基於scar分子標記快速檢測溶藻弧菌的pcr特異擴增引物及檢測試劑盒的製作方法

2023-07-20 23:59:16

專利名稱：基於scar分子標記快速檢測溶藻弧菌的pcr特異擴增引物及檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測海水養殖動物病原菌的PCR特異擴增引物及檢測試劑盒，尤 其是一種檢測準確性及靈敏性高、時間短、成本低的基於SCAR (Sequence characterized amplified region，特徵性序列擴增區域)分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增引 物及檢測試劑盒。
背景技術：
弧菌是海水養殖動物主要的條件致病菌，其中病原性弧菌能使養殖動物暴發性死 亡，與病毒、其他細菌或寄生蟲等一起將會對海水養殖動物造成巨大的損害，被公認為是海 水養殖中最為嚴重的病害之一。如溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)可導致魚、蝦、貝、海 參等養殖動物大規模死亡，也給誤食感染了溶藻弧菌食物的人類健康帶來隱患。目前，對 弧菌的檢測方法有生理生化鑑定技術、酶聯免疫吸附試驗、16S rRNA基因鑑定等，分別存在 如下不足生理生化鑑定技術耗時費力，檢測的準確率低；酶聯免疫吸附試驗敏感性不高； 16S rRNA基因鑑定只能將致病弧菌鑑定到屬，而無法鑑定到種。

發明內容
本發明是針對現有技術所存在的上述技術問題，提供一種檢測準確性及靈敏性 高、時間短、成本低的基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增引物及檢測試劑盒。本發明的技術解決方案是一種基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異 擴增引物，其特徵在於上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF 5 『 -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 『；下遊引物VaR 5 『 -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 『。—種基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的檢測試劑盒，其特徵在於包含如下 試劑試劑I 用滅菌雙蒸水溶解的PCR特異擴增上遊引物VaF和下遊引 物VaR的混合液，濃度為0. 5-2 μ M，上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF 5' -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3『；下遊引物 VaR:5' -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3『；試劑II :dNTPs四種脫氧核苷酸的混合液，濃度為50 500 μ M ；試劑III :10XPCR 緩衝液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 和 16mM 二硫蘇糖醇；試劑IV =Taq DNA聚合酶，濃度為5U/μ 1 ；試劑V:滅菌雙蒸水；試劑VI 作為陽性模板的溶藻弧菌的總DNA，濃度為50ng/y 1 ；試劑VII 含有IX上樣緩衝液的DL2000DNA分子量，濃度為50ng/y 1。
本發明是利用RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增多態性 DNA) 技術在各種弧菌中進行分析，發現了溶藻弧菌的差異特異性DNA片段，將差異特異性DNA片 段回收測序，然後再根據測得的序列設計及合成了用於檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增上下 遊引物、檢測試劑盒，可用培養的弧菌菌落直接做PCR反應進行檢測，無需提取弧菌基因組 DNA，省時省力、簡便、快速、準確、特異性好、靈敏度高。可用於海水養殖動物養殖過程中溶 藻弧菌的跟蹤檢測及海水環境監測，具有很高的實用價值。


