脂族氨基取代的脫甲氧竹紅菌素及其合成的製作方法

2024-03-26 09:10:05

專利名稱：脂族氨基取代的脫甲氧竹紅菌素及其合成的製作方法
技術領域：
本發明公開了一種具有光動力學活性的新型光敏劑，即脂族氨基取代的脫甲氧竹紅菌素及其合成。
背景技術：
光動力學療法(PDT)是一種聯合採用光和感光劑以在癌組織或其它不需要的組織中產生細胞毒素效應的醫學療法。與常規的化學療法相比，它具有較高的效力和安全性。被廣泛公認的PDT機理是，照射時，光敏劑連續產生能殺死靶分子的高反應性的活性氧類。與每次僅僅可殺死一種靶分子的傳統的化學藥物對比，PDT具有顯著的高效能。另一方面，PDT具有藥物定向性和光定向性雙重選擇性，這避免或減少了對正常組織的損害，從而增加藥物的安全性。這對於癌症和AIDS的治療很重要。
光動力學療法(PDT)包括將光敏藥物引入體內，隨後通過可見光或近紅外光照射腫瘤組織。在氧存在時，照射激活該藥物並反過來產生導致組織損傷的反應性氧類。緣於該療法的優點，例如在大多數部位的相對選擇性，與其它療法的相容性，可重複性，易於給藥等，PDT正慢慢地找到其作為癌症的有效治療方法在對於治療癌症或臨床疾病的某些類型中的位置，例如肺癌、食道癌、胃癌、子宮頸癌和子宮頸發育異常等。[1]隨著雷射和光纖維技術的快速發展，PDT中的光源問題得到了解決，選擇PDT治療中的光敏劑變得更為關鍵。目前，最普及的光動力學劑photofrin對治療早期的惡性腫瘤例如膀胱癌、肺癌和胃癌等具有顯著療效。Lipson等採用血卟啉衍生物(HPD)檢測和控制癌生長，並在1966年第一次用於治療乳腺癌。在《泌尿學雜誌》(1976，115，150)中，Kelly和Snell報導了HPD對膀胱癌具有顯著的光動力學療效。在《NATO癌症研究所雜誌》(1975，55，115)中，Dougherty等報導了他們採用HPD作為光敏劑用於研究其對抗數千例腦瘤、咽喉癌和眼腫瘤的光動力學活性，並取得了顯著的療效。1978年，Dougherty用HPD作為光敏劑治療惡性皮膚癌和皮下腫瘤，結果顯示在113例病變中，有111處全部治癒或部分治癒。卟啉類光敏劑是一種包括四個吡咯環和四個次甲基橋的n-共軛體系。HPD和二血卟啉醚或酯(DHE)是用於臨床治療中的綜合藥劑。當HPD達到某一濃度時，體內外迅速出現聚集，這降低了HPD的光動力學活性。在《細胞生物化血作用》(1985，3，15)中，EI-Far等報導了HPD是脂性的，並表現出具有一定程度的癌細胞定位能力。在癌組織中，可使它們選擇性地增加，其定位作用和光敏活性主要依賴於其疏水性、聚集態和電荷分布。
迄今，只有Photofrin已得到加拿大、日本、荷蘭和美國的健康委員會的批准[2]。儘管獲得了有關Photofrin的許多好的結果，但一些重要的因素仍然限制了PDT的效能，包括它的複合組分、在紅光譜區的低消光係數和長時間的皮膚射線損害性等[3]。這無疑促進了對更適合的理想光敏劑的進一步研究。
雖然使用HPD作為光敏劑的PDT已經引起了極大的關注，但仍然存在一些嚴重的缺陷，即，組分複雜、在光動力學的範圍內(600-900nm)的吸收很少、代謝緩慢，以及毒性和副作用等。
為了克服這些缺陷，近年探究了各種新的光敏劑。天然存在的多環醌，竹紅菌素，是從真菌hypocrella bambuase(B.Et Br)sacc中分離出來的，其在中國的西南部生長豐富。在過去的20年，它們在真菌中的高含量(3-4％)和易於分離和純化的性質已受到了極大的關注。竹紅菌素的名稱源於Hypocrellabambusae sacc.，一種箭竹屬的寄生真菌，它在雲南省(中國)的西北部地區、西藏的東南部和斯裡蘭卡的某些地方生長豐富。竹紅菌素屬於苝醌(PQP)顏料的常見種類，包括竹紅菌甲素(HA)和竹紅菌乙素(HB)。
