P0基因沉默構建體和應用的製作方法

2023-07-20 22:11:06 2

P0基因沉默構建體和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種在細胞中轉錄時能夠形成雙鏈自身互補RNA序列的重組BMYV?P0病毒核苷酸序列。
【專利說明】PO基因沉默構建體和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及用於在植物中，尤其是在糖用甜菜植物中傳遞對一種或多種病毒，尤其是對甜菜輕型黃化病毒(BMYV)和對甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)或僅對BMYV的病毒抗性或耐受性的方法。此外，本發明涉及根據這種方法獲得的抗病毒或耐受病毒的植物，以及涉及由其衍生的種子和後代。 [0002]本發明還涉及基因沉默構建體，尤其是介導BMYV，或BMYV和BNYVV RNA沉默的髮夾構建體和它們的應用。
【背景技術】
[0003]對於許多主要農作物植物病毒是嚴重的問題，因為病毒感染引起極大的收穫損失。
[0004]在糖用甜菜中，主要病因有:(i)由其主要載體桃姆(Myzus persicae)以持久性方式傳播的馬鈴薯卷葉病毒屬(polerovirus)、甜菜輕型黃化病毒(BMYV)引起的黃化；(ii)由通過多粘菌姆傳播(Polymyxa betae)的甜菜壞死黃脈病毒屬(benyvirus)、甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)引起的糖用甜菜叢根病。抗BNYVV抗性的廣泛使用使得能夠保持產量，然而，正在出現破壞抗性的病毒分離株，因此迫切需要新的抗性變體。
[0005]一旦土地受到感染，真菌傳播的病毒，如BNYVV可以在土壤中以休眠孢子保持數年。由於在植物中或在土壤中還沒有用於消除這種病毒的有效的化學或物理方法，對於糖用甜菜菜農來說唯一的選擇是使用遺傳性抗病品種。幾家公司已經通過育種提供了多種耐受性的，甚至部分抗性的變種。然而，這是一個非常繁瑣和耗時的過程，通常需要很長的時間才能獲得有用的抗性植物。
[0006]植物工程領域的快速變革已經引發了新策略的開發以賦予對病毒的遺傳抗性。通過引入部分病毒基因組序列而由此將病毒序列(構建體)轉化到植物細胞和植物中的對病毒性疾病抗性，已經成為抗性的新來源。
[0007]糖用甜菜被稱為基因工程中的頑固物種，使可能的成功誘導病毒抗性變得複雜化。
[0008]已經公開了工程耐受性的幾個實例，例如，通過在糖用甜菜基因組中轉化和表達BNYVV衣殼蛋白序列(W091/13159)，儘管對整個功能性轉基因糖用甜菜植物的報導來說這僅是很少的數據，如公開於EP1169463B1中的那些。具體而言，這些報導顯示，關於在感染的病狀中觀察到的用編碼BNYVV衣殼蛋白序列的基因轉化的轉基因糖用甜菜植物的抗性水平的數據有限。
[0009]甜菜壞死黃脈病毒(BNYVV)的基因組由五個正義RNA組成，其中的兩個(RNA1和RNA2)編碼對感染所有植物至關重要的功能，而其他三個(RNA3、RNA4和RNA5)涉及糖用甜菜(甜菜)根的載體介導的感染。由RNA2上稱之為三基因連鎖(TGB)的一組三個連續的稍微重疊的病毒基因決定BNYVV的細胞至細胞之間的移動，這三個基因依次編碼病毒蛋白P42，P13和P15 (基因產物由其以千道爾頓計而計算的Mr命名)。[0010]BMYV的基因組由具有六個主要的開放閱讀框(0RF0-5)的線性正義RNA組成。ORFl和0RF2編碼涉及病毒複製的蛋白質，而其他3個ORF (0RF3、0RF4和0RF5)每一個編碼結構蛋白(主要和次要的衣殼蛋白)和推定的運動蛋白(putative movement protein)進行。
