變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法
2023-07-29 09:46:06 2
專利名稱:變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法
技術領域:
本發明涉及一種凝膠電泳條帶,尤其是涉及一種用於多次變性梯度凝膠電泳(DGGE) 條帶浸出液的PCR產物直接測序的DGGE條帶直接測序的系統優化方法。
背景技術:
DGGE條帶浸出液的PCR產物如果直接送測序, 一般80 90 %均出現雙峰,所以以往 對條帶浸出液的PCR產物的測序都是經過連接轉化到E.coli ToplO感受態細胞中,然後挑選 克隆子送測序([l]楊桂梅,唐文喬,李會榮等.利用PCR-DGGE法分析暗紋東方飩的弧菌菌 落組成.上海水產大學學報.2006, 15 (3)257-263; [2]Zhi-Yong Li, Li-Ming He, Jie Wu, et al. Bacterial community diversity associated with four marine sponges from the south China Sea based on 16S rDNA隱DGGE fingerprinting. Jounal of Experimental Marine Biology and Ecology. 2006, (329): 75-85),該方法存在以下缺點 一是費用高,需要連接轉化試劑盒和感受態等費用;二 是比較繁瑣;三是可能測到其它雜帶的序列。為了避免測到其它雜帶,通常再進行一次DGGE 確認與原條帶具有相同的遷移距離([3]劉敏,朱開玲,李洪波等.應用PCR-DGGE技術分析 黃海冷水團海域的細菌群落組成.環境科學.2008,9 (4): 1002-1091)。也有少數的學者將條 帶的PCR產物經二次DGGE後直接測序([4]Hendrik Schafer, Laetitia Bernard, Claude Courties, et al. Microbial community dynamics in Mediterranean nutrient-enriched seawater mesocosms: changes in the genetic diversity of bacterial populations. FEMS Microbiology Ecology. 2001, (34): 243-253; [5]Maria Befring Hovda, Bj0rn Tore Lunestad, Morten Sivertsvik, et al. Characterisation of the bacterial flora of modified atmosphere packaged farmed Atlantic cod (Gadus morhua) by PCR-DGGE of conserved 16S rRNA gene regions. International Journal of Food Microbiology, 2007 (117) :68-75)。但未見報導採用多種具體的優化方法純化條帶,並減少大量的相同遷移 距離的條帶的測序工作。
發明內容
本發明的目的在於針對現有DGGE條帶的DNA片段測序存在的問題,提供一種DGGE 條帶直接測序的系統優化方法。本方法採用多種方法優化後使DGGE條帶得到純化,其條帶 浸出液的PCR產物經回收純化後即可用於直接測序;同時,還可以確認具有相同遷移距離的條帶,有效地減少測序工作量。 本發明包括以下步驟
