一種視黃醇檢測試劑盒及其製備方法
2023-07-21 05:28:26
專利名稱：一種視黃醇檢測試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體地說涉及一種檢測人視黃醇結合蛋白的檢測試劑盒。
背景技術：
視黃醇結合蛋白，是血漿中特異結合維生素A的結合蛋白，在維生素A的代謝中起重要作用。視黃醇結合蛋白的臨床檢測有助於肝炎、糖尿病早期診斷、腎臟疾病的診斷。 視黃醇結合蛋白主要由肝臟粗面內質網合成。廣泛分布於人體血清、尿液、腦脊液中。在血液中視黃醇結合蛋白以複合物形式存在。當肝細胞損傷時.視黃醇結合蛋白的合成受到抑制。由於視黃醇結合蛋白的半衰期為3 12小時。其相對分子量小，且與血清總膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間相關。所以它可敏感地反映肝功能的改變。同時急性病毒性肝炎患者血清視黃醇結合蛋白含量與AST、ALP、ALT負相關。故可說明血清視黃醇結合蛋白是反映肝細胞受損的靈敏指標。尿視黃醇結合蛋白是一種低分子蛋白，可在腎小球濾過膜自由濾過並絕大部分被腎近曲小管重吸收而分解代謝。正常情況下，尿視黃醇結合蛋白排泌量甚微，當腎近曲小管受損時，尿視黃醇結合蛋白排泌量明顯增加。因此測定尿視黃醇結合蛋白水平能更靈敏地反映腎小管的功能情況，且特異性較高。視黃醇結合蛋白本身具有很好的穩定性，在體內的含量相對恆定，一般情況下，正常人尿中視黃醇結合蛋白的含量極少，故有學者認為其在尿中的排洩量可作為腎小管功能受損的一個靈敏指標，能早期反映腎小管的損害問。研究表明，在糖尿病早期尚未發生腎小球功能障礙時，已存在腎小管的功能損傷。而在診斷糖尿病腎小管損害時，尿視黃醇結合蛋白可作為早期糖尿病腎病的一個更敏感的診斷指標。為早期糖尿病腎病的診斷提供依據。以使患者得到及時的診治，改善預後，提高生存質量。視黃醇結合蛋白測定方法很多，包括··( 一)放射免疫測定法(RIA)、(二)酶聯免疫測定法(ELISA)、(三)乳膠凝集試驗和免疫比濁法、(四)螢光免疫測定法、(五)滴金免疫法。這些方法具有操作繁瑣、耗時長、過度浪費資源的缺點，不適於常規檢驗。
發明內容
本發明的目的是提供一種視黃醇結合蛋白的檢測試劑盒。該試劑盒可直接應用於全自動生化分析儀上，結果準確性強、試劑穩定性好、使用方便、便於大規模推廣。本發明的另一目的是提供上述檢測試劑盒的生產製備及使用方法。為實現上述目的，本發明提供的試劑盒組成為
試劑Rl :緩衝液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；
試劑R2:緩衝液、結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。
本發明提供的上述試劑盒的製備方法及操做步驟如下
(a)按下列比例配製好試劑
試劑Rl
Tris 緩衝液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I,
疊氮鈉1-5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ;
試劑R2 · Tris 緩衝液 200-220mmol/L
結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 3.5-5% (v/v)
吐溫-20l-5mmol/L
疊氮鈉O. 5-3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l_5mmol/L
(b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應；
(c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值；
Cd)根據吸光度變化值計算出樣本中視黃醇結合蛋白的濃度。
具體實施例方式下述實施例是為了更詳細的解釋本發明，但不應理解為本發明局限於此。實施例I :
本發明的試劑盒舉例是雙試劑，其中
試劑Rl
Tris 緩衝液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol /I,
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩衝液 200mmol/L
結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v)
吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。實施例2 :試劑盒使用方法
I.試劑準備，試劑為液體雙試劑，開瓶即用，其中
