霞水母來源具有抗疲勞活性的膠原蛋白肽及其製備工藝的製作方法

2023-07-29 06:38:06

專利名稱：霞水母來源具有抗疲勞活性的膠原蛋白肽及其製備工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽及其製備工藝，屬天然生物活性物質及其製備技術領域。

背景技術：
霞水母(Cyanea nozakii)，俗稱麻蜇，是一種大型海洋浮遊生物，屬刺胞動物門(Phylum Cnidaria)，缽水母綱(Class Scyphomedusae)，旗口水母目(Order Phylum cnidaria)，霞水母科(Family Cyanea)。我國沿海已發現的有白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、發形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyaneaferruginea Eschscholtz)，和紫色霞水母(Cyanea purpurea Kishinouye)4個種，其中以白色霞水母數量最多、分布範圍最廣。霞水母通常以小型浮遊動物為餌，其生殖腺發達，繁殖能力強，生長速度極快，目前我國霞水母的年產量已經高達千萬噸，構成了一種新的天然海洋生物資源。
海洋來源的多糖、蛋白聚糖和膠原蛋白活性肽是十分重要的天然海洋食品資源，常常具有顯著的生物活性，如海參多糖、海藻多糖等均有許多的研究報導，證實其具有顯著的生物活性。以霞水母為原料，從中分離提取製備膠原蛋白活性肽的研究國內外尚未見任何報導。


發明內容
本發明發明了一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽及其製備工藝。較為獨特的是，它以一種新型的天然海洋生物資源-霞水母(Cyanea nozakii)-作為膠原蛋白活性肽的製備原料進行加工，實現了對霞水母進行開發利用的目的。按照本發明進行操作，能夠以極高的產率獲得高純度膠原蛋白活性肽產品。這對於霞水母這一天然海洋生物資源的綜合利用而言是至關重要的。
本發明發明的霞水母活性膠原蛋白活性肽經初步的研究確認，基本無毒，具有顯著的抗疲勞活性，將作為新型的生物活性材料和保健食品原料被廣泛應用於食品工業和醫藥工業。
具體來說，首先，我們發現新鮮的或經過三礬醃製處理的市售麻蜇可以在經過脫鹽處理之後用作膠原蛋白活性肽的製備原料。其中所含的膠原蛋白活性肽對水浸泡處理是穩定的，在我們所採取的浸泡工藝條件下，既不會因受到浸泡而被降解、被提取到水中流失，也不會因受過浸泡而影響其在後續的水解處理中的分散性，即經過三礬醃製處理的市售麻蜇與剛捕撈上岸的新鮮的霞水母具有同等的可加工性，均可用作製備高純度高生物活性膠原蛋白活性肽的原料。由此奠定了以霞水母為原料加工製備高純度高生物活性膠原蛋白活性肽的基礎。
其次，在對溫度、壓力等水解條件以及氫氧化鈉、鹽酸、膠原蛋白酶等各種常用的溶融劑進行了系統的考察和對比後，我們發現，在適當的水解條件下，霞水母中所含有的膠原蛋白不經過變性處理，便可直接被水解，分散到水中，得到澄清透明，所含雜質很少的水解分散液。
我們發現，在浸泡溶劑、浸泡時間、水解劑等水解工藝參數中，水解劑的種類和水解時所採用的溫度對於水解得率而言是最為重要的。其中，有效的溶融劑為常見的鹼(如鈉、鉀、鈣、鋇的氫氧化物或碳酸鹽、氨水等)、常見的酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸或甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機酸)或各種蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等)中的一種或若干種。當選用氫氧化鈉為溶融劑時，pH值應當在7.0-14.0範圍之內，當選用鹽酸為溶融劑時，pH值應當在0.5-6.8範圍之內，當選用蛋白酶類為溶融劑時，pH值應當在所選酶的最適pH範圍之內；當選用酸鹼為溶融劑時，水解溫度應當在-30-200℃範圍內，最好是在0-60℃的範圍內，當選用蛋白酶類為溶融劑時，應當在蛋白酶類的最適溫度下進行水解。其他各項參數，浸泡脫鹽需進行6-15次，每次浸泡所需的用水量為所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡溫度在-50-98℃範圍內，浸泡時間為0.5-12hr次-1。液體的乾燥方式，可以是冷凍乾燥，也可以是噴霧乾燥。