1) 建立對照圖譜先將每張DGGE圖譜的條帶最多、最具代表性的樣品集中重做1次 DGGE,建立對照圖譜,其中的條帶可以作為不同圖譜之間的對照條帶,便於確定不同圖譜 間可能相同的條帶;
2) 二次DGGE:將一次DGGE條帶浸出液的PCR產物重新進行二次DGGE,確認二次 DGGE的條帶的遷移距離與一次DGGE的條帶相同,才可以用於後續的測序工作;
3) 多個樣品混合上樣如果對DGGE條帶進行再次DGGE,可以在同一孔中加入多個 樣品的混合樣,所述混合樣為DGGE條帶浸出液PCR產物的混合樣,每個混合樣的PCR產 物可以是1 8個樣品,每個混合樣中的條帶距離儘量較大,且能確定其上下位置;
4) 減小變性劑濃度梯度進行再次DGGE時,將變性劑的濃度梯度減小到第一次DGGE 的濃度梯度的1/3 1/2;
5) 確定相同條帶為了減少測序的數量,在進行再次DGGE時將可能處於相同遷移距 離的條帶集中在相鄰或距離較近的孔中,經再次的DGGE後,確認若具有相同的遷移距離, 則取其中的一個條帶進行後續的測序,減少其它的條帶測序的工作量,不同圖譜間可能相同 的遷移距離的條帶按步驟l)進行比對確定;
6) 使用標識樣(Marker):將已經有測序結果的樣品混合加到同一個孔中,組成Marker, 再次DGGE結果如果與Marker中條帶有相同遷移距離的可以認為它們是相同的條帶,不用 進行後續的條帶裁切和測序等工作;
.7)錯開緊鄰的條帶為了把一次DGGE圖譜中緊靠的條帶分開,二次DGGE時可將同 一個樣品中緊鄰的條帶分別放在相鄰的不同的孔中;
8)再次DGGE:經過二次DGGE後,大部分的條帶均可以滿足後續的測序需求,但如 果二次DGGE的條帶出現以下3種情況,應當進行再次DGGE:
① 二次DGGE圖譜中條帶很淡,其浸出液進行PCR時加入3 4 pi的模板量,但PCR 產物回收後送測序往往會出現雙峰,這種情況不直接送測序,可以將其PCR產物進行再次 DGGE,得到明亮清晰的條帶,並將雜帶分開;或繼續使用一次DGGE條帶浸出液的PCR產 物,上樣量增加到8 10nl;或調整一次DGGE條帶浸出液的模板量重新進行PCR,其PCR 產物進行再次DGGE,直至獲得單一清晰的條帶,再次DGGE的條帶浸出液的PCR回收產 物方可送測序;
② 二次DGGE條帶附近雜帶距離較近,其浸出液的PCR產物回收樣測序測序結果大多較差,目的條帶與附近的雜帶距離大於2 mm方可進行後續的測序工作,否則,應當使用步 驟3)的減小變性劑濃度梯度;或使用替代條帶經過多次DGGE後鄰近條帶仍然很難分開 的,可以再次DGGE實驗時尋找與之遷移距離可能相同且單一的條帶進行比對,若遷移距離 確實相同,則可用單一的條帶替代測序;
③二次DGGE消失的條帶,再次DGGE時增加上樣量或調整一次DGGE條帶浸出液的 模板量重新進行PCR。
在步驟2)中,所述PCR產物可以是直接的PCR產物或回收純化後的產物。
在步驟3)中,所述樣品最好為3 4個。
在步驟4)中,所述變性劑可為甲醯胺或尿素,經再次DGGE後可以有效地擴大相鄰條 帶的間距,減少相鄰條帶之間的影響,減少測序結果出現雙峰的概率和減小雜峰的影響。 本發明具有以下突出優點
1) 純化條帶,改善條帶PCR回收產物的測序效果。若挑選比較單一,與鄰近條帶距離 較大的一次DGGE條帶的PCR回收產物直接送測序,則結果只有18.2 % (n=22)有測序結 果,其它大部分為雙峰。而經過本發明上述方法純化後的二次或再次DGGE條帶PCR回收 產物88.4% (n=277)獲得較好的測序結果。
2) 減少相同條帶的測序費用。對8張一次DGGE圖譜上裁切的404條條帶,經過上述 方法優化後的二次或再次DGGE條帶的測序數量為277條,其中包括由於測序結果為雙峰或 無信號進行重新優化後的重複測序部分,即使這樣,也減少了31%的測序費用。
圖1為環境樣的DGGE條帶。
