一種RNAi載體及其應用的製作方法
2023-07-21 04:16:36
專利名稱：一種RNAi載體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及載體及其應用，特別是涉及一種RNAi載體及其在製備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應用。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference，RNAi)是一種在小雙鏈RNA(dsRNA)的介導下降解同源基因的現象。長的dsRNA被加工成21-23nt並包含2個nt懸掛結構的短幹擾RNA(siRNA)。siRNA可以和RNA誘導的沉默複合體(RNA induced silencing complex，RISC)結合，續而經過一系列反應，最終沉默特定的內源基因。由於RNAi具有特異性強、沉默效率高的特點，故而被廣泛運用在沉默特定基因上。近些年來，很多基於RNAi的方法被發明出來，特別是利用RNAi沉默特定的癌基因，以便進行基因功能的研究或腫瘤的基因治療。
最初直接使用dsRNA進行基因沉默。雖然雙鏈RNA可以達到不錯的沉默效果，但由於RNA酶廣泛存在於自然界和生物體內，雙鏈RNA會迅速降解，因此無法實現腫瘤的基因治療的目的。舉例來說，在小鼠體內，dsRNA的半衰期大約僅僅只有10秒，所以為了讓藥物到達靶點，必須採用高壓注射的方法，使藥物在短時間內迅速流過整個循環系統。由於人的血容量比小鼠大的多，為了將藥物運送至靶點所需要的壓力更高，超出了人類循環系統所能負擔的極限，因而直接使用dsRNA製備基因沉默藥物是不可行的。同時，由於dsRNA在體內不能自動合成，所以必須定期給藥以便達到長時間的抑制效果，而人工合成dsRNA比較昂貴，因此也將影響直接用dsRNA製備基因治療藥物的前景。
近些年來，為了克服上述困難，基於載體質粒的RNAi技術被發明出來，即將siRNA對應的cDNA插入到載體質粒中，通過轉染的方式將重組質粒導入細胞。在特定啟動子的幫助下，細胞將cDNA轉錄成siRNA，此後繼續進行正常的RNAi過程。由於DNA比RNA更難被降解，同時質粒在細胞內可以自我複製，從而降低了給藥的數量，難度和間隔，並且合成DNA的費用比合成RNA的要低的多，相對於基於dsRNA的藥物具有天然優勢。載體質粒最重要的成分就是採用的啟動子，它直接決定了siRNA的產率，從而決定了沉默效率。目前載體質粒廣泛使用的有pSUPER，pSilencer，pSHAG等，使用的啟動子一般包含U6，H1。最常用的U6和H1啟動子具有結構簡單，轉錄起點明確等優點，但這兩種啟動子的轉錄效率在不同的細胞中，甚至同一細胞不同的靶基因中相差很大，甚至在有些細胞中幾乎不能實現轉錄，同時對於siRNA的序列要求也比較嚴格，從而導致很多情況下靶基因的沉默效果不如人意。
POKEMON，又稱為LRF、OCZF或FBI-1，是POK蛋白家族的一個成員，在細胞分化中起重要作用，被稱為是癌症基因的總開關，是ARF的特異性抑制子，因此被認為是癌症基因治療的一個重要靶點。
發明內容
本發明的目的是提供一種可高效、特異抑制靶基因表達的RNAi載體。
本發明所提供的RNAi載體，是在含有多克隆的載體骨架中，含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體，所述CMV增強子在載體中位於tRNAlys啟動子的上遊；所述CMV增強子的GenBank號為AF239249，tRNAlys啟動子的GenBank號為140508。
所述載體中還可包含有PBR322複製起點和氨苄青黴素抗性基因等其它核苷酸序列。
以pCMV5為出發載體，構建的含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體為pExsiler。
上述含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體均可按照基因工程領域的常規方法構建，其中pExsiler的構建方法可包括以下步驟1)以pCMV5質粒載體為模版，在由序列表中序列1和序列2組成的引物對的引導下PCR擴增含有CMV增強子的DNA片段；2)以Hela細胞基因組DNA為模版，在由序列表中序列3和序列4組成的引物對的引導下PCR擴增人源tRNAlys啟動子；3)將步驟1)擴增的DNA片段與步驟2)擴增的人源tRNAlys啟動子連接，得到RNAi載體pExsiler。
本發明提供了一種RNAi載體。該載體是利用CMV增強子和tRNAlys啟動子構建的RNAi載體。實驗證明，在本發明的RNAi載體中tRNAlys啟動子的下遊插入針對靶基因siRNA的編碼DNA後，該載體就可以在轉染細胞中高效、特異地抑制靶基因的表達，因此，可用本發明的RNAi載體製備成抑制靶基因(包括癌基因、轉錄因子基因和生長因子基因等基因，例如POKEMON基因等)表達的基因治療性藥物。本發明將生物醫藥領域及基因功能的研究中發揮重要作用，應用前景廣闊。