[0011]已經證明BMYV的PO蛋白具有較差的表達，這是POAUG不利起始密碼子背景和維持低表達的強烈傾向的後果。此外，這部分的基因組是高度可變的，而已經探索研究此序列多樣性用於區分不同的種。
[0012]已經證明由BNYVV所致的疾病能夠地域性地擴張，其速度取決於許多當地環境和農業要素的組合。因此，有必要改進遺傳抗性的機制，這可能，單獨或組合地，賦予工業用途種植的糖用甜菜植物以穩定而持久的抗性。
[0013]現有技術的狀態
[0014]專利申請W02007/128755公開了一種TGB-3序列，其用於降低和/或抑制植物中野生型TGB-3的有害作用，以產生抗病毒性轉基因植物，尤其是糖用甜菜對甜菜壞死黃脈病毒的抗性。
[0015]Carmen Simon-Mateo et al.,Biochimica et.,Biophysica Acta，1809Νο.11-12，722-731,2011公開了最近25年內用於獲得病毒抗性植物的抗病毒策略。
[0016]A.Kozlowska-Makulska et al., Journal of General Virology Vol.91, N0.4,1082-1091,2010公開了來自甜菜感染馬鈴薯卷葉病毒屬甜菜褪綠黃化病毒和甜菜輕型黃化病毒的不同分離株的PO蛋白的RNA沉默抑制物活性。
[0017]Pu Yan et al.Journal of Virological Methods Vol.166, N0.1-2,pagesl01-105,2010公 開了 RNA沉默構建體來通過表達病毒衍生的髮夾RNA開發病毒抗性植物。

【發明內容】

[0018]本發明提供了在植物細胞或植物中，具體而言在糖用甜菜植物細胞或在糖用甜菜植物(可能由這些植物細胞產生)中賦予不表現出現有技術狀態的缺點的病毒耐受性或抗性的方法和手段，優選賦予耐受性、抗性，優選極度抗性或完全抗性，尤其是BMYV (甜菜輕型黃化病毒)病毒耐受性或抗性(包括極度BMYV抗性或完全BMYV抗性)或優選綜合的BMYV(甜菜輕型黃化病毒)和BNYVV (甜菜壞死黃脈病毒)耐受性或抗性(包括極度BMYV和BNYVV抗性或完全BMYV和BNYVV抗性)的方法和手段。
[0019]本發明進一步提供了如此可獲得的、或由此方法獲得並可以生長成表現出對以上提及的植物病毒增加的耐受性或抗性的植物的基因修飾或轉化的植物細胞。
[0020]本發明還提供了源自這種轉化的植物或植物細胞的後代，即病毒耐受性或病毒抗性後代、種子或其他可再生器官或結構。
[0021]本發明第一方面是一種包含具有從BMYV基因組的PO基因(或由編碼BO蛋白的基因)或從直系同源基因推導的序列的正義區段序列和反義區段序列的RNA構建體，其中所述正義區段和所述反義區段序列都包含具有與來自BMYV基因組或直系同源基因的PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0022]優選地，在此RNA構建體中正義區段和/或反義區段序列進一步包含具有與緊鄰PO基因核苷酸序列的5』 -端非翻譯序列(5』 UTR)共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0023]更優選在此RNA構建體中，正義區段和反義區段序列包含具有與來自BMYV基因組的PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0024]有利地，在此RNA構建體中，正義區段和反義區段序列進一步包含具有與BMYV基因組的PI基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
