洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表達的製作方法
2024-02-29 13:07:15
專利名稱：洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表達的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地說是一種洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因克隆及原核表達與應用。
背景技術：
洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)為菊科母菊屬的草本植物,全草芳香,含有揮發性芳香油。其揮髮油具有消炎、抑制真菌、解痙鎮靜、止痛及改善肺癌病人症狀等作用。其精油由於獨特的香氣和抗氧化作用而廣泛用於食品、飲料、菸草、日化、醫藥等領域中。是 集園林綠化、美化、香化、彩化於一身的很有市場潛力的農業產業結構調整的新品種。洋甘菊中有效成分主要集中在揮髮油中，花中揮髮油含量一般在O. 2%-0. 8%之間，最高可達1.9%。揮髮油呈暗藍色，芳香。揮髮油中主要成分有α —紅沒藥醇、母菊奧(I，4- 二甲基-7-乙基奧)等，均為倍半萜類物質。母菊奧為藍色粘稠液體，具有顯著地消炎作用，可治療支氣管哮喘、風溼病、過敏性胃炎，結腸炎溼疹等，有減輕過敏反應並有局部麻醉作用。由於母菊奧是洋甘菊精油中最具有價值的成分之一，歐洲各國常根據它在精油中的含量作為評定洋甘菊藥材質量的標準。洋甘菊精油中母菊奧含量因產地、生長條件的差異而變化很大，含量通常在0-18. 28%之間。母菊奧為倍半萜類物質，生物合成途徑屬於植物類異戊二烯代謝途徑，其中法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase，fps)是異戍二烯代謝途徑中一個重要的酶。它是一種異戊烯基轉移酶，催化由五碳原子的異戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)連續縮合反應，形成法呢基焦磷酸(FPP)。FPP是留體、皂甙、倍半萜等許多萜類衍生物的合成前體，這些物質在植物生長發育或抗病過程中具有重要作用。近年來，植物如擬南芥、白羽扇豆、青蒿、銀杏和棉花等中的FPS基因也已先後被分離克隆。但迄今為止，國內外尚未見有關洋甘菊萜類物質代謝合成途徑關鍵酶基因如FPS基因等研究報導。從不同物種中克隆分析FPS基因，深入研究其結構特徵、基因進化及其他生物學功能意義深遠。
發明內容
本發明的目的是提供一種洋甘菊法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因克隆及其原核表達，為FPS蛋白的進一步結構和功能的研究奠定基礎，已期通過對FPS基因的深入研究達到調控次生代謝產物的目的。本發明技術方案如下一種洋甘菊法呢基焦磷酸合酶，該酶的胺基酸序列如SEQ NO 2所示。一種編碼上述述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ NO I所
/Jn ο含有上述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因的表達載體，該表達載體的構建與表達方法，具體包括如下步驟
(I)以洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因單鏈cDNA為模板，以Pl和P2為擴增引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；所述引物為Pl :5，CATGCCATGGATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』P2 :5』 CGGGATCCCTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3』