在中國，一些醫院已用竹紅菌素作為光動力學劑來治療某些皮膚病，例如陰部漂白(pudendum bleaching)、白癜風和牛皮癬。1980年，在《科學通報》(1980，25，1148)(中國)和《雲南醫藥》(1980，1，20)(中國)中，Xiang-yi Wan和Zi-hua Luo分別報導了竹紅菌素可用於治療陰部漂白(pudendumbleaching)和皮膚斑疹。人們逐漸將竹紅菌素用於治療苔癬化、白癜風，以及牛皮癬和頭癬。在Liebigs Ann.Chem.(1981，1880)中，Yuan-teng Chen等確定了竹紅菌甲素的一種有效組分竹紅菌甲素(HA)。在《科學通報》(1988，33，518)(中國)中，Manhua Zhang和Li Liang等確定了竹紅菌素的另一有效組分，竹紅菌乙素(HB)。Manhua Zhang等花了十多年研究了竹紅菌素的結構、光化學、光物理、光生物學和細胞學特性。我們觀察到竹紅菌素由HA{3，10-二羥基-4，9-二酮-1，12-(2′-羥基-2′-甲基-3′-醯基)亞丙基(1′，3′)-2，6，7，11-四甲氧基-苝}(見結構I)和HB{3，10-二羥基-4，9-二酮-1，12-(2′-甲基-3′-醯基-2′，3′-脫氫)亞丙基(1′，3′)-2，6，7，11-四甲氧基-苝}(見結構II)組成。
作為一種新的光敏劑，它們具有一些優點，包括易於製備和純化、毒性低、穩定性強、無聚集、代謝快、副作用少以及在癌組織中的選擇性定位。這些特性使得它們成為有前景的第二代光敏劑。在《光化學與光生物學》(1997，65，352)中，Lown等報導了HB具有明顯的抗AIDS作用。然而它們在光動力學範圍內吸收很少限制了它在PDT中的應用。竹紅菌素，由於其純的組分、有利的紅光吸收光譜、單線態氧的高量子產率，以及間接化學改性的功能，已被選為PDT的潛在光敏劑[4]。人們已經合成和研究了許多源於竹紅菌乙素(HB)的衍生物，其中一些已顯示了有前景的抗癌特性(5-11)。為了克服這些缺陷，人們對竹紅菌素進行了許多結構修飾。1994-1995年，我們和Lown幾乎同時製備了氨基取代的竹紅菌素。這種氨基取代的竹紅菌素在光動力學範圍內顯示出很強的吸收。藉助於雷射，它們較其親本竹紅菌素具有更強的光動力學活性。在《光化學和光生物學》(1997，65，714)中Lown詳細報導了氨基取代的竹紅菌素對癌細胞的光損傷。在Dr.Lown製備的氨基取代的衍生物中，竹紅菌素中最初的近位羥基化苝醌結構發生了變化(見結構III和IV，III和IV的親本化合物為異構體)，這改變了竹紅菌素的光敏位置。由於步驟太多，Lown報導的氨基取代的HB的方法不受歡迎。
Manhua Zhang等報導，由於其不合乎要求的光敏位置，使得巰基取代的竹紅菌素在光動力學範圍內吸收很少。


圖1展示了HB和2-BA-2-DMHB的吸收數據。
圖2展示了HB(左)和2-BA-2-DMHB(右)的定位。
圖3展示了HB和2-BA-2-DMHB的細胞毒性(圖3A)和光毒性(分別為圖#B和3C)。
圖4為Hoechst 33342-染色的HeLa細胞的螢光圖。細胞在4μM2-BA-2-DMHB中培養6小時並用LD70照射。圖4A展示了未經處理的對照細胞；圖4B為深色的對照細胞(光劑量＝0)；圖4C為照射後24小時。
圖5展示了HeLa細胞中的PDT-誘導的DNA裂解第1道，HB單獨培養(4μM，15分鐘)；第2和3道，分別在LD70和LD90時HB光敏作用後24小時；第4道，2-BA-2-DMHB單獨培養(4μM，6小時)；第5和6道，分別在LD70和LD90時2-BA-2-DMHB光敏作用後24小時；第7道，標記(PUC-Mspl消化)。
圖6展示了用PDT處理的HeLa細胞的DNA直方圖。圖6A展示了2-BA-2-DMHB的培養；圖6B，LD90時2-BA-2-DMHB光敏作用後6小時；圖6C，HB單獨培養；圖6D，LD90時HB光敏作用後24小時。
圖7展示了在照射(LD90)後不同培養時期編程的(apoptic)HeLa細胞的百分比。