圖2為二次DGGE的目的條帶(打孔)及其它新增的雜帶。 圖3為集中不同圖譜中多條帶樣品的對照圖譜。
圖4為調整變性劑濃度梯度後的二次DGGE條帶(右)與調整前條帶(左),左圖為一 次DGGE條帶(梯度40% 55%),右圖為二次DGGE條帶(梯度40% 45%)。 圖5為二次DGGE後相同遷移距離的條帶(淡的為雜帶)。
圖6為與標識樣Marker中條帶遷移距離相同的條帶。在圖6中,Ml為標識樣Marker 1, M2為標識樣Marker 2。
圖7為二次DGGE錯開的條帶。在圖7中,左圖為一次DGGE條帶,右圖為二次DGGE 條帶。
具體實施方式
環境樣PCR產物經回收純化後的DGGE圖譜中一般會出現許多條帶,且彼此間靠得很 近,如圖1所示,條帶浸出液PCR產物經回收純化後一般無法直接送測序。
再次DGGE通過改變變性劑的濃度梯度,可以把PCR產物中的雜帶分開,如圖2所示, 有打孔標記的是目的條帶,其它未標記的均是再次DGGE後分出的雜帶,如果不進行再次 DGGE,直接送測序,很多結果必然是雙峰。
因此,將DGGE條帶浸出液的PCR產物重新進行DGGE,使產物中的雜帶得到進一步 的分離,從而得到單一的條帶,確保其浸出液的PCR回收產物能夠測序。同B寸,再次DGGE 可以確認具有相同遷移距離的條帶,避免重複測序,減少測序費用。
再次DGGE的實驗方法與第一次DGGE —樣。樣品為DGGE條帶浸出液的PCR產物, 上樣量一般是每個樣品5 8 pl。 6x Laoding Buffer的體積為樣品體積的1/3 1/2。
對於準備測序的條帶,則將目的條帶切下,放入1.5ml離心管中,隨即用刀片在管中將 條帶切為2 3段,加入30 50 pl的無菌Milli-Q水,4 °〇放置24 h後,根據DGGE圖譜中 條帶的亮度選擇加入1 4 nl的條帶浸出液為模板,進行PCR實驗。
以下給出具體的優化方法。
(1) 建立對照圖譜。先將每張DGGE圖譜的條帶最多,最具代表性的樣品集中重做1 次DGGE,建立對照圖譜,如圖3所示,其中的條帶可以作為不同圖譜之間的對照條帶,便 於確定不同圖譜間可能相同的條帶。
(2) 二次DGGE。將一次DGGE條帶浸出液的PCR產物重新進行二次DGGE,確認二 次DGGE的條帶的遷移距離與一次DGGE的條帶相同,才可以用於後續的測序工作。PCR 產物不用回收純化,可以直接上樣,這樣可以減少回收試劑盒的用量和工作量,並不影響 DGGE和後續測序的效果,但雜帶可能會比較多,背景也比較亮。如果要得到更好的效果, 可以將PCR產物純化後上樣。
(3) 多個樣品混合上樣。如果再次DGGE的樣品數量比較多,在同一孔中一般可以混 合3 4個樣品,這樣,每批實驗可以上約40個樣品,可以有效地提高工作效率。當幾個樣 品混合加到同一孔中,原則上選擇它們之間的條帶距離儘量較大,且應當注意條帶之間的上 下關係,避免混淆。再次DGGE可能出現新的條帶,也可能使原有的條帶消失,這時必須根 據同一孔中原來條帶之間的相對距離和相鄰孔中的條帶的相對位置進行判定,避免誤判造成 錯誤。
(4) 減小變性劑濃度梯度。為了減輕鄰近雜帶的影響,可以減小變性劑(甲醯胺和尿素) 的濃度梯度,如將變性劑的濃度梯度由原來的15%減小到5%,經再次DGGE後可以可以擴
7大相鄰條帶的間距,有效地減少相鄰條帶之間的影響,減少測序結果出現雙峰的概率。如圖 4所示,第一次DGGE相鄰的2個條帶的浸出液的PCR產物雖然分別放入相鄰的2個孔中, 但這2個孔均出現相同的2個條帶,說明這2個條帶浸出液的PCR產物均受到相鄰條帶的影 響,如果直接回收純化後送測序都將出現雙峰,但經過調整變性劑濃度梯度後,再次DGGE, 使條帶分得更開,其條帶浸出液的PCR產物回收純化後均可以得到滿意的測序結果。