所述擴增條件為採用25μ I反應體系，94°C預變性5min，94°C 30sec，55°C退火30sec, 72°C延伸lmin，共30個循環；(2)將步驟(I)中所得PCR擴增產物與pMD 19-T克隆載體16°C連接過夜，連接產物轉化至DH5a感受態菌株，37°C振蕩培養一小時，取適量培養液塗布於添加X- gal和IPTG的LB平板進行藍白斑篩選，挑取白斑菌落搖菌，進行序列分析，挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因(下稱FPS)的pMD 19-T重組質粒；(3)用限制性內切酶NcoI和BamHI對步驟(I) pMD 19_T重組質粒進行雙酶切，切膠純化回收FPS基因片段，同樣用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切pET_30a (+)空質粒，得到線性pET-30a(+)質粒；在？0 管中加入1.5μ I克隆載體雙酶切膠回收產物，6. 5μ I雙酶切pET-30a(+)質粒，I μ I 10ΧΤ4 DNA連接酶，I μ I Τ4 DNA連接酶緩衝液16°C連接過夜；將得到的FPS基因與pET-30a(+)質粒連接產物轉化至DH5 α感受態菌株，加入LB培養基搖菌一小時，塗板於含50 Kg/mL卡那黴素的LB培養基上篩選挑取單菌落,在加有50 Pg/mL卡那黴素的LB培養基搖菌5-6小時，並進行菌液PCR鑑定，提取質粒進行雙酶切驗證，篩選陽性重組克隆進行DNA測序；得到含有FPS基因重組質粒pET-30a(+)-FPS ；(4)提取DH5a中的重組質粒pET_30a (+)-FPS，轉化至表達菌株大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有50 Pg/mL Kan的LB培養基培養12小時，挑取陽性克隆於5ml含有50Pg/mL Kan液體培養基中，37°C振蕩培養5小時，進行PCR鑑定；同時測序。本發明克隆了 FPS基因，表明洋甘菊FPS基因ORF框為1032bp，序列比較做出進化樹，證明洋甘菊FPS基因與其他植物倍半萜合成酶基因具有較高的同源性。並構建原核表達載體pET-30a(+)/ FPS,誘導表達可溶性蛋白，進行Westerning驗證,得到分子量約為38KDa的目的蛋白，為下一步FPS蛋白純化及蛋白結構和特性的研究奠定基礎，進而為通過轉基因方法提高洋甘菊母菊奧產量提供依據。此外本發明對誘導表達蛋白的條件進行了優化，證明表達的融合蛋白以部分可溶的形式溶於大腸桿菌胞液中。當超聲處理在37°C誘導表達的蛋白時，處理上清有少量蛋白，大部分蛋白存在於沉澱裡，而28°C誘導時上清和沉澱含蛋白量差不多。當IPTG濃度為I.O mM誘導時，蛋白表達量隨誘導時間增加而增加，最佳誘導時間為6h。最佳誘導溫度為37°C。
圖I是洋甘菊總RNA電泳圖。圖2是洋甘菊FPS基因ORF框的PCR結果。 圖中M. DNA分子量標準I. PCR產物圖3質粒提取電泳圖？圖中M.Marker I. t 載體 2. pET_30a(+)圖4是重組質粒鑑定電泳圖。
圖中M.Marker I.重組質粒 2. pET_30a(+) 3. PCR 產物 4.t 質粒 5. DNAmarker 6. NcoI/BamHI雙酶切重組質粒圖5是不同誘導時間對pET_30a(+)/ FPS表達量影響圖中1.標準蛋白2.空質粒3. pET-30a(+)/ FPS未誘導4.誘導O. 5h 5.誘導Ih 6.誘導2h. 7.誘導3h 8.誘導4h. 9.誘導5h 10.誘導6h 11誘導7h圖6是不同IPTG濃度對pET_30a (+) / FPS表達量影響圖中1·標準蛋白2.空質粒 3. pET-30a(+)/ FPS 未誘導 4. O. I mmol/L IPTG5. O. 4 mmol/L IPTG 6. O. 8 mmol/L IPTG 7. I. O mmol/L IPTG 8. 2. 0 mmol/L IPTG9. 4. OmmoI/L IPTG 10. 8. Ommol/L IPTG圖7是37°C誘導pET_30a(+)/ FPS表達蛋白的不同處理
圖中I.標準蛋白2.空質粒3. pET_30a(+)/ FPS未誘導4. 37°C誘導熱處理菌液5. 37°C誘導菌液超聲處理上清6. 37°C誘導菌液上清7. 37°C誘導菌液超聲處理沉澱8標準蛋白圖8是28°C誘導pET_30a(+)/ FPS表達蛋白的不同處理圖中I.標準蛋白2.空質粒3. pET_30a(+)/ FPS未誘導4. 28°C誘導熱處理菌液
5.28°C誘導菌液超聲處理上清6. 28°C誘導菌液超聲處理沉澱7. 28°C誘導菌液上清圖9為洋甘菊FPS蛋白的Western bloting分析圖中I.標準蛋白2.空質粒3. pET-30a(+)/ FPS未誘導4.誘導5.空質粒6.pET-30a(+)/ FPS 未誘導 7 ·誘導(5，6，7 分別為 Western bloting 結果)以下結合附圖通過具體實施方式
對本發明技術方案做進一步說明。