[0025]可能的是，在這些RNA構建體中，正義區段包含或由序列SEQ.1D.NO:1組成和/或反義區段包含或由序列SEQ.1D.NO:3組成。
[0026]有利的是，在這些RNA構建體中，正義區段和反義區段序列進一步都包含與BNYVV基因組共有至少85%的序列同一性的核苷酸片段。
[0027]本發明的一個相關方面是可轉錄成此(這些)RNA構建體的DNA構建體。
[0028]另一個相關方面是包含這些(DNA)核酸構建體的核苷酸序列的載體。
[0029]另一個相關方面是由這些DNA構建體或載體表達的雙鏈自身互補的RNA分子。
[0030]本發明還涉及用於在植物或植物細胞中誘導對至少BMYV病毒和可能的其他病毒耐受性或抗性、優選完全抗性的方法，所述方法包括以下步驟:製備本發明的核酸構建體(例如，包含由PO基因推導的和/或BMYV基因組的序列)，可操作地連接至一個或多個植物或植物細胞中有活性的調 控序列，和用核酸構建體轉化植物細胞，由此在植物或植物細胞中誘導對至少BMYV病毒的抗性。
[0031]有利的是，這種方法進一步誘導對另一種病毒的耐受性，這種病毒選自由以下組成的組:蕪菁黃化病毒、南瓜蚜傳黃化病毒、馬鈴薯卷葉病毒、甘蔗黃葉病毒、豌豆耳突花葉病毒、甜菜西部黃化病毒-USA、甜菜褪綠病毒、穀物黃矮病毒和BNYVV病毒，優選BNYVV病毒。
[0032]一個相關方面是用於誘導對至少BMYV病毒的耐受性的方法，包括以下步驟:製備一種包含由BNYVV核苷酸序列推導的，優選由編碼所述BNYVV的P15蛋白的基因推導的正義和反義區段的核酸構建體。
[0033]又一個相關方面是包含由PO基因推導的和/或BMYV基因組的序列和/或本發明的RNA、DNA或載體的序列的核苷酸序列用於在植物或植物細胞中誘導對BMYV病毒和/或對BNYVV病毒耐受性或抗性、優選完全抗性的應用。
[0034]另一個方面是對至少BMYV病毒和可能的一種或多種其他病毒具有耐受性或抗性的、優選完全抗性的轉基因植物或轉基因植物細胞，並且該轉基因植物或轉基因植物細胞包含能夠表達可操作地連接至一個或多個植物或植物細胞中有活性的調控序列的本發明的核苷酸序列(包含由PO基因和/或由BMYV基因組推導的序列)的核酸構建體、包含本發明的載體、或包含本發明的雙鏈自身互補RNA分子。
[0035]優選地，這種轉基因植物或轉基因植物細胞對其他選自由以下組成的組中的病毒具有抗性:蕪菁黃化病毒、南瓜蚜傳黃化病毒、馬鈴薯卷葉病毒、甘蔗黃葉病毒、豌豆耳突花葉病毒、甜菜西部黃化病毒-USA、甜菜褪綠病毒、穀物黃矮病毒和BNYVV病毒，優選BNYVV病毒。
[0036]優選地，這種轉基因植物或轉基因植物細胞選自由生菜、黃瓜、馬鈴薯、甘蔗、豌豆、大麥和糖用甜菜組成的組中，優選糖用甜菜或糖用甜菜細胞。
[0037]—個相關方面是衍生自(根據本發明的)這種轉基因植物細胞的轉基因植物組織和/或可再生結構，其中所述組織選自由果實、莖、根、塊莖和種子組成的組或其中所述可再生結構選自由傷愈組織、芽或胚組成的組中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1A和圖1B不出根據本發明的病毒PO序列的片段(圖1A和圖1B ；SEQ.1D.NO: 13)，其中，用1352bp的矮牽牛內含子(下劃線粗體，SEQ.1D.NO: 11)插入正義PO核苷酸序列(SEQ.1D.0:1，短於完整的PO序列SEQ ID NO:17)和相應的同源反義PO核苷酸序列(粗體，SEQ.1D.NO: 3)間。