下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為載體pCMV5的結構示意2為構建本發明RNAi載體pExsiler及用該載體構建目的基因RNAi載體的流程3為抑制POKEMON基因表達的小幹擾RNA編碼基因的結構示意4為用pExsiler為出發載體構建的含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體的結構示意5A為pExsiler-2T對POKEMON基因表達的抑制效果圖5B為pExsiler-2對POKEMON基因表達的抑制效果圖5C為tRNAlys-2T對POKEMON基因表達的抑制效果圖5D為U6-2T對POKEMON基因表達的抑制效果圖5E為pExsiler空載體對POKEMON基因表達的抑制效果具體實施方式
下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
實施例1、RNAi載體pExsiler的構建用下述方法構建本發明含有CMV增強子及人源tRNAlys啟動子的RNAi載體pExsiler，具體過程包括以下步驟一、CMV增強子的克隆如圖1所示，載體pCMV5(GenBank號AF239249)包含pBR322複製起點，氨苄青黴素抗性基團和CMV增強子，因此，用TE將pCMV5質粒稀釋到1ng/μl作為模版，在引物MRV15』-GTGGATATCGGGGCGGGGTTATTACGAC-3』(序列表中序列1)(帶下劃線鹼基為限制性內切酶EcoR V識別位點，)和MRV25』-CGACTCTAGAGGATCCCGGGTG-3』(序列表中序列2)(帶下劃線鹼基為限制性內切酶BamH I識別位點，)的引導下PCR擴增CMV增強子(見圖1，克隆CMV增強子時，從PCR引物位點2開始，依次通過PBR322複製起點，氨苄青黴素抗性基團，0點，最終到達PCR引物位點1，得到產物)，PCR反應體系為14.5μl ddH2O，5μl MRV1(4μm/μl)，5μl MRV2(4μm/μl)，5μl質粒模版(1ng/μl)，5μl dNTPs(各2.5mM)，10μl 5×Primer STARTM緩衝液(含Mg2+)，5μl DMSO(上海生工)，0.5μl PrimerSTARTM HS DNA Polymerase(2.5U/μl，TAKaRa)；PCR反應條件為98℃10秒，64℃10秒，72℃2分30秒，共28個循環。反應結束後，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了500bp的DNA片段，與預期結果相符，然後對其進行測序，測序結果表明獲得序列正確的CMV增強子(序列兩端分別添加限制性內切酶EcoR V和BamH I識別位點)。使用H.Q..Q.凝膠回收試劑盒II(安徽優晶生物有限公司)並參照試劑盒說明書回收PCR擴增的目的片段，將回收產物用限制性內切酶EcoR V和BamH I(均購自TaKaRa)進行雙酶切，酶切反應體系為60μl PCR產物，EcoRV 0.5μl，BamH I 0.5μl，10×緩衝液K 2.5μl。在37℃下反應3小時後，用H.Q..Q.凝膠回收試劑盒II回收經EcoR V利BamH I酶切的CMV增強子片段(命名為CMV(BEv))，最終得到產物60μl，濃度為80ng/μl。
二、人源tRNAlys啟動子的克隆1、製備Hela細胞人類基因組DNA將Hela細胞培養於添加有10％FBS(Hyclone)的DMEM培養基(Invitrogen)中，用蛋白酶和苯酚從細胞中分離基因組DNA(具體步驟詳見分子克隆實驗指南第三版463至470頁)，最終用TE稀釋至10ng/μl。
2、人源tRNAlys啟動子的PCR擴增以Hela細胞基因組DNA為模版，在引物Lys15』-GATGATATCTGGGCCACTAGGGACTGGG-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶EcoR V識別位點)(序列表中序列3)和Lys25』-GTCGGATCCAAGCTTGAATTCGGGCCCAGTCTGATGCTCTACCGACTG-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶EcoR V識別位點)(序列表中序列4)的引導下，PCR擴增人源tRNAlys啟動子，並在序列兩端分別添加限制性內切酶EcoR V和BamH I識別位點，PCR反應體系為5μl Hela細胞基因組DNA(10ng/μl)，5μl Lys1(4μm/μl)，5μl Lys3(4μm/μl)，5μl dNTPs(各2.5mM)，10μl 5×Primer STARTM緩衝液(含Mg2+)，19.5μlddH2O，0.5μl PrimerSTARTMHS DNA Polymerase(2.5U/μl)；PCR反應條件為98℃10秒，60℃10秒，72℃20秒，共35個循環。