具體實施例方式 下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。
實例一 取1000g三礬醃製處理的市售麻蜇，瀝水後，室溫下浸沒於2-5倍量的去離子水中浸泡，並每2-3小時換一次水，直至浸泡水中氯化鈉的含量低於1.5ppm為止(氯離子檢測呈陰性)。浸泡後的脫鹽霞水母添加活力為4000 Units的胰蛋白酶10g，在30-60℃下保溫溶融4-24小時，得到一懸浮液。然後離心(4℃，8000rpm，30min)，棄去不溶性殘渣，得到澄清透明的液體，即為膠原蛋白活性肽液；膠原蛋白活性肽液置旋轉蒸發儀上，40℃，0.001MPa下濃縮至原體積的1/5後噴霧乾燥(進風溫度185℃，出風溫度85℃)，得到20g純度達到90％以上的具有顯著的抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽粉固體。
實例二 取1000g新鮮霞水母，室溫下浸沒於2-5倍量的去離子水中浸泡，並每2-3小時換一次水，直至浸泡水中氯化鈉的含量低於1.5ppm為止(氯離子檢測呈陰性)。浸泡後的脫鹽霞水母添加活力為4000 Units的胰蛋白酶10g，在30-60℃下保溫溶融4-24小時，得到一懸浮液。然後離心(4℃，8000rpm，30min)，棄去不溶性殘渣，得到澄清透明的液體，即為膠原蛋白活性肽液；膠原蛋白活性肽液置旋轉蒸發儀上，40℃，0.001MPa下濃縮至原體積的1/5後冷凍乾燥，得到10g純度達到95％以上的具有顯著的抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽粉固體。
實例三 對一份膠原蛋白活性肽粉樣品進行了蛋白含量的測定，總糖含量的測定，胺基酸組成的測定以及單糖組成的測定。測定結果表明，該樣品中含88％的蛋白質，7.5％的糖，平均分子量為1274。所含單糖以葡萄糖為主，所含胺基酸的組成見表1。
表1 供試樣品的胺基酸組成