圖1B中以粗體斜體表示幾個核苷酸。它們對應於病毒BMYV基因組的5』UTR。在圖1B中以斜體和下劃線表示的其他幾個核苷酸不屬於PO也不屬於內含子，但仍然存在，因為這些是克隆策略的殘餘物。包含完整髮夾(SEQ.1D.NO: 13)的構建體也被稱為hpPO構建體I。 [0039]圖2 (A和B)示出根據本發明的病毒PO序列的另一個片段(圖2A和圖2B ;SEQ.1D.NO: 14)，其中，用91bp的甜菜內含子序列(下劃線粗體，SEQ.1D.NO: 12)插入正義PO核苷酸序列和反義PO核苷酸序列(粗體)間。圖2B中以粗斜體表示幾個核苷酸。它們對應於病毒BMYV基因組的5』 UTR0圖2B中以斜體和下劃線表示的其他幾個核苷酸，既不屬於PO，也不屬於內含子，仍然存在，因為這些都是克隆策略的殘餘物。此處的正義和反義PO核苷酸序列與圖1B中給出那些相同。包含完整髮夾(SEQ.1D.0:14)的構建體也被稱為hpPO構建體2。
[0040]圖3突出了 SEQ.1D.NO:1的5』 -端與由SEQ ID NO: 17表示的POBMYV編碼序列的5』 -端相比的差異。圖3中帶下劃線的序列對應於SEQ.1D.NO:1的非功能性5』 -前導序列。
[0041]圖4 (A和B)是pFGC5941載體的示意圖，將以下引入其中:將PO基因的片段按照正義(SEQ.1D.N0:1)和反義(SEQ.1D.N0:3)的方向、由矮牽牛的查耳酮合成酶A基因的內含子序列(CHSA ；SEQ.1D.NO: 11)插入其間(圖 4A，pFGC5941，構建體 I ；SEQ.1D.NO: 13)，或由91nt的甜菜內含子序列(SEQ.1D.NO: 12)插入其間(圖4B, pFGC5941，構建體2 ；SEQ.1D.NO: 14)。CaMV35S啟動子:CaMV的啟動子35S ;0CS3』:章魚鹼合成酶基因的多聚腺苷酸化信號；MAS啟動子:甘露鹼合成酶基因的啟動子；MAS3』:甘露鹼合成酶基因的多聚腺苷酸化信號；BAR:巴斯塔(Basta)除草劑(草丁膦)抗性基因；pVSl:pVSl的複製起點；NPTI1:卡那黴素抗性基因；LB、RB:左和右T-DNA邊界。
[0042]圖5是用構建體I (具有矮牽牛內含子的hpPOu)獲得的抗性試驗的統計分析。每個直方圖代表具有10株BMYV接種的植物(Y)的標準誤差的平均BMYV滴定度。hp:髮夾；Inf:感染的。在Y軸上:通過ELISA0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2獲得的光密度(Α4(ι5)。在X軸上，從左至右為:轉基因系:hpP0-7、hpP0-8、hpP0-9、hpP0-10、hpP0-ll 和 hpPO-12 ；BMYV感染對照=ColOInf ；ColO健康。
[0043]圖6是用構建體2 (具有甜菜內含子的hpPOu)獲得的抗性試驗的統計分析。每個直方圖代表具有10株BMYV接種的植物的標準誤差(Y)的平均BMYV滴定度。hp:髮夾；hpPO:構建體I ；hpP0甜菜:構建體2 ；Inf:感染的。在Y軸上:通過ELISA0、0.5、1、1.5、2、
