電暈電場處理黃黴素產生菌有較好的誘變效果。
文檔編號C12N13/00GK102703421SQ20121020102
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月18日 優先權日2012年6月18日
發明者那日 申請人:那日