發明內容
本發明提供一種新的脂族氨基(含脂肪環和芳香環)-取代的脫甲氧基化竹紅菌素及其製備方法。這些竹紅菌素衍生物在光動力學範圍內表現出強吸收，保留了近位羥基化苝醌結構的光動力學特性。在用雷射照射時，它們可產生活性氧類，包括單線態氧(1O2)、過氧化物陰離子基團(O2-)和羥基基團(HO-)，並具有強的光動力學活性，可用於治療癌症和抗AIDS病毒。
本發明的竹紅菌素衍生物由氨基取代的脫甲氧基竹紅菌甲素和乙素組成，其結構如V和VI所示 其中R1、R2、R3、R4為OCH3、NHCH2Ar(Ar為苯基或吡啶基)或NHCH(CH2)n(其中-CH(CH2)n為脂環基，且n＝3、4、5、6)。2-BA-2-DMHB為，其中R1、R2、R3為OCH3，R4為NH(CH2)3CH3。或者，R1、R2、R3、R4為OCH3或NHCH2(CH2)nAr，其中Ar為苯基、萘基、多環芳香部分或雜環部分，n為0-12。
本發明的竹紅菌素衍生物也包括2-丁基氨基-2-脫甲氧基-竹紅菌乙素(2-BA-2-DMHB)。2-BA-2-DMHB在紅色光譜區域具有很強的吸收。與其親本化合物HB相比，它的吸收譜帶延伸至更長的波長。在583nm時的消光係數(6)為548nm時HB的2.5倍，621nm時為580nm時HB的3.8倍以上(表1)。這對於臨床使用的光源的組織穿透更為有利。
2-BA-2-DMHB具有極好的細胞損害的光電位。MTT比色測定結果顯示，2-BA-2-DMHB甚至在最高試驗濃度(100μM)時也不會引起50％致死率。這意味著在暗處的2-BA-2-DMHB的LD50大於100μM，這可與任何前面報導的HB衍生物的LD50相比[8-10]。然而，HB在大約20μM時導致50％致死率。換言之，2-BA-2-DMHB的細胞毒性遠低於HB的細胞毒性。另一方面，在24Jcm-2的小劑量時，2-BA-2-DMHB的LD50約為0.4μM，而HB的LD50為2μM。因此，2-BA-2DMHB的體外光電位為HB的25倍，這將對給藥帶來廣泛的安全範圍。
本發明的竹紅菌素衍生物也可與結合劑綴合，該結合劑在體內或體外結合預定的細胞或結構。與單克隆抗體綴合(例如，免疫綴合)可提供與各種疾病的治療相關的專一性，包括卵巢癌和乳腺癌。竹紅菌素的螢光特性、或者它們被強烈染色的事實，有利於用於腫瘤和轉移性疾病的診斷，它們的光譜指紋有利於對惡性的、正常的、發炎的、或實際被損壞的組織之間的鑑別。此外，可通過各種光學檢測手段檢測這些螢光特性。
與單克隆抗體綴合也可提供對各種疾病的光照療法的高度專一性，包括卵巢癌和乳腺癌。此綴合通過編程細胞死亡調節光毒性，首先通過II型與細胞內靶和膜靶的光化學反應來調節。在完全缺氧時，通過I型光化學反應調節光毒性，其特點在於對低氧腫瘤細胞的處理很關鍵。在688nm時它們保持有嚴重的光毒性，而在光療範圍內很好[Estey等，Cancer Chemother.Pharmacol.，37343(1996)]。
本發明包括苝醌(PQP)衍生物作為光動力學劑的用途，以及竹紅菌素衍生物在光動力學治療(PDT)中的用途。
本發明也包括一種治療方法，其通過給予治療足夠量的至少一種本發明的竹紅菌素衍生物，以及使衍生物光活化來實現。尤其是，竹紅菌素衍生物可通過將衍生物暴露於預定波長光而得以活化。
本發明也包括一種光動力學治療的方法，包括給予一種含本發明的一種或多種竹紅菌素化合物的組合物。
本發明也包括一種治療癌症的方法，其在大約400nm-大約850nm光波長存在時得以改善。本發明也包括採用一種或多種PQP衍生物以產生單線態氧和各種毒性自由基。尤其是，能產生單線態氧和/或各種毒性自由基的化合物也可用於治療某些疾病，等等。
本發明也包括使用具有抗癌和/或抗病毒活性的竹紅菌素衍生物，以及通過使衍生物光活化來增強這些衍生物的活性。本發明也包括使用竹紅菌素衍生物優先破壞或優先導向靶癌細胞。