具體實施例方式I材料與方法I. I 材料洋甘菊(Matricaria chamomilla L.)由宣城躍平生態有限公司提供提供。大腸桿菌DH5 α、BL21 (DE3)，原核表達載體pET_30a ( + )由安徽農業大學生命科學院提供。克隆載體PMD19-T由TAKARA公司提供。限制性內切酶、DNA聚合酶、T4連接酶、IPTG (異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)、X_gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D半乳糖苷)、DNA凝膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、RNAiso plus (總RNA提取試劑)等均購於TakaRa公司。基因測序為上海英俊生物公司完成。I. 2 方法I. 2. I洋甘菊總RNA提取。(I)用液氮研磨0. 2g洋甘菊花瓣至粉末狀(2)加入2ml總RNA提取試劑，覆蓋樣品，室溫靜置15min。至樣品完全融化，再用研杵研磨至裂解液呈透明狀。(3)將勻漿轉移至離心管，室溫靜置5min。(4) 12000rpm, 4 °C , 15min,吸取上清。(5)加200ul氯仿，劇烈震蕩15s，待溶液充分乳化。(6) 12000rpm, 4 °C , 15min,吸取上層水相。
(7)加600ul異丙醇，上下顛倒混勻，15_30°C下靜置IOmin.(8) 12000rpm, 4 °C , IOmin,去上清。(9)加 lml75% 乙醇，12000rpm, 4 °C，5min,去乙醇。(10)室溫乾燥2-5min，加入20ulDEPC (焦碳酸二乙酯)水。(11)吸取5 μ IRNA溶液使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測洋甘菊的RNA質量。I. 2. 2 洋甘菊 FPScDNA 獲取(I)以洋甘菊總RNA為模板反轉錄獲得單鏈cDNA。10 μ I 反應體系dNTP Mixture (IOmM each) I μ I; Random 6 mers (20 μ Μ);模板 RNA 4 μ I ；RNase Free dH20 4 μ I. (2)PCR 反應條件65°C 5min(3)離心數秒使模板RNA/引物等的混合物聚集於管底部。(4)將上述反應液離心後的液體加入5XPrimeScript Buffer 4 μ I; RNaseInhibitor 0.5 μ I; PrimeScript Rtase 0.5 μ I; RNase Free dH2o 5 μ I.共 20 μ I.(5)在 PCR 儀上進行反轉錄反應30°C IOmin; 42°C 30min; 95°C 5min.反應後得到cDNA，最後保存於4°C。1.2.3目的基因的PCR擴增。根據洋甘菊法呢基焦憐酸合酶mRNA全長序列(GenBank: EF675758. I)用PrimerPremier 5. O軟體設計引物上遊引物為5』 CATGCCATGGATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』 下遊引物為 5』CGGGATCCCTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3』其中CCATGG與GGATCC分別為NcoI和BamHI的酶切位點。以單鏈cDNA為模板進行PCR擴增。(I)擴增條件25μ I 反應體系10XPCR Buffer 2. 5 μ I; dNTP Mixture (IOmMeach) I μ I; Primer F 0. 3 μ I; Primer R 0. 3 μ I; TaKaRa Ex Taq HS 酶 0· 3 μ I ;模板 2μ1· ddH20 18. 6 μ I. (2) PCR 反應程序94°C 預變性 5min, 94 °C 30sec，55°C 退火30sec, 72°C延伸lmin，共30個循環，最後保存於4°C。經梯度試驗，所得的最佳退火溫度為55°C。I %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的純度，其它於-20°C保存。I. 2. 4洋甘菊FPS基因陽性克隆的篩選及測序分析用凝膠回收試劑盒回收FPS基因的RT-PCR產物，並與pMD 19-T simple vector(克隆載體)16°C連接過夜，連接產物轉化至DH5a感受態菌株，37°C振蕩培養一小時，取適量培養液塗布於添加X- gal和IPTG的LB平板進行藍白斑篩選，挑取白斑菌落搖菌，測序，用DNAMAN序列分析軟體對測序結果進行分析。I. 2. 5 pET-30a(+)- FPS基因原核表達載體的構建和鑑定用質粒小提試劑盒提取T-A克隆陽性菌液質粒，用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切，切膠純化回收FPS基因片段，同樣用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切pET_30a(+)空質粒，得到線性pET-30a(+)質粒。在PCR管中加入I. 5μ I克隆載體雙酶切膠回收產物，