試劑Rl Tris 緩衝液 200mmol/L 聚乙二醇8 mmol/L
疊氮鈉5 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L ;
試劑R2
Tris 緩衝液 200mmol/L
結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 5% (v/v) 吐溫 _20Smmol /I,
疊氮鈉3 mmol/L
乙二胺四乙酸鈉5mmol/L 牛血清白蛋白 5mmol/L。2.全自動生化儀參數設置
(a)檢測溫度37°C
(b)檢測波長主波長為340nm；
(c)反應時間10分鐘，其中，溫育時間5分鐘，反應時間5分鐘。3.檢測步驟(全部在全自動生化分析儀中完成)
(a)取200μ L試劑I和10 μ L血清樣本混勻；
(b)將混勻後的溶液在37°C溫育5分鐘，讀取吸光度值Al；
(c)再添加50μ L試劑2，反應5分鐘後，讀取吸光度值Α2 ；
(d)計算ΛΑ=Α2_Α1。4.通過Λ A計算出視黃醇結合蛋白的濃度。本發明具有的優點
該試劑盒結果準確性強、試劑穩定性好、使用方便、便於大規模推廣。所需檢測儀器(生化分析儀)在各大醫院和檢測中心普遍使用。
權利要求
1.一種視黃醇結合蛋白檢測試劑盒，其組成為試劑R1、試劑R2， 其中 a、試劑Rl 包括200-220mmol/L Tris 緩衝液、5-10 mmol/L 聚乙二醇、1_5 mmol/L 疊氮鈉、l-5mmol/L乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白； b、試劑R2200-220mmol/L Tris緩衝液、結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、l_5mmol/L 吐溫-20、O. 5-3 mmol/L疊氮鈉、l_5mmol/L 乙二胺四乙酸鈉、l_5mmol/L牛血清白蛋白。
2.權利要求I的試劑盒，其特徵在於試劑R2中的視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子的製備方法為10. 5mg/ml的視黃醇結合蛋白單克隆抗體與10%的乳膠顆粒(直徑50-100nm)，加入到200-220mmol/L Tris緩衝液中，震蕩反應4小時， 離心去上清，再用200_220mmol/L Tris緩衝液稀釋至O. 5%,並加入O. 1-0.3 mmol/L疊氮鈉。
3.上述試劑盒的製備和操作方法，主要步驟為 (a)按下列比例配製好試劑 試劑Rl Tris 緩衝液 200-220mmol/L 聚乙二醇5-10 mmol /I, 疊氮鈉1-5 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; 試劑R2 Tris 緩衝液 200-220mmol/L 結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子 3.5-5% (v/v) 吐溫-20l-5mmol/L 疊氮鈉0. 5-3 mmol/L 乙二胺四乙酸鈉l_5mmol/L 牛血清白蛋白 l-5mmol/L ; (b)將試劑與待測樣本按一定比例混合，使其完全反應； (c)用半/全自動生化分析儀測定吸光度變化值； Cd)根據吸光度變化值計算出樣本中視黃醇結合蛋白的濃度。
4.權利要求3的方法，其特徵在於，被測樣品與試劑比例應控制在I: 20到I :30之間。
5.權利要求3的方法，其特徵在於，反應溫度為37(±1) °C。
6.權利要求3的方法，其特徵在於，反應時間為8-12分鐘。
7.權利要求3的方法，其特徵在於，用半/全自動生化分析儀檢測的波長為340nm。
全文摘要
一種視黃醇結合蛋白的檢測試劑盒。試劑盒盒體內包括試劑R1緩衝液、聚乙二醇、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白；試劑R2緩衝液、結合有視黃醇結合蛋白單克隆抗體的乳膠粒子、吐溫-20、疊氮鈉、乙二胺四乙酸鈉、牛血清白蛋白。通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列反應，再將反應物置於半/全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度變化的速度，從而測算出視黃醇結合蛋白的濃度大小。本試劑盒具有準確、穩定、方便的優點。
文檔編號G01N33/68GK102841210SQ20121031284
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月30日 優先權日2012年8月30日
發明者謝兵 申請人:謝兵