本發明也包括一種製備例如竹紅菌素的天然苝醌的方法；合成苝醌衍生物，例如竹紅菌甲素和竹紅菌乙素、放射性標記的竹紅菌乙素和放射性標記的竹紅菌乙素衍生物。本發明也包括含苝醌衍生物、竹紅菌素衍生物、放射性標記的竹紅菌乙素和放射性標記的竹紅菌乙素衍生物、苝醌綴合物、以及竹紅菌素綴合物的組合物。
本發明也包括將本發明的PQP衍生物與一種或多種結合劑例如抗體或抗體片段綴合。本發明也包括與一種或多種結合劑例如抗體或抗體片段綴合的PQP衍生物。本發明還包括將PQP衍生物例如竹紅菌素衍生物與DNA小溝結合劑綴合以在細胞結構例如細胞核中產生光毒性。
本文中，苝醌衍生物或衍生物是指所有來源於自然的或天然的苝醌的脫甲氧基化合物，其可被預定波長的光激活。在本發明的優選的實施方式中，衍生物為一種源自天然存在的竹紅菌甲素或竹紅菌乙素、以及竹紅菌素樣化合物的化合物。本文中的竹紅菌素衍生物可被光激活、也可用作光動力學劑。本發明的衍生物也可與其它活性試劑複合或包括其它活性試劑，該試劑包括但不限於化療劑或烷基化劑。
可以用任何可產生純化或基本上純化的化合物、或產生用作光動力學劑的化合物的方法來製備本發明化合物。本發明化合物也可形成包含化合物的混合物如一種以上化合物的組合物。這些方法在本領域是眾所周知的，例如Liu等，「新的竹紅菌乙素衍生物的合成研究，《四面體》，4910785(1993)；和Diwu等，《抗癌藥物設計》，8129-143(1993)。由親本化合物竹紅菌乙素(HB)也很容易合成竹紅菌素衍生物，竹紅菌乙素是真菌Hypocrellabambusae sacc.，竹子的植物病原體的天然產物。本發明的化合物也可按如下合成。在實施例中還對製備化合物的典型方法進行了更詳細的描述。其意在於本發明並不限於製備、分離或純化竹紅菌素衍生物的方法。
本發明中的竹紅菌素衍生物的製備方法如下將竹紅菌素例如竹紅菌甲素或乙素溶解在新鮮的含過量的脂族胺的蒸餾溶劑中，攪拌所得到的溶液6-24小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿、然後將薄層色譜法(TLC)用於分離殘餘物、其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC純化兩次，得到純的氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌素。竹紅菌甲素和乙素均可使用於反應。
脂族胺可包括但不限於環戊胺、環己胺、苄胺、3-吡啶基-甲胺和4-吡啶基-甲胺。胺也可包括環丁胺、組胺、2-噻吩甲胺、2-吡咯甲胺、或色胺。
溶劑可包括但不限於，苯、吡啶、環己烷、或1，4-二氧六環。溶劑也可包括氯苯、甲苯、己烷、石油醚、四氫呋喃、或N，N-二甲基甲醯胺。
本發明的竹紅菌素衍生物在光動力學範圍內(600-900nm)具有很強的吸收。在用雷射照射時，它們可產生活性氧類，包括單線態氧(1O2)、過氧化物陰離子基團(O2-)和羥基基團(HO-)。它們具有幾大優點，即，強的光動力學活性和低的暗毒性，這使得它們成為有前景的抗癌劑和抗AIDS劑。
對本發明的這些氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌素衍生物的光化學和光物理學的研究表明它們保存有光敏部位(正如它們的親本竹紅菌素)，可有效地產生活性氧類例如單線態氧(1O2)(1O2的量子產率為0.5-0.8，這可與HA、HB和HPD相比)和過氧化物陰離子基團(O2-)(氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌素衍生物的O2-的量子產率大於HB的2-5倍)。它們在光動力學範圍內具有很強的吸收(在光動力學範圍內它們的消光係數大於HA、HB和HPD的10-100倍)。所有這些結果表明本發明的氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌素衍生物的具有作為新一代光敏劑的理想活性。