反應結束後，對PCR擴增產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果獲得了380bp的DNA片段，與預期結果相符，然後對其進行測序，測序結果表明獲得序列正確的人源tRNAlys啟動子(序列兩端分別添加限制性內切酶EcoR V和BamH I識別位點)。使用H.Q..Q.凝膠回收試劑盒II並參照試劑盒說明書回收PCR擴增的目的片段，將回收產物用限制性內切酶EcoR V和BamH I(均購自TaKaRa)進行雙酶切，酶切反應體系為21.5μl PCR產物(93ng/μl)，EcoR V 0.5μl，BamH I 0.5μl，10×緩衝液K 2.5μl。在37℃下反應3小時後，用H.Q..Q.凝膠回收試劑盒II回收經EcoR V和BamH I酶切的人源tRNAlys啟動子片段，命名為tRNAlys(BEv)。
三、RNAi載體pExsiler的獲得將步驟一經EcoR V和BamH I酶切的CMV增強子片段和步驟二獲得的經相同酶雙酶切的人源tRNAlys啟動子片段連接，連接反應體系及反應條件為2μl CMV(BEv)，3μl tRNAlys(BEv)，ddH2O 11μl，60℃4分鐘，冰浴2分鐘，再加入2μl 10×T4 ligasebuffer，1μl T4 DNA ligase(TaKaRa)，1μl ATP(50mM)，16℃反應4小時。反應結束後，將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加50mg/mL氨苄青黴素的LB抗性平板上在37℃下培養過夜(12-24小時)，挑取長出的單菌落接種於3mL含50mg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中搖菌過夜。培養結束後，取1.5mL菌液，小量提質粒(具體步驟見分子克隆實驗指南第三版27頁至30頁)，用進行初步鑑定，酶切體系為5μl質粒(0.2μg/μl)，1μl 10×緩衝液K，ddH2O3.8μl，EcoRV 0.2μl。對酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後EB染色，未被切成線性的環狀質粒即為陽性克隆。這是因為EcoR V和EcoRI的酶切位點均為平末端，進行連接後兩個酶切位點均消失；如果是重組質粒，由於不存在酶切位點，則EcoRV不能將其線性化，而非重組質粒存在EcoRV位點，因此可以被EcoRV線性化。取200μl經初步鑑定正確的陽性重組菌的菌液接種入100mL LB液體培養基中繼續培養12小時。培養結束後，取1mL菌液送上海Invitrogen公司進行測序，測序結果表明獲得了序列正確的含有CMV增強子及人源tRNAlys啟動子的RNAi載體，命名為pExsiler，其構建過程見圖2中的步驟①-③。
實施例2、檢測用本發明載體pExsiler為出發載體構建的含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體對靶基因的抑制效果一、用本發明載體pExsiler為出發載體構建含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體在使用含有CMV5增強子的pExsiler時，先針對靶基因上一段長度為21-29nt的核苷酸序列設計併合成一對具有反向重複序列的互補脫氧寡核苷酸鏈作為siRNA的模版，其中將正義序列置於反義序列之前，中間用一段無意義且不形成二級結構的寡核苷酸鏈隔開，經過退火後插入pExsiler載體中，然後將重組載體(結構示意圖見圖4)轉染細胞，載體上的人源tRNAlys啟動子以其下遊插入片段為模版，合成具有髮夾結構的siRNA，從而導致靶基因沉默。以POKEMON基因為例，檢測用本發明RNAi載體pExsiler構建的含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的對靶基因的抑制效果，具體方法包括以下步驟(流程圖見圖2中的步驟③-⑥)1、抑制POKEMON基因表達的小幹擾RNA及其編碼基因的獲得根據POKEMON基因mRNA(GenBank號GI117647237)序列及http://www.takara-bio.co.jp/sirna/prectl_new.php設計合成2對寡核苷酸(即4條寡核苷酸，F2T和R2T互補，F2和R2T互補)，序列的5』段添加限制性內切酶ApaI識別位點，3』端添加6個「T」作為轉錄終止信號，最後在轉錄終止信號後加入可以和Hind III互補的序列，其結構示意圖見圖3(實際上每段序列中並不存在空格，空格是為了閱讀方便而添加的)，具體序列如下(斜體部分鹼基序列為針對POKEMON基因mRNA的靶序列)F2T(正義鏈)5』-CCGGCTTAGACTTCTATGGGTTCAAGAGACCCATAGAAGTCTAAGCCGTTTTTT-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶ApaI識別位點)R2T(反義鏈)5』-CCGGGGCCGAATCTGAAGATACCCAAGTTCTCTGGGTATCTTCAGATTCGGCAAAAAATCGA-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Hind