圖1是用本發明實施例檢測患腹水病的牙鮃肝臟病灶的結果示意圖。
具體實施例方式本發明實施例是利用200多條RAPD引物在溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) (ATCC 17749)、創傷弧菌(Vibrio vulnificus) (ATCC 27562)、副溶血弧菌 (Vibrioparahaemolyticus) (ATCC 17802)、河弧菌(Vibrio fluvialis) (ATCC 33810)、最 小弧菌(Vibrio mimicus) (ATCC 33653)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi) (ATCC33842)、坎氏弧 菌(Vibrio campbellii) (ATCC 33864)和鯊魚弧菌(Vibriocarchariae) (ATCC 35084)等 弧菌上開發並轉化為溶藻弧菌的種屬特異性SCAR標記，其核苷酸序列為GAGAAGCGGGTGCATTGAACGCTGAACTGGTCGTGATATAAGGAGTTAAGGATGAAGCTAGACAGTACC AATGAACAAGCTCAGTTAAATTCGATGCTTTATCACGACAATAGTGCATTGGCTAACATCAAGCATAGTCGTGATCA AGAAGGCGCACTTGAAGTCGTCGCAGGTCAATTTGAGGCAATGTTCCTACAAATGGTGTTACGCCAAATGCGCAGCA GTAGTGATGCTCTTGCTGATAAAGACAACCCGTTCGCCAGTCAGCAACAAGGGGTATTCCGTGATATGTATGACGGT CAGCTGGCGATGGAATTAGCAAAGAAACAGAGCTCAGGCATTGCCAATATGCTCATCCAGCAGCTGAGCCCGTCTAT GCGTGAGGTTGCTTTCGATGCTGCGCGCAACATCTCATCCGCTAACGATGGTAAAGCTTCGAATTCTGAATCTATCT CACAAGTAGATTCTAAAGAGGTGGAGAAGAATTCAAGCC。本發明實施例是根據上述特異性SCAR標記，設計併合成了快速檢測溶藻弧菌的 PCR特異擴增引物，其特徵在於上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF 5 『 -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 『；下遊引物VaR :5, -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 『。本發明所設計的檢測試劑盒含有如下試劑試劑I 用滅菌雙蒸水溶解的PCR特異擴增上遊引物 VaF (5 『 -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 『)和下遊弓丨物 VaR (5 『 -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 『)的混合液，濃度為0.5-2μΜ;試劑II :dNTPs四種脫氧核苷酸的混合液，濃度為50 500 μ M ；試劑III :10XPCR 緩衝液:500mM KCl.pH 8. 4 的 IOOmM Tris-HClU5mM MgCl2 禾口 16mM 二硫蘇糖醇(DTT)；試劑IV =Taq DNA聚合酶，濃度為5U/ μ 1 ；試劑V 滅菌雙蒸水(ddH20)；試劑VI 作為陽性模板的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) (ATCC 17749)的總 DNA，濃度為 50ng/ μ 1 ；
4
試劑VII 含有IX上樣緩衝液的DL2000 DNA分子量，濃度為50ng/y 1。用本發明實施例檢測患腹水病的牙鮃肝臟病灶致病性溶藻弧菌，按下述步驟進 行(1)在超淨工作檯上用接菌環刮取患腹水病的牙鮃肝臟病灶，在2216E培養基 上劃線接菌，28°C培養10 12小時，當細菌菌落的直徑在1 1. 5mm左右時可直接用於 SCAR-PCR 反應；(2)在 200 μ 1 PCR 反應管中放 1μ 1試劑 Ι、2μ 1 試劑 ΙΙ、2· 5μ 1試劑 ΙΙΙ、0· 5μ 1 試劑IV及19 μ 1試劑V，充分混勻；(3)用無菌牙籤在2216Ε平板上隨機挑取單菌落，再將單菌落置於上述PCR反應管 中，用作細菌總DNA模版；(4)然後將PCR管放在熱循環儀上進行擴增反應，反應的條件為94°C預變性5分 鍾，然後進行如下25個循環94°C變性30秒，58°C退火25秒，72°C延伸25秒；最後72°C延 伸7分鐘，4°C保存；做檢測樣品；(5)在 200 μ 1 PCR 反應管中放 1μ 1試劑 Ι、2μ 1 試劑 ΙΙ、2· 5μ 1試劑 ΙΙΙ、0· 5μ 1 試劑IV及19 μ 1試劑V，充分混勻，然後將PCR管放在熱循環儀上進行擴增反應，反應的條 件為94°C預變性5分鐘，然後進行如下25個循環94°C變性30秒，58°C退火25秒，72°C延 伸25秒；最後72°C延伸7分鐘，4°C保存；做陰性對照；(6)在 200 μ 1 PCR 反應管中放 1μ 1試劑 Ι、2μ 1 試劑 ΙΙ、2· 5μ 1試劑 ΙΙΙ、0· 5μ 1 試劑IV、18 μ 1試劑V及1 μ 1試劑VI，充分混勻；然後將PCR管放在熱循環儀上進行擴增 反應，反應的條件為94°C預變性5分鐘，然後進行如下25個循環94°C變性30秒，58°C退 火25秒，72°C延伸25秒；最後72°C延伸7分鐘，4°C保存；做陽性對照；(7)分別取步驟(4)、(5)、(6)和試劑VII 3-5 μ 1經1 %瓊脂糖凝膠電泳25-35分 鍾後於紫外儀上觀察，若在493bp處出現明亮的DNA條帶，則為溶藻弧菌陽性；若無反應條 帶顯示，則為陰性。實際檢測結果如圖1所示，圖中M :DL2000 DNA分子量(試劑VII) ;1 溶藻弧菌 陽性對照(用試劑VI作DNA模版的SCAR-PCR結果)；2 溶藻弧菌陰性對照(用試劑V的 SCAR-PCR結果)；3 檢測樣品(用培養的細菌菌落做SCAR-PCR結果)。結果表明所檢測患腹水病的牙鮃肝臟中有溶藻弧菌。
序列表
大連水產學院
基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增引物及檢測試
劑盒
2
PatentIn Version 3. 1
1
20
DNA
人工序列