6.5 μ I 雙酶切 pET-30a(+)質粒，I μ I 10ΧΤ4 DNA Ligase Buffer。1μ I Τ4 DNA Ligase16°C連接過夜。將得到的FPS基因與pET-30a(+)質粒連接產物轉化至DH5 α感受態菌株，加入LB培養基搖菌一小時，塗板於含50 Pg/mL Kan的LB培養基上篩選挑取單菌落，在加有50 Pg/mL Kan的LB培養基搖菌5-6小時，並進行菌液PCR鑑定，提取質粒進行雙酶切驗證，篩選陽性重組克隆進行DNA測。1.2.6 pET-30a(+)_FPS 的原核表達提取DH5a中的重組質粒pET_30a (+) _FPS，轉化至表達菌株大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有50 Pg/mL Kan的LB培養基進行篩選單菌落，挑取陽性克隆於5ml含有50 Pg/mL Kan液體培養基中，37°C振蕩培養過夜，進行PCR鑑定。同時測序。I. 2. 7 pET-30a (+) -FPS 在 BL21 (DE3)中誘導表達不同誘導時間及不同IPTG濃度對FPS表達的影響挑一個轉化重組質粒的單菌落接種於LB液體培養基中50 μ g/ml卡那黴素於37°C 過夜培養。取200 μ I過夜培養物，轉接於20ml含50 μ g/ml卡那黴素的LB液體培養基中，於37°C培養I. 5 2小時至對數生長期。(A600為O. 6左右)取出一毫升作為未誘導對照。處理一在培養物中加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)終濃度依次為1.0 mM，分別於 O. 5h，1.0h，2. 0h，3. 0h，4. 0h，5. 0h，6. Oh 取樣於 4°C保存。處理二 :IPTG 濃度分別為 0. ImM, 0. 4 mM, 0. 8 mM, I. 0 mM, 2. 0 mM, 4. 0 mM。1200 rpm,離心 2min,收集菌體沉澱。棄上清，於菌體沉澱中加入 100 μ I 20 mM Tris-Hcl 和 40 μ I 4X SDS Buffer。沸水浴 lOmin。5000rpm, 4。。離心 2min。處理三分別取37°C誘導和28°C誘導的菌液，1200 rpm，離心2min，收集菌體沉澱。棄上清，於菌體沉澱中加入100 μ I 20 mM Tris-Hcl和40 μ I 4X SDS Buffer。超聲破碎，間隔時間30s，超聲破碎10s，功率500W，共10次。取100 μ I離心，上清與沉澱分別處理。進行12% SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍染色，分析蛋白的表達情況。比較不同不同誘導時間及不同IPTG濃度對蛋白表達影響，以及不同溫度誘導，上清及沉澱中蛋白質表達情況。I. 2. 8 Westerning blot 檢測誘導後的融合蛋白His-FPS進行SDS-PAGE電泳(12%的分離膠)通過半乾轉膜儀轉到PVDF膜上。一抗為鼠源抗His標籤單克隆抗體，二抗為HRP偶聯的兔抗鼠多克隆抗體。將封閉後的PVDF膜與一抗4°C過夜孵育，TBST溶液漂洗三次，每次5min。然後在室溫條件下與二抗孵育lh，漂洗三次，每次5min。加ECL顯色液後，在暗室中進行爆光顯色。2.結果2. I洋甘菊總RNA提取提取的洋甘菊總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。如圖I所示，所提取的RNA兩條帶很清晰，分別為28S和18 S，且28S的亮度大於18S，RNA的完整性較好，沒有發生降解且不存在DNA汙染。進一步通過紫外分光光度法測得吸光度A260/A280為1.9，A260/A230為I. 7.說明酚類、多糖、蛋白質以及無機鹽等雜質已排除。從而也說明此提取方法適合于洋甘菊總RNA的提取。 2. 2目的基因的RT-PCR擴增以洋甘菊總RNA為模板，反轉錄為cDNA，以此為模板進行PCR，得到洋甘菊FPS基因，序列分析FPS基因全長為1098bp (圖2泳道I)，含有1032bp的開放閱讀框，編碼344