III互補序列)；F2(正義鏈)5』-CCGGCTTAGGACTTCTATGGGTTCAAGAGACCCATAGAAGTCTAAGCCGTTTTTT-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Apa I識別位點)R2(反義鏈)5』-CCGGGGCCGAATCCTGAAGATACCCAAGTTCTCTGGGTATCTTCAGATTCGGCAAAAAATCGA-3』(帶下劃線鹼基為限制性內切酶Hind III互補序列)。
F2，R2比F2T，R2T各多了一個鹼基，作為實驗的陰性對照，以便證明本發明的RNAi載體對於基因沉默具有高度的專一性，同時，每對序列均引入限制性內切酶Apa I和Hind III互補序列，以便同線性化的RNAi載體質粒連接。由上海Invitrogen公司合成上述4條單鏈寡核苷酸片段，然後按照以下方法將正義鏈同反義鏈退火用TE溶解、稀釋合成片段，將濃度定位1μm/μl，然後將單鏈磷酸化，反應體系為30μl H2O，10μl 10×T4PNK buffer，50μl 1μM單鏈DNA(F2、R2、F2T或R2T)，10μl 50mM ATP，0.2μl T4PNK(TaKaRa)，將反應後的單鏈DNA按等比例兩兩對應混合(即F2同R2一組，F2T同R2T一組)，94℃3分鐘，80℃20秒，75℃20秒，72℃20秒，65℃20秒，60℃20秒，55℃20秒，50℃20秒，45℃20秒，40℃20秒，35℃20秒，自然冷卻到室溫，-20℃保存，並將F2和R2的退火產物記為2，將F2T和R2T的退火產物記為2T。
2、含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體的獲得將質粒載體pExsiler用限制性內切酶Apa I和Hind III進行雙酶切使其線性化，然後將步驟1合成的兩對雙鏈DNA片段與線性化的質粒載體pExsiler連接，將連接產物轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，將轉化細胞塗布於添加50mg/mL氨苄青黴素的LB抗性平板上在37℃下培養過夜(12-24小時)，挑取長出的單菌落接種於3mL含50mg/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中搖菌過夜。培養結束後，取1.5mL菌液，小量提質粒，用進行初步鑑定，酶切體系為5μl質粒(0.2μg/μl)，1μl 10×緩衝液K，ddH2O 3.8μl，Hind III 0.2μl。對酶切產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳後EB染色，末被切成線性的環狀質粒即為陽性克隆。這是因為Hind III的酶切位點為平末端，連接後酶切位點消失；如果是重組質粒，由於不存在酶切位點，則Hind III不能將其線性化，而非重組質粒存在Hind III位點，因此可以被Hind III線性化。取200μl經初步鑑定正確的陽性重組菌的菌液接種入100mL LB液體培養基中繼續培養12小時。培養結束後，取1mL菌液送上海Invitrogen公司進行測序，測序結果表明獲得了序列及插入位置正確的攜帶有雙鏈DNA片段2的重組RNAi載體(命名為pExsiler-2，結構示意圖見圖4)，以及攜帶有雙鏈DNA片段2T的重組載體(命名為pExsiler-2T，結構示意圖見圖4)。同時，將對照載體pBS/U6(該質粒的構建方法請叄考文獻Sui G，Soohoo C，Affar el B，Gay F，Shi Y，Forrester WC，Shi Y.A DNA vector-based RNAi technology tosuppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA.2002Apr 16；99(8)5515-20.)和pEx-tRNAlys(與pExsiler質粒相比，pEx-tRNAlys質粒不含CMV增強子，僅有tRNAlys啟動子)也分別用限制性內切酶Apa I和HindIII進行雙酶切使其線性化，然後將步驟1合成的雙鏈DNA片段2T與線性化的質粒載體連接，得到序列及插入位置正確的攜帶有雙鏈DNA片段2T的重組載體，分別命名為U6-2T和tRNAlys-2T。
二、檢測用本發明載體pExsiler為出發載體構建的含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體對靶基因的抑制效果1、構建攜帶POKEMON-GFP融合基因的真核表達載體將POKEMON基因的cDNA(GenBank117107)克隆入載體pEGFP-N2(購自BDBiosciences Clontech公司)的多克隆位點處的Hind III和Sma I酶切位點之間，得到攜帶POKEMON-GFP融合基因的真核表達載體，命名為pPOKEMON-GFP。經測序驗證，插入序列及位置完全正確。