前面的動物實驗顯示竹紅菌甲素和乙素毒性低。Lown′s小組已證實了引入氨基增強了竹紅菌素的鹼性，這使得它們在溶酶體中定位更佳。溶酶體中的光損傷可誘導癌細胞降解。
本發明的氨基取代的竹紅菌素具有光動力學範圍內的強吸收(λmax＞104L·moI-1·cm-1)、高的單線態氧的量子產率(可與其親本竹紅菌素相比)、強的電荷傳遞活性(氧化電位從1.3V減至0.8V，O2-的量子產率較親本竹紅菌素大3倍)，表明它們具有強的光動力學作用。本發明中提供的製備方法簡便、適度、成本低，易於大規模生產。
在這裡，發現另一種新的竹紅菌素同類物，2-丁基氨基-2-脫甲氧基-竹紅菌乙素(2-BA-2-DMHB)[12]是有效的光敏劑。報導了其對HeLa細胞的光毒性和其引起的編程細胞死亡。
在本文中，給藥是指任何導致本發明的一種或多種竹紅菌素衍生物與預定的一個細胞、多個細胞、或組織(尤其是哺乳動物)暴露或接觸的作用。本文中，給藥可在體內、體外或間接體內進行。例如，一種組合物可以通過注射或內窺鏡給藥。給藥也包括將本發明的組合物直接用於細胞。例如，在手術過程中，腫瘤細胞可能會暴露。根據本發明的一個實施方式，可將這些暴露的細胞(或腫瘤)直接暴露於本發明的組合物，例如通過洗滌或衝洗手術部位和/或細胞。
本文中，結合劑是指任何與承載在靶部位的受體形成特異結合的試劑或類似物，例如，與癌細胞的表位結合的抗體或抗體片段，或對準細胞的某一區域或結構的試劑。在本發明的一個優選實施方式中，結合劑是一種與癌細胞特異性結合的抗體或抗體片段。在本發明的另一個優選實施方式中，結合劑結合卵巢癌、乳腺癌或胃腸癌的抗原表位。
本文中，生理學上可接受的流體是指任何適於與含竹紅菌素衍生物的組合物結合的流體或添加劑。典型的是這些流體用作稀釋劑或載體。生理學上可接受的流體的例子包括但不限於防腐劑溶液、鹽水溶液、等滲的(約0.9％)鹽水溶液、或大約5％白蛋白溶液或懸浮液。其目的在於表明，本發明並不是局限於所使用的生理學上可接受的流體類型。本組合物也可包括藥學上可接受的載體。藥學上接受的載體包括但不限於鹽水、無菌水、磷酸鹽緩衝液等。在本發明組合物中也可包括其它適於對患者給藥的緩衝劑、分散劑、和無毒的惰性物質。該組合物可以是溶液、懸浮液或任何適於給藥的適合製劑，特別是無菌的和不含不需要的微粒物質的製劑。該組合物可通過常規的滅菌技術來進行滅菌。
也可將本發明化合物與許多其它化合物、信號劑、增強劑、和/或導向劑聯合和綴合。例如，可以將本發明化合物與抗體、優選單克隆抗體綴合。根據本發明，結合劑包括任何DNA小溝導向劑，例如來紅菌素(lexitropsin)或紡錘菌素(netropsin)，優選為了增強對細胞核中的光毒性的定向。
適合的增強劑包括但不限於pKa改性劑、低氧細胞放射致敏劑、和生物還原激活的抗腫瘤劑，例如絲裂黴素C(優選用於影響或加強化合物在低氧細胞或微生物中的毒性)。適合的信號劑包括但不限於編程細胞死亡或壞死細胞死亡的標記物、或內源於細胞循環調節或延遲的調節劑分子，優選通過誘導編程細胞死亡或壞死細胞死亡、或通過抑制任何方式的致死損傷或潛在致死損傷(PLD)的修復以加強化合物的光毒性。
如上所述，本發明的一個實施方式包括結合劑-竹紅菌素綴合物(或免疫綴合物)和這些綴合物的治療用途。根據本發明，可以使用任何將結合劑與竹紅菌素連接的方法。例如，如何將一種抗體或一種抗體片段與光敏劑連接是眾所周知的。例如，Goff等，《英國癌症雜誌》，741194-1198(1996)公開了通過用單克隆抗體OC125培養光敏劑得到的免疫綴合物產品，單克隆抗體OC125是一種與和大多數卵巢癌有關的CA125抗原特異性結合的抗體。