個胺基酸殘基。
2. 3 pET-30a(+)- FPS原核表達載體的構建和鑑定提取T載體質粒(圖3，泳道I )，內切酶NcoI和BamHI雙酶切後得到IOOObp左右的片段和一條3Kb左右的載體片段(圖4，泳道6)，與預期片段大小一致。以轉化到BL21 (DE3)的pET-30a (+) -FPS質粒菌液為模板，經PCR擴增後電泳檢測擴增出一條IKb左右的大小的DNA片段，與理論上FPS大小一致。測序結果表明重組表達載體pET-30a(+)_ FPS構建成功。2. 5 pET-30a (+) -FPS 基因在 BL21 (DE3)中誘導表達將經IPTG誘導後的表達菌進行處理，經SDS-PAGE膠檢測顯示有融合蛋白表達，分子量約為38KDa，與預測結果一致。表達的融合蛋白以部分可溶的形式溶於大腸桿菌胞液中。當IPTG濃度為I.O mM誘導時，蛋白表達量隨誘導時間增加而增加，最佳誘導時間為6h。最佳誘導溫度為37°C。(圖5.6.7.8)2. 6 Western blotting 鑑定 重組質粒的表達產物經SDS-PAGE分離後轉移到PVDF膜上進行免疫學反應即用His標籤的單克隆抗體檢測目的蛋白His-FPS的表達情況(圖9)。3 討論洋甘菊揮髮油由於獨特的香氣而廣泛用於食品、飲料、菸草、牙膏、化妝品、香皂、洗滌濟、消毒劑、醫藥等領域中。揮髮油中重要的成分為母菊奧(1，4_ 二甲基-7-乙基奧)，屬於倍半萜類物質，國內外很多文章報導了洋甘菊揮髮油成分分析，及洋甘菊揮髮油抗炎，抗腫瘤及對小鼠傷口癒合的促進作用_等。尚未有洋甘菊揮髮油中控制母菊奧代謝途徑有關酶類及基因的研究。母菊奧的代謝途徑為異戊二烯生物合成途徑，此過程有三個比較重要的限速酶，分別是HMG-CoA還原酶(HMGR)，FPS，倍半萜合酶。FPS處於比較重要的分支點，本文主要克隆了 FPS基因，表明洋甘菊FPS基因ORF框為1032bp，序列比較做出進化樹，證明洋甘菊FPS基因與其他植物倍半萜合成酶基因具有較高的同源性。並構建原核表達載體pET-30a(+)/ FPS,誘導表達可溶性蛋白，進行Westerning驗證,得到分子量約為38KDa的目的蛋白，為下一步FPS蛋白純化及蛋白結構和特性的研究奠定基礎，進而為通過轉基因方法提高洋甘菊母菊奧產量提供依據。此外對誘導表達蛋白的條件進行了優化，證明表達的融合蛋白以部分可溶的形式溶於大腸桿菌胞液中。當超聲處理在37°C誘導表達的蛋白時，處理上清有少量蛋白，大部分蛋白存在於沉澱裡，而28°C誘導時上清和沉澱含蛋白量差不多。當IPTG濃度為1.0 mM誘導時，蛋白表達量隨誘導時間增加而增加，最佳誘導時間為6h。最佳誘導溫度為37°C。序列表安徽農業大學〈120〉洋甘菊法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因克隆及原核表達〈130〉洋甘菊法呢基焦磷酸合酶(FPS)基因克隆及原核表達〈160〉2 PatentIn version 3. I〈210〉I〈211〉1032〈212〉DNA
〈213〉 Matricaria chamomilla L〈400〉Iatgagtatcg tggatctgaa atcaaagttt ttgaaagtgt atgacacgct taaatcggag 60ttgattaacg accctgcgtt tgaatttgac gatgattctc gtcagtgggt tgagaagatg 120cttgactaca atgtacctgg aggaaagctg aaccggggat tatctgttgt cgacagttat 180
caactcctta aaggaggaga actgactgat gacgagattt ttctttcatc cgctcttggt 240tggtgcattg aatggcttca agcgtacttt ctggtgcttg atgatatcat ggacgagtct 300catacacgca gagggcaacc atgttggttt agattaccaa aggttggtat gattgctgca 360aacgatggaa ttcttcttcg caaccatgtc ccgagaattc ttaagaatca tttccgagga 420aagccttact atgtggatct tgtggacctg ttcaacgagg ttgaattcca aacagcctcc 480ggacagatga tcgatttgat cactacactt