(5) 確定相同條帶。為了減少測序的數量,可以在進行再次DGGE時將可能處於相同 遷移距離的條帶集中在相鄰或距離較近的孔中,經再次的DGGE後,確認如果是具有相同的 遷移距離,則取其中的一個條帶進行後續的測序就可以,減少其它的條帶測序的工作量。不 同圖譜間可能相同的遷移距離的條帶按步驟(1)進行比對。如圖5所示,有2組條帶為相同 的遷移距離,這樣,切下其中有打圓孔標記的條帶就可以,測序的工作量也可以減少一半。
(6) 使用Marker。可以將已經有測序結果的樣品混合加到同一個孔中,組成Marker, 再次DGGE結果如果與Marker中條帶在相同遷移距離的就可以不用再測序。如圖6中方框 中的條帶,與Marker中條帶的遷移距離相同,可以不用進行後續的條帶裁切和測序等工作。 Marker中樣品的選擇應當根據該批待分析的樣品確定,即在原來的DGGE圖譜和對照圖譜中 尋找可能與待分析樣品條帶遷移距離相同的樣品組成Marker。 Marker中樣品的條帶相互距離 不宜太近,且相互間的上下位置可以確認。每個Marker中的樣品數量可以較多, 一般5 10 個,每個樣品的上樣量4 5pl即可。
(7) 錯開緊鄰的條帶。為了把一次DGGE圖譜中同一樣品緊鄰的條帶分開,二次DGGE 時可以把它們放在相鄰的不同的孔中,避免放在同一孔中互相影響。如圖7所示, 一次DGGE 相鄰的3個條帶二次DGGE時分別放到相鄰的3個孔中(同時減小變性劑梯度),避免了相 互影響,且能根據相對位置相互確認。
(8) 再次DGGE。經過二次DGGE後,大部分的條帶均可以滿足後續的測序需求。但 如果二次DGGE的條帶出現以下3種情況,應當進行再次DGGE。①二次DGGE圖譜中條 帶很淡。其浸出液進行PCR時一般加入3 4pl的模板量,但PCR產物回收後送測序往往會 出現雙峰,這種情況不宜直接送測序。可以將其PCR產物進行再次DGGE,得到明亮清晰的 條帶,並將雜帶分開;也可以繼續使用一次DGGE條帶浸出液的PCR產物,上樣量增加到8 10 還可以調整一次DGGE條帶浸出液的模板量重新進行PCR,其PCR產物進行再次 DGGE,直至獲得單一清晰的條帶。再次DGGE的條帶浸出液的PCR回收產物方可送測序, 這樣才能得到好的結果。②二次DGGE條帶附近雜帶距離較近。其浸出液的PCR產物回收 樣測序測序結果大多較差, 一般目的條帶與附近的雜帶距離大於2 mm方可進行後續的測序
8工作。解決這個問題一般是使用方法(3)的減小變性劑濃度梯度或方法(9)使用替代條帶。 ③二次DGGE消失的條帶。再次DGGE時增加上樣量或調整一次DGGE條帶浸出液的模板 量重新進行PCR。
(9)使用替代條帶。經過多次DGGE後鄰近條帶仍然很難分開的,可以再次DGGE實 驗時尋找與之遷移距離可能相同且單一的條帶進行比對,若遷移距離確實相同,則可用單一 的條帶替代測序。如圖5右側的那組條帶,有"A"標記的條帶受雜帶影響,測序的結果一般 較差,右側的條帶單一,可以作為替代條帶進行測序。
補充說明經過二次DGGE後,大部分的條帶均可以滿足後續的測序需求,但也可能出 現部分條帶較淡,或者鄰近的雜帶距離較近,必須進行三次甚至四次DGGE才能滿足測序的 需求。也有的條帶由於濃度梯度調整不合適或其它原因消失了,必須進行適當的調整後再次 DGGE。
權利要求