實例四 以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無錫市惠山江南實驗動物場提供批准號SCXK(蘇)2002-0006)為實驗動物，對所得到的膠原蛋白活性肽粉進行急性毒性試驗，所得結果如下 表2 供試樣品對小鼠體重的影響 表3急性毒性實驗結果 通過觀察，給藥後1h內小鼠活動均減少，4h後逐漸恢復正常活動。試驗組7d內進食量逐漸增加，且小鼠食慾、精神、毛色均正常；7d後，脫頸處死，肉眼屍檢未見心、肝、脾、肺、腎等主要臟器病變和中毒現象。觀察期7d內每天稱重，試驗組小鼠的體重不斷增加。研究結果表明，在供試樣品大劑量灌胃的情況下，未出現小鼠死亡，也未有明顯毒性反應。說明其無毒性或毒性很小，其最大安全劑量在7500mg/Kg以上。
實例五 以健康昆明種小白鼠(雌雄各半，4周齡，體重18-22g，由無錫市惠山江南實驗動物場提供批准號SCXK(蘇)2002-0006)為實驗動物，對所得到的膠原蛋白活性肽粉進行抗疲勞保健功能測試，所得結果如下 1負重遊泳實驗 表4 供試樣品對小鼠負重遊泳時間的影響 方差分析，P＜0.05；與對照組比較＊＊P＜0.01 由表4可知，試驗組小鼠的負重(5％)遊泳時間均比對照組的延長，且低劑量組、中劑量組、高劑量組與對照組比較，遊泳時間的差異具有高度顯著性(P＜0.01)，表明供試樣品能延長小鼠的負重遊泳時間，增強其耐力。並且各劑量組之間差異顯著(P＜0.01)。
2 血清尿素氮測定 表5 供試樣品對小鼠血清尿素氮的影響 方差分析，P＜0.05；與對照組比較＊P＜0.05；＊＊P＜0.01 由表5可知，試驗組的小鼠血清尿素氮含量均低於對照組，其中低劑量組與對照組比較有顯著性差異(P＜0.01)，表明水母膠原蛋白活性肽粉能減少或抑制疲勞小鼠血清尿素氮產生。劑量組之間的差異具有高度顯著性(P＜0.05)。
3 肝糖元含量測定 表6 供試樣品對小鼠肝糖原含量的影響 方差分析，P＜0.05；與對照組比較＊＊P＜0.01 由表6可知，試驗組小鼠肝糖原含量均高於對照組，且各劑量組與對照組比較，差異有高度顯著性(P＜0.01)，表明供試樣品具有促進肝糖原儲備的作用。
4 血乳酸測定 表7 供試樣品對小鼠血乳酸的影響 方差分析，P＜0.05；與對照組比較＊＊P＜0.01，＊P＜0.05 由表7可知，試驗組中低劑量組安靜時的血乳酸值與對照組有顯著差異(P＜0.05)，中劑量組和高劑量組與對照組比較無顯著性差異(P＞0.05)。而各劑量組遊泳10min後的血乳酸值均明顯低於對照組，差異均有顯著性(P＜0.01)，低劑量組在遊泳10min後20min的乳酸值與對照組相比，差異具有顯著性(P＜0.05)。但各劑量組之間差異無顯著性(P＞0.05)。各劑量組的乳酸曲線下面積與對照組相比，差異具有高度顯著性(P＜0.01)。表明供試樣品能降低小鼠運動後血乳酸含量。
抗疲勞實驗結果表明水母膠原蛋白活性肽粉能延長小鼠的負重遊泳時間，減少或抑制疲勞小鼠血清尿素氮產生，降低小鼠運動後血乳酸含量，促進肝糖原儲備的作用。
根據功能學評價檢驗方法，實驗小鼠負重遊泳實驗結果陽性，血乳酸、血清尿素、肝糖元三項生化指標中任二項指標陽性，可判定該受試樣品具有緩解體力疲勞功能的作用。本實驗在實驗小鼠負重遊泳實驗結果陽性基礎上，其餘三項生化指標均陽性，因此可判定水母膠原蛋白活性肽粉具有緩解體力疲勞功能的作用。
權利要求
1. 一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽。
2. 如權利要求1所述的膠原蛋白活性肽的製備工藝。該工藝由下列步驟組成
(1)以水為溶劑對霞水母進行浸泡，脫除原料霞水母中所含有的鹽分。
(2)對脫除了鹽分的霞水母進行溶融處理，使霞水母消融，得到一無色或淡黃色的液體。
(3)所得到的液體，經過(或不經過)均質、脫色、脫鹽處理，然後乾燥，得到-白色-淺黃色的粉末，即為膠原蛋白活性肽。
所宣稱的霞水母，俗稱麻蜇，係指霞水母科海洋生物白色霞水母(Cyanea nozaki Kishinouye)、發形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea Eschscholtz)或紫色霞水母(Cyaneapurpurea Kishinouye)的新鮮捕撈品或其經過三礬醃製的醃製品。
所宣稱的溶融處理，係指在一定的pH、溫度、壓力下，用特定的溶融劑進行的將霞水母融化在水中，形成液體的加工過程。
所宣稱的乾燥為使液體脫除水分，得到固體的加工過程。
所宣稱的膠原蛋白活性肽為自霞水母中分離提取得到的一種產物。它是一種白色或淡黃色粉末，無嗅，略帶苦味，其中含有80～90％的蛋白質，10～20％的糖，平均分子量在1,000～3,000之間。該膠原蛋白活性肽無毒，具有顯著的抗疲勞生物活性。
3. 權利要求2中宣稱的水係指pH調節為某一定值的自來水或去離子水，其pH值在2-12範圍之內。
4. 權利要求2中宣稱的浸泡，進行6-15次，每次浸泡所需的用水量為所投放的霞水母原料的1-5倍，浸泡溫度在-50-98℃範圍內，浸泡時間為0.5-12hr次-1。
5. 權利要求2中宣稱的溶融處理，其操作pH為0.5-14.0。
6. 權利要求2中宣稱的溶融處理，其操作溫度為-30-200℃。
7. 權利要求2中宣稱的溶融處理，其操作壓力為0.0001-0.5MPa。
8. 權利要求2中宣稱的溶融處理，可供選用的溶融劑為0.1～10molL-1的鹼(如鈉、鉀、鈣、鋇的氫氧化物或碳酸鹽、氨水等)、0.1～10molL-1的酸(如鹽酸、磷酸、硫酸等無機酸或甲酸、醋酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸等有機酸)或各種蛋白酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、酸性蛋白酶、鹼性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、膠原蛋白酶、彈性蛋白酶等)中的一種或若干種。
9. 權利要求2中宣稱的乾燥，可以是冷凍乾燥，也可以是噴霧乾燥。
全文摘要
本發明發明了一種霞水母來源的具有抗疲勞活性的膠原蛋白活性肽及其製備工藝，屬天然生物活性物質及其製備技術領域。它提供了一種新型的天然海洋生物活性肽。按照本發明進行操作，能夠獲得2％的純度達到90％以上的膠原蛋白活性肽。這種新型膠原蛋白活性肽完全沒有毒副作用，具有顯著的抗疲勞活性。
文檔編號A61P43/00GK101234126SQ200710171188
公開日2008年8月6日 申請日期2007年11月28日 優先權日2007年11月28日
發明者湯魯宏, 張本田, 姜瑞霞 申請人:張麗麗, 江南大學