gttggagaga aagatctctc aaagtattca 540ttgtctgttc accgccggat tgttcaatac aagacagctt actactcatt ttaccttcct 600gttgcctgcg cactccttat gtttggagag gatcttgaca aacacgttga agtgaagaac 660gtactcgttg aaatgggtac ctattttcaa gttcaggacg attatctaga ctgttttggt 720actcccgagg tgattggaaa gattggaacc gatattgaag actttaagtg ctcctggtta 780gttgtcaaag cattggaact cgctaatgag gaacaaaaga aattcctaca tgagaactat 840gggaaaaagg accccgcttc cgttgcaaaa gtcaaggaac tataccacac tctcaacctt 900caggctgtgt ttgaagatta cgaggccaca agctacaaga agctgatcac atcgattgaa 960aatcacccaa gcaaagcagt ccaagcggtg ttgaaatctt tcttgggtaa aatctacaag 1020aggcaaaagt ag1032〈210〉2〈211〉343〈212〉PRT〈213〉Matricaria matricarioides〈400〉2Met Ser lie Val Asp Leu Lys Ser Lys Phe Leu Lys Val Tyr Asp Thr151015Leu Lys Ser Glu Leu lie Asn Asp Pro Ala Phe Glu Phe Asp Asp Asp202530Ser Arg Gln Trp Val Glu Lys Met Leu Asp Tyr Asn Val Pro Gly Gly354045Lys Leu Asn Arg Gly Leu Ser Val Val Asp Ser Tyr Gln Leu Leu Lys505560Gly Gly Glu Leu Thr Asp Asp Glu lie Phe Leu Ser Ser Ala Leu Gly65707580Trp Cys lie Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Phe Leu Val Leu Asp Asp lie859095Met Asp Glu Ser His Thr Arg Arg Gly Gln Pro Cys Trp Phe Arg Leu100105110
Pro Lys Val Gly Met lie Ala Ala Asn Asp Gly lie Leu Leu Arg Asn115120125His Val Pro Arg lie Leu Lys Asn His Phe Arg Gly Lys Pro Tyr Tyr130135140Val Asp Leu Val Asp Leu Phe Asn Glu Val Glu Phe Gln Thr Ala Ser
145150155160Gly Gln Met lie Asp Leu lie Thr Thr Leu Val Gly Glu Lys Asp Leu165170175Ser Lys Tyr Ser Leu Ser Val His Arg Arg lie Val Gln Tyr Lys Thr180185190Ala Tyr Tyr Ser Phe Tyr Leu Pro Val Ala Cys Ala Leu Leu Met Phe195200205Gly Glu Asp Leu Asp Lys His Val Glu Val Lys Asn Val Leu Val Glu210215220Met Gly Thr Tyr Phe Gln Val Gln Asp Asp Tyr Leu Asp Cys Phe Gly225230235240Thr Pro Glu Val lie Gly Lys lie Gly Thr Asp lie Glu Asp Phe Lys245250255Cys Ser Trp Leu Val Val Lys Ala Leu Glu Leu Ala Asn Glu Glu Gln260265270Lys Lys Phe Leu His Glu Asn Tyr Gly Lys Lys Asp Pro Ala Ser Val275280285Ala Lys Val Lys Glu Leu Tyr His Thr Leu Asn Leu Gln Ala Val Phe290295300Glu Asp Tyr Glu Ala Thr Ser Tyr Lys Lys Leu lie Thr Ser lie Glu305310315320Asn His Pro Ser Lys Ala Val Gln Ala Val Leu Lys Ser Phe Leu Gly325330335Lys lie Tyr Lys Arg Gln Lys340