2、檢測用本發明載體pExsiler為出發載體構建的含有靶基因小幹擾RNA編碼序列的重組RNAi載體對靶基因的抑制效果以2×105細胞密度在24孔板上鋪MCF7細胞，24小時後進行轉染，方法為在lipotamine2000(Invitrogen)介導下，將帶有綠色螢光標記的真核表達載體pPOKEMON-GFP分別和幹擾載體pExsiler-2T，pExsiler-2，tRNAlys-2T，U6-2T和空白載體pExsiler各400ng共轉染MCF7細胞。其中POKEMON-GFP是POKEMON和綠色螢光蛋白GFP的融合蛋白，當細胞表達POKEMON時，也同時會表達綠色螢光蛋白GFP。通過螢光顯微鏡就可以看到螢光，從而觀察到POKEMON表達狀況。轉染結束24小時後在螢光顯微鏡下觀察轉染細胞的螢光強度。
結果如圖5A-圖5E所示(放大倍數40×)，pPOKEMON-GFP質粒和pExsiler共轉染細胞(見圖5E)可以看見較強的綠色螢光，表明POKEMON基因的表達水平較高，而pPOKEMON-GFP質粒和pExsiler-2T的共轉染細胞(見圖5A)只能看到很弱的綠色螢光，表明POKEMON基因的表達受到顯著抑制。同時，只擁有U6啟動子的幹擾質粒和pPOKEMON-GFP質粒共轉染細胞(見圖5D)和只擁有tRNAlys啟動子的幹擾質粒和pPOKEMON-GFP質粒共轉染細胞(見圖5C)均發出較高強度的綠色螢光，證明本發明的RNAi幹擾質粒具有較強的靶基因抑制效應。此外，pPOKEMON-GFP質粒和pExsiler-2質粒共轉染細胞(見圖5B)可以看到相對於pPOKEMON-GFP質粒和pExsiler共轉染細胞更強的綠色螢光，由於pExsiler-2僅比pExsiler-2T多了一個鹼基，這就證明了本發明的RNAi幹擾載體還具有高度的專一抑制性。
序列表1604210121128212DNA213人工序列220
230
4001gtggatatcg gggcggggtt attacgac210221122212DNA213人工序列220
230
4002cgactctaga ggatcccggg tg210321127212DNA213人工序列
220
230
4003gatgatatct ggccactagg gactggg210421148212DNA213人工序列220
230
4004gtcggatcca agcttgaatt cgggcccagt ctgatgctct accgactg
權利要求
1.一種RNAi載體，是在含有多克隆位點的載體骨架中，含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體，所述CMV增強子在載體中位於tRNAlys啟動子的上遊；所述CMV增強子的GenBank號為2828971，tRNAlys啟動子的GenBank號為140508。
2.根據權利要求1所述的RNAi載體，其特徵在於用於構建所述含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體的出發載體為pCMV5。
3.根據權利要求2所述的RNAi載體，其特徵在於所述載體中還包含有PBR322複製起點和氨苄青黴素抗性基因。
4.根據權利要求3所述的RNAi載體，其特徵在於所述含有CMV增強子和tRNAlys啟動子的重組載體為pExsiler。
5.一種構建權利要求4所述的RNAi載體的方法，包括以下步驟1)以pCMV5質粒載體為模版，在由序列表中序列1和序列2組成的引物對的引導下PCR擴增含有CMV增強子的DNA片段；2)以Hela細胞基因組DNA為模版，在由序列表中序列3和序列4組成的引物對的引導下PCR擴增人源tRNAlys啟動子；3)將步驟1)擴增的DNA片段與步驟2)擴增的人源tRNAlys啟動子連接，得到RNAi載體pExsiler。
6.權利要求1或2或3或4所述的RNAi載體在製備抑制靶基因表達的基因治療性藥物中的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特徵在於所述靶基因為癌基因、轉錄因子基因或生長因子基因。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於所述靶基因為POKEMON基因。
全文摘要
本發明公開了一種RNAi載體及其應用。該載體是在含有多克隆位點的載體骨架中，含有CMV增強子和tRNA
文檔編號A61K48/00GK101058819SQ20071006410
公開日2007年10月24日 申請日期2007年2月28日 優先權日2007年2月28日
發明者蔣宇揚, 謝振華, 馬偉偉, 李文鵬 申請人:清華大學深圳研究生院