實施本發明的最佳方式通過下列實施例對本發明進行進一步舉例說明實施例1將150mg竹紅菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含過量環戊胺的新鮮的蒸餾苯中，攪拌所得到的溶液18小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿、然後用薄層色譜法(TLC)純化殘餘物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC兩次以進一步純化，得到氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌乙素。
產品特徵UV-vis光譜(λmax)466nm，577nm，641nm；IR光譜(Vmax)3419cm-1，2922cm-1，1680cm-1，1608cm-1；1HNMR(δ)6.32(s)，6.80(s)，3.08(s)，2.55(s)，1.79(s)，1.91(s)，4.01(s)，4.08(s)，4.24(s)，1.86(m)，1.68(m)，1.49(m)，1.00(m)，16.07，15.78ppm；質譜(m/z)583(M+)
實施例2將150mg竹紅菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含過量環己胺的新鮮的蒸餾苯中，攪拌所得到的溶液16小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿，然後用薄層色譜法(TLC)純化殘餘物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC兩次以進一步純化，得到氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌乙素。
產品特徵UV-vis光譜(λmax)468nm，579nm，642nm；IR光譜(Vmax)3421cm-1，2920cm-1，1678cm-1，1605cm-1；1HNMR(δ)6.12(s)，6.79(s)，3.05(s)，2.54(s)，1.76(s)，1.89(s)，4.05(s)，4.10(s)，4.21(s)，1.84(m)，1.40(m)，1.26(m)，1.01(m)，16.08，15.79ppm；質譜(m/z)597(M+)實施例3將150mg竹紅菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含過量苄胺的新鮮的蒸餾吡啶中，攪拌所得到的溶液15小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿，然後用薄層色譜法(TLC)純化殘餘物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC兩次以進一步純化，得到氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌乙素。
產品特徵UV-vis光譜(λmax)468nm，623nm；IR光譜(Vmax)3438cm-1，2942cm-1，1683cm-1，1605cm-1；1HNMR(δ)7.53(m)，7.34(m)，6.32(s)，6.80(s)，3.08(s)，2.55(s)，1.79(s)，1.91(s)，4.01(s)，4.08(s)，4.24(s)，1.86(m)，16.07，15.78ppm；質譜(m/z)603(M+)實施例4將150mg竹紅菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含過量3-吡啶甲胺的新鮮的蒸餾吡啶中，攪拌所得到的溶液21小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿，然後用薄層色譜法(TLC)純化殘餘物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC兩次以進一步純化，得到氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌乙素。