權利要求
1.一種洋甘菊法呢基焦磷酸合酶，其特徵在於該酶的胺基酸序列如SEQ NO 2所示。
2.編碼權利要求I所述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶的基因，其特徵在於其核苷酸序列如SEQ NO I所示。
3.含有權利要2所述洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因的重組表達載體。
4.權利要求3所述重組表達載體的構建與表達方法，其特徵在於，具體包括如下步驟 (1)以洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因單鏈cDNA為模板，以Pl和P2為擴增引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物； 所述引物為Pl :5』 CATGCCATGGATGAGTATCGTGGATCTGAAATCAAAGTTTT 3』P2 :5』 CGGGATCCCTACTTTTGCCTCTTGTAGATTTTACCCAAG 3』 ； 所述擴增條件為採用25μ I反應體系，94°C預變性5min，94 °C 30sec，55°C退火30sec, 72°C延伸lmin，共30個循環； (2)將步驟(I)中所得PCR擴增產物與pMD19-T克隆載體16°C連接過夜，連接產物轉化至DH5a感受態菌株，37°C振蕩培養一小時，取適量培養液塗布於添加X- gal和IPTG的LB平板進行藍白斑篩選，挑取白斑菌落搖菌，進行序列分析，挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有洋甘菊法呢基焦磷酸合酶基因(下稱FPS)的pMD 19-T重組質粒； (3)用限制性內切酶NcoI和BamHI對步驟(I)pMD 19-T重組質粒進行雙酶切，切膠純化回收FPS基因片段，同樣用限制性內切酶NcoI和BamHI雙酶切pET_30a(+)空質粒，得到線性pET-30a(+)質粒；在PCR管中加入I. 5 μ I克隆載體雙酶切膠回收產物，6. 5 μ I雙酶切pET-30a(+)質粒，I μ I 10ΧΤ4 DNA連接酶，I μ I Τ4 DNA連接酶緩衝液16°C連接過夜；將得到的FPS基因與pET-30a(+)質粒連接產物轉化至DH5 α感受態菌株，加入LB培養基搖菌一小時，塗板於含50 Pg/mL卡那黴素的LB培養基上篩選挑取單菌落,在加有50 Pg/mL卡那黴素的LB培養基搖菌5-6小時，並進行菌液PCR鑑定，提取質粒進行雙酶切驗證，篩選陽性重組克隆進行DNA測序；得到含有FPS基因重組質粒pET-30a(+)-FPS ； (4)提取DH5α中的重組質粒pET-30a(+)-FPS，轉化至表達菌株大腸桿菌BL21 (DE3)，用含有50 Pg/mL Kan的LB培養基培養12小時，挑取陽性克隆於5ml含有50 Pg/mL Kan液體培養基中，37°C振蕩培養5小時，進行PCR鑑定；同時測序。
全文摘要
本發明公開了一種洋甘菊法呢基焦磷酸合酶及其重組表達載體的構建與表達方法，該酶的胺基酸序列如SEQ NO 2所示，其核苷酸序列如SEQ NO 1所示。本發明洋甘菊FPS基因ORF框為1032bp,通過序列比較，證明洋甘菊FPS基因與其他植物倍半萜合成酶基因具有較高的同源性；並通過構建原核表達載體pET-30a(+)/ FPS，誘導表達可溶性蛋白，進行Westerning 驗證，得到分子量約為38KDa的目的蛋白，為下一步FPS蛋白純化及蛋白結構和特性的研究奠定基礎，進而為通過轉基因方法提高洋甘菊母菊薁產量提供依據。此外本發明對誘導表達蛋白的條件進行了優化，其最佳誘導時間為6h；最佳誘導溫度為37℃。
文檔編號C12N9/10GK102703397SQ20121014219
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者楊秀梅, 袁藝, 邰玉玲 申請人:安徽農業大學