2.5、3獲得的光密度(A405)。在X軸上，從左至右為:轉基因系:hpP0_12 (構建體l)、hpP0甜菜-1 (構建體2)、hpP0甜菜-2、hpP0甜菜_3、hpP0甜菜_4、hpP0甜菜_5、hpP0甜菜-6、hpPO甜菜-7和hpPO甜菜-8 ；BMYV感染對照:Col0Inf ；Col0健康。[0044]圖7是分別用構建體I和構建體2獲得的抗性試驗的統計分析。每個柱狀圖代表具有10株接種植物的標準誤差(Y)的平均病毒滴定度。分別而言，暗灰色的柱狀圖代表由BMYV-EK克隆的感染而淺灰色柱狀圖代表由蚜蟲傳播的BMYV-2itb分離株的感染。hp:髮夾；hpP0:構建體I ;hpP0甜菜:構建體2 ；Inf:感染的。在Y軸上:通過ELISA0、0.5、1、1.5、2、2.5獲得的光密度(A405)。在X軸上，從左至右為:轉基因系:hpP0_9 (構建體I)、hpP0-10、hpPO-12、hpPO甜菜-2 (構建體2)、hpPO甜菜-7和hpPO甜菜_8 ;感染對照:ColOInf ；ColO 健康。
[0045]圖8 示出 WT PO 序列(SEQ.1D.0:17 和 18)。
[0046]圖9 (A和B)示出根據本發明的髮夾構建體hpP15A4_P0的序列(圖9A和圖9B，SEQ.1D.NO: 15)，該構建體用91bp的甜菜內含子序列(下劃線的粗體，SEQ.1D.NO: 12)插入正義P15A4-P0核苷酸序列(SEQ.1D.NO:7，斜體核苷酸用於P15A4序列，其中3個突變被加下劃線，並且正體核苷酸(usual nucleotides)用於PO序列；與WT P15相比:A被C替換而AG被GC替換。)和對應於反義P15A4-P0核苷酸序列的SEQ.1D.NO: 8 (粗斜體用於P15A4並且粗體用於PO)之間。以粗體斜體和下劃線表示圖9B中的一些核苷酸。這些對應於病毒BMYV基因組的5』 UTR0圖9B中仍然存在的加下劃線的其他幾個核苷酸既不屬於P15A4-P0也不屬於內含子，由於它們是克隆策略的殘餘物。包含完整髮夾的構建體(SEQ.1D.NO: 15)也被稱為hpP15A4-P0構建體I。
[0047]圖10 (A和B)代表根據本發明的髮夾構建體hpP0-P15A4_A和hpP0_P15A4_B的序列(圖1OA和圖10B, SEQ.10.唚:16)，用9訃?的甜菜內含子序列(下劃線的粗體，SEQ.1D.NO: 12)插入正義PO-P15A4核苷酸序列(SEQ.1D.NO:9，正體核苷酸用於PO序列並且斜體核苷酸用於P15A4序列，3個突變被加下劃線)和對應於反義P0-P15A4核苷酸序列的SEQ.1D.NO: 10。這兩個髮夾構建體之間的差異是在hpP0-P15A4 - B構建體的P15A4序列中存在兩個額外的核苷酸(加框的核苷酸)。圖1OB中的一些核苷酸以粗斜體表不並加下劃線。這些對應於病毒BMYV基因組的5』UTR。圖1OB中仍然存在加下劃線的其他幾個核苷酸，既不屬於P0-P15A4也不屬於內含子，由於它們是克隆策略的殘餘物。包含完整髮夾(SEQ.1D.NO: 16)的構建體也稱為hpP0-P15A4-A構建體2和hpP0_P15A4 - B構建體3。
[0048]圖11(A和B)是將P15A4-P0序列或P0-P15A4序列按照正義和反義方向引入其中的PFGC5941載體的圖示，由91nt的甜菜內含子序列(圖llA，pFGChpP15A4_P0，構建體1，而圖 llB，pFGChpP0-P15A4-A 和 pFGChpP0_P15A4_B，分別為構建體 2 和 3)插入其間。CaMV35S啟動子=CaMV的啟動子35S ;0CS3』:章魚鹼合成酶基因的多聚腺苷酸化信號；MAS啟動子:甘露鹼合成酶基因的啟動子；MAS3』:甘露鹼合成酶基因的多聚腺苷酸化信號；BAR:巴斯塔除草劑抗性基因；pVSl:pVSl的複製起點；NPTI1:卡那黴素抗性基因；LB，RB:左和右T-DNA邊界。
【具體實施方式】
[0049]考慮甜菜產區中兩種病毒的出現，本發明人已經開發出對一種或兩種(BMYV和/或BNYVV)病毒、或者甚至對能夠感染該相同植物的另外的病毒是抗性的轉基因植物。