產品特徵UV-vis光譜(λmax)471nm，625nm；IR光譜(Vmax)3435cm-1，2940cm-1，1682cm-1，1604cm-1；1HNMR(δ)8.53(s)，8.29(d)，7.77(m)，7.36(d)，6.37(s)，6.59(s)，3.98(s)，2.63(s)，1.78(s)，2.28(s)，4.04(s)，4.06(s)，4.13(s)，1.90(m)，1.62(m)，1.42(m)，1.27(m)，1.00(m)，16.59，16.80ppm；質譜(m/z)603(M+)實施例5將150mg竹紅菌乙素(0.28mmol)溶解在100mL含過量4-吡啶甲胺的新鮮的蒸餾苯中，攪拌所得到的溶液21小時。在減壓下除去溶劑。用氯仿衝洗殘餘物3-4次，再用水衝洗氯仿層3-4次。蒸發氯仿，然後用薄層色譜法(TLC)純化殘餘物，其中用3∶1∶0.5(V∶V∶V)環己烷-醋酸乙酯-95％乙醇作洗脫劑。重複TLC兩次以進一步純化，得到氨基取代的脫甲氧基化竹紅菌乙素。
產品特徵UV-vis光譜(λmax)398nm，474nm，596nm；IR光譜(Vmax)3433cm-1，2928cm-1，1680cm-1，1600cm-1；1HNMR(δ)8.56(s)，8.24(d)，7.72(m)，7.28(m)，6.47(s)，6.50(s)，5.25(s)，2.58(s)，2.80(s)，3.90(s)，3.88(s)，3.89(s)，4.02(t)，4.20(t)，-16.07ppm；質譜(m/z)603(M+)實施例6材料和方法化學藥品通過以下方法製備竹紅菌乙素(HB)，即用定量的氫氧化鉀使竹紅菌素A(HA)脫水、然後用Ha中和、氯仿提取，並用苯-石油醚重結晶，通過下列方法製備2-丁基氨基-2-脫甲氧基-竹紅菌乙素(2-BA-2-DMHB)，即對HB用吡啶中的正丁胺回流、中和，並用氯仿提取。將該產物進行1％檸檬酸-二氧化矽薄層色譜(TLC)，用6∶1∶1石油醚/醋酸乙酯/乙醇(95％)的混合物作洗脫劑，得到三種化合物。它們是目標化合物(流速(Rr)＝0.64)和兩種副產物(分別為Rr＝0.74和0∶40)，它們可通過合適的NMR、質譜和元素分析得以確定[12]。用TLC進一步純化靶化合物、得到產率54％的所需產物2-BA-2-DMHB。通過高性能液相色譜確定HB和2-BA-2-DMHB的純度，發現高於95％。2-BA-2-DMHB的化學結構如下所示，其吸收光譜見圖1。它們的吸收光譜參數如表1所示。將光敏劑以凍幹形式保存直至實驗時，屆時將它們溶解在DMSO中。
表1氯仿中光敏劑的吸收光譜參數化合物 λmax(nm)(log6)HB 466(4.06)，548(3.70)，580(3.52)2-BA-2-DMHB 463(4.06)，583(4.09)，621(4.10)從美國Aldrich化學公司購買5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)和9，10-二苯蒽(DPA)。從美國紐約Gibco BRL(大的島嶼)購買Dulbecco改進的極限必需培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、溴化乙錠(EB)和三-(羥甲基)甲胺(Tris)。從Merck(Rahway.NJ，USA)得到K蛋白酶和十二烷基硫酸鈉(SDS)。從Promega(Madison.WI，US A)獲得瓊脂糖。從Sigma化學公司(St.Lows，MO USA)購得核糖核酸酶A、二甲基亞碸(DMSO)、3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-聯苯-2H-四唑翁溴化物(MTT)和碘化丙錠(PI)。從Molecular Probes(Eugene，OR)USA)購得Hoechst染料33342(HO342)。其它試劑為分析級。