1. 變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法,其特徵在於包括以下步驟1)建立對照圖譜先將每張DGGE圖譜的條帶最多、最具代表性的樣品集中重做1次DGGE,建立對照圖譜,其中的條帶可以作為不同圖譜之間的對照條帶,便於確定不同圖譜間可能相同的條帶;2)二次DGGE將一次DGGE條帶浸出液的PCR產物重新進行二次DGGE,確認二次DGGE的條帶的遷移距離與一次DGGE的條帶相同,才可以用於後續的測序工作;3)多個樣品混合上樣如果對DGGE條帶進行再次DGGE,可以在同一孔中加入多個樣品的混合樣,所述混合樣為DGGE條帶浸出液PCR產物的混合樣,每個混合樣的PCR產物可以是1~8個樣品,每個混合樣中的條帶距離儘量較大,且能確定其上下位置;4)減小變性劑濃度梯度進行再次DGGE時,將變性劑的濃度梯度減小到第一次DGGE的濃度梯度的1/3~1/2;5)確定相同條帶為了減少測序的數量,在進行再次DGGE時將可能處於相同遷移距離的條帶集中在相鄰或距離較近的孔中,經再次的DGGE後,確認若具有相同的遷移距離,則取其中的一個條帶進行後續的測序,減少其它的條帶測序的工作量,不同圖譜間可能相同的遷移距離的條帶按步驟1)進行比對確定;6)使用標識樣將已經有測序結果的樣品混合加到同一個孔中,組成Marker,再次DGGE結果如果與Marker中條帶有相同遷移距離的可以認為它們是相同的條帶,不用進行後續的條帶裁切和測序等工作;7)錯開緊鄰的條帶為了把一次DGGE圖譜中緊靠的條帶分開,二次DGGE時可將同一個樣品中緊鄰的條帶分別放在相鄰的不同的孔中;8)再次DGGE經過二次DGGE後,大部分的條帶均可以滿足後續的測序需求,但如果二次DGGE的條帶出現以下3種情況,應當進行再次DGGE①二次DGGE圖譜中條帶很淡,其浸出液進行PCR時加入3~4μl的模板量,但PCR產物回收後送測序往往會出現雙峰,這種情況不直接送測序,可以將其PCR產物進行再次DGGE,得到明亮清晰的條帶,並將雜帶分開;或繼續使用一次DGGE條帶浸出液的PCR產物,上樣量增加到8~10μl;或調整一次DGGE條帶浸出液的模板量重新進行PCR,其PCR產物進行再次DGGE,直至獲得單一清晰的條帶,再次DGGE的條帶浸出液的PCR回收產物方可送測序;②二次DGGE條帶附近雜帶距離較近,其浸出液的PCR產物回收樣測序測序結果大多較差,目的條帶與附近的雜帶距離大於2mm方可進行後續的測序工作,否則,應當使用步驟3)的減小變性劑濃度梯度;或使用替代條帶經過多次DGGE後鄰近條帶仍然很難分開的,可以再次DGGE實驗時尋找與之遷移距離可能相同且單一的條帶進行比對,若遷移距離確實相同,則可用單一的條帶替代測序;③二次DGGE消失的條帶,再次DGGE時增加上樣量或調整一次DGGE條帶浸出液的模板量重新進行PCR。
2. 如權利要求1所述的變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法,其特徵在於在步驟2)中,所述PCR產物為直接的PCR產物或回收純化後的產物。
3. 如權利要求1所述的變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法,其特徵在於在步驟3)中,所述樣品為3 4個。
4. 如權利要求1所述的變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法,其特徵在於在步驟4)中,所述變性劑為甲醯胺或尿素。
全文摘要
變性梯度凝膠電泳條帶直接測序的系統優化方法,涉及一種凝膠電泳條帶。提供一種DGGE條帶直接測序的系統優化方法。建立對照圖譜;二次DGGE;多個樣品混合上樣;減小變性劑濃度梯度;確定相同條帶;使用標識樣;錯開緊鄰的條帶;再次DGGE。其優點是純化條帶,改善條帶PCR回收產物的測序效果;減少相同條帶的測序費用。
文檔編號G01N27/447GK101477080SQ20091011085
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月9日 優先權日2009年1月9日
發明者湯坤賢, 焦念志 申請人:廈門大學;東山縣生態環境科學研究所