[0050]事實上，BNYVV是主要關注的問題並且本發明人預期BMYV流行對種植也有風險。
[0051]本發明第一方面涉及一種RNA構建體(如髮夾RNA,優選下文中描述為hpPO),該載體包含具有由PO基因(或核苷酸序列)或由BMYV基因組的基因(編碼BO蛋白的核苷酸序列)或由直系同源基因推導(即，共有至少85%的序列同一性)的序列或具有由BMYV基因組推導的(即，共有至少85%的序列同一性)序列的正義(RNA)區段和反義(RNA)區段(兩者都)。
[0052]有利地，該(髮夾；hpP0)RNA構建體包含的正義(RNA)區段和反義(RNA)區段(兩者都)進一步包含由BMYV的5』 -非翻譯區(5』 -UTR)(緊鄰這個編碼BMYV的PO或直系同源基因的基因)推導(即，共有至少85%的序列同一性)的(RNA)(正義和/或反義)片段和/或該(髮夾)RNA構建體包含具有同時由該5』 -UTR的核苷酸片段和由BMYV的PO核苷酸序列或直系同源基因的(緊鄰)核苷酸片段推導的序列的正義RNA區段和反義RNA區段。
[0053]優選地，5』 -UTR和PO核苷酸序列的這些片段在所述BMYV基因組中是緊鄰的。
[0054]這種RNA髮夾，當包含5』 -UTR和PO的片段時，在本發明中優選稱之為hpPOu核苷酸序列。
[0055]可能地(但較不優選地),根據本發明的該(hpPO和/或hpPOu (RNA)髮夾)構建體不包含具有由其他病毒，如BNYVV基因組推導的序列的片段。
[0056]有利的是，根據本發明的這些RNA (髮夾；hpP0和/或hpPOu)構建體包含的正義RNA區段和反義RNA區段進一步具有(是片段)由BNYVV基因組推導的序列，優選來自BMYV基因組(緊鄰PO)除了 5』 -UTR序列外和/或這些RNA (髮夾；hpP0和/或hpPOu)構建體包含的正義RNA區段和反義RNA區段(包含具有由PO基因推導的序列的片段)都進一步包含與(一部分)BNYVV基因組共有至少85%序列同一性的核苷酸片段。
[0057]更優選地，這 種由BNYVV基因組推導的正義和反義RNA區段是對應於BNYVV基因組的(一部分)P15序列的正義和/或反義序列(當它是髮夾時，本文以下還稱之為hpP0-P15或hpP0u-P15，後者進一步包含由BMYV基因組的5』-UTR序列推導的核苷酸片段)。
[0058]有利的是，這種hpPO和/或hpPOu RNA (髮夾)構建體也包含具有由BMYV的Pl核苷酸序列推導的序列的正義和反義核苷酸(RNA)片段。
[0059]在本發明的上下文中，「直系同源基因」是指在不同物種中保留相同功能(例如，在進化的過程中)的基因。在表1中提供了 BMYV基因組的PO基因(或核苷酸序列)的直系同源基因的實例。
[0060]表1:確定的PO序列直系同源的非窮舉列表
[0061]
【權利要求】
1.一種RNA構建體，包含具有由BMYV基因組的PO基因或由直系同源基因推導的序列的正義區段序列和反義區段序列，其中，所述正義區段序列和所述反義區段序列都包含具有與來自BMYV基因組的PO基因(SEQ.1D.NO: 17)或直系同源基因具有至少85%的序列同一'I"生的序列的核苷酸片段。
2.根據權利要求1所述的RNA構建體，其中，所述正義區段和/或反義區段序列進一步包含具有與緊鄰來自所述BMYV基因組的PO基因核苷酸序列的5』 -端非翻譯序列(5』 UTR)共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
3.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述正義區段和反義區段序列包含具有與來自BMYV基因組的所述PO基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