misc_feature 引物1gagaagcggg tgcattgaac20222DNA人工序列misc 一 feature 引物2ggcttgaatt cttctccacc tc22
權利要求
一種基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增引物，其特徵在於上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF5′ GAGAAGCGGGTGCATTGAAC 3′；下遊引物VaR5′ GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC 3′。
2.一種基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的檢測試劑盒，其特徵在於包含如下試劑試劑I 用滅菌雙蒸水溶解的PCR特異擴增上遊引物VaF和下遊引物VaR 的混合液，濃度為0. 5-2 uM,上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF 5 『 -GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3 『；下遊引物 VaR 5 『 -GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3 『； 試劑II :dNTPs四種脫氧核苷酸的混合液，濃度為50 500 ii M ； 試劑 III :10XPCR 緩衝液:500mM KCl、pH 8. 4 的 100mM Tris-HCl、15mM MgCl2 禾口 16mM 二硫蘇糖醇；試劑IV :Taq DNA聚合酶，濃度為5U/yl ； 試劑V:滅菌雙蒸水；試劑VI 作為陽性模板的溶藻弧菌的總DNA，濃度為50ng/ia ； 試劑VII 含有IX上樣緩衝液的DL2000DNA分子量，濃度為50ng/ia。
全文摘要
本發明公開了一種基於SCAR分子標記快速檢測溶藻弧菌的PCR特異擴增引物及檢測試劑盒。上、下遊引物的核苷酸序列為上遊引物VaF5′-GAGAAGCGGGTGCATTGAAC-3′；下遊引物VaR5′-GGCTTGAATTCTTCTCCACCTC-3′。試劑盒中包括用滅菌雙蒸水溶解的PCR特異擴增上遊引物VaF和下遊引物VaR的混合液，濃度為0.5-2μM。可用培養的弧菌菌落直接做PCR反應進行檢測，無需提取弧菌基因組DNA，省時省力、簡便、快速、準確、特異性好、靈敏度高。該試劑盒可用於海水養殖動物養殖過程中溶藻弧菌的跟蹤檢測及海水環境監測，具有很高的實用價值。
文檔編號C12N15/11GK101928769SQ20091018771
公開日2010年12月29日 申請日期2009年9月29日 優先權日2009年9月29日
發明者仇雪梅, 常亞青, 王秀利, 田春雨 申請人:大連水產學院