4.根據權利要求3所述的RNA構建體，其中，所述正義區段和反義區段序列進一步包含具有與BMYV基因組的PI基因共有至少85%的序列同一性的序列的核苷酸片段。
5.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述正義區段包含所述序列SEQ.1D.NO:1或由所述序列SEQ.1D.NO:1組成和/或所述反義區段包含所述序列SEQ.1D.NO:3或由所述序列SEQ.1D.NO:3組成。
6.根據前述權利要求中任一項所述的RNA構建體，其中，所述正義區段和反義區段序列都進一步包含與所述BNYVV基因組共有至少85%的序列同一性的核苷酸片段並且優選其中所述正義區段包含SEQ.1D.NO:5的片段並且所述反義區段包含SEQ.1D.N0:6的片段。
7.根據前述權利要求中任一項所述的構建體，其中，所述一個或多個區段和所述一個或多個片段包含大於10個的核苷酸，優選15至25個核苷酸。
8.—種可轉錄成根據前述權利要求1至7中任一項所述的RNA構建體的DNA構建體。
9.一種包含根據前述權利要求1至8中任一項所述的核酸構建體的核苷酸序列的載體。
10.一種由根據權利要求8所述的DNA構建體或由根據權利要求9所述的載體表達的雙鏈自身互補RNA分子。
11.一種用於在植物或植物細胞中誘導耐受性或抗性的方法，優選對至少所述BMYV病毒和可能的另外病毒的完全抗性，所述方法包括以下步驟:製備根據前述權利要求1至9中任一項所述的核酸構建體，可操作地連接至在植物或植物細胞中有活性的一個或多個調控序列，以及用所述核酸構建體轉化所述植物細胞，由此在所述植物或所述植物細胞中誘導對至少所述BMYV病毒的抗性。
12.根據權利要求11所述的方法，其中，其他病毒選自由蕪菁黃化病毒、南瓜蚜傳黃化病毒、馬鈴薯卷葉病毒、甘蔗黃葉病毒、豌豆耳突花葉病毒、甜菜西部黃化病毒-USA、甜菜輕型黃化病毒、穀物黃矮病毒和BNYVV病毒組成的組，優選所述BNYVV病毒。
13.一種用於誘導對至少BMYV病毒的耐受性的方法，包括以下步驟:製備包含由BNYVV核苷酸序列推導的，優選由編碼所述BNYVV的P15蛋白的基因推導的正義區段和反義區段的核酸構建體。
14.一種對至少BMYV病毒和可能的一種或多種其他病毒具有耐受性或抗性的轉基因植物或轉基因植物細胞，優選是完全抗性的，並且所述轉基因植物或轉基因植物細胞包含能夠表達根據權利要求1至7中任一項所述的核苷酸序列的核酸構建體、優選包含可操作地連接至植物或植物細胞中有活性的一個或多個調控序列的根據權利要求8所述的DNA構建體、和/或包含根據權利要求9所述的載體、和/或包含根據權利要求10所述的雙鏈自身互補RNA分子。
15.根據權利要求14所述的轉基因植物或轉基因植物細胞，選自由生菜、黃瓜、馬鈴薯、甘蔗、豌豆、大麥和糖用甜菜組成的組中，優選糖用甜菜或糖用甜菜細胞。
16.一種源自根據權利要求14或15所述的轉基因植物細胞的轉基因植物組織和/或可再生結構，其中所述組織選自由果實、莖、根、塊莖和種子組成的組中或者其中所述可再生結構選自由傷愈組織、芽或胚組成的`組中。
【文檔編號】C12N15/82GK103635581SQ201280031063
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2012年6月15日 優先權日:2011年6月23日
【發明者】埃洛迭·克萊因, 韋羅妮克·格拉夫, 戴維·吉爾默, 韋羅妮克·布羅, 居伊·魏恩斯, 馬克·勒菲弗 申請人:西斯凡德爾哈維公眾公司