測定反應性氧類產率按前面所報導的通過DPA漂白法測定單線態氧的產率。將DMPO的電子自旋共振(ESR)測定和自旋捕獲用於測定竹紅菌素產生的O2[13]。
細胞培養在37℃、潮溼的5％CO2培養箱中，將HeLa細胞在含5％FBS和抗生素PS(80U/ml青黴素和100μg/ml鏈黴素)的DMEM中保持單層培養。
分配比將光敏劑的分配比定義為[Sen/g細胞]/[Sen/ml培養基]。按前面所述測定這些值[14]。於37℃將指數生長細胞置於DMEM中與HB培養15分鐘或與2-BA-2-DMHB培養6小時，範圍在0-5μM。在此期間達到穩定態細胞內的水平。用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中的0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分離細胞、離心-衝洗以去除無限制的染色。在3mI 10mM氚核X-100洗滌劑中分散洗過的顆粒狀物(2×106)。在460nm激發這些溶液、用Hitachi-F4500螢光分光光度計獲得螢光發射光譜。測定610nm時的螢光、校正對照(不用藥物)樣本的螢光、並與用已知濃度的HB和2-BA-2-DMHB溶液得到的標準螢光-強度曲線相比較。
實施例7光敏劑定位在37℃將生長於玻璃上的細胞在含4μM HB的DMEM中培養15分鐘，或在含4μM 2-BA-2-DMHB的DMEM中培養6小時。通過Nikon FXA顯微鏡目測檢驗螢光以確定光敏劑定位的位置(激發波長＝400-450nm，發射波長＝600-650nm)。
培養和照射用含1％FBS的DMEM稀釋儲備的光敏劑-DMSO溶液。DMSO的最終濃度不超過1％(v/v)，在37℃將75-cm2燒瓶(Costar，Cambridge，MA，USA)中的指數生長HeLa細胞在黑暗處用2-BA-2-DMHB培養6小時或用HB在黑暗處培養15分鐘。用PBS中的0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分離細胞，離心-衝洗以去除無限制的染色。然後將細胞轉移至35-mm平皿(Costar)，1ml英寸皿含3×10s細胞，用不同劑量的光源照射。光源為紅光處理儀(Institute of Electronic Academia Sinica，China)，其在樣品處的總功率輸出(600-700nm時90％以上)為50mW cm-2，用BTY-8204放射計(中國北京太陽能研究所)測得。照射後立即向每一平皿中加入含7.5％FBS的2mlDMEM。然後按如下確定部分細胞的存活、並將剩餘的細胞置於培養基中培養直至它們可進行核染色、DNA裂解和流動血細胞計數分析的檢查。
細胞存活研究通過MTT測定法判斷細胞存活[11，15，16]。將PDT-處理的細胞轉移至平底96-孔平板(Costar)中，每孔中的100μl含1×104細胞，在37℃將此細胞置於CO2培養箱中培養20小時。通過向每一孔中加入10μl MTT(10mgml-1)測定存活力，再在37℃將該混合物培養4小時。然後用二甲基亞碸代替培養基以溶解甲譖(formazan)晶體。在室溫下搖動這些平板10分鐘並立即在595nm下，Bio-Rad型3550微板讀數器(Richmond，CA.USA)上讀數。在12個複製品中測定樣品、每一實驗至少重複兩次。PDT處理的細胞的存活符合正常標準，可與單獨用光敏劑培養的細胞抗衡。
分別評定每一化合物的暗毒性，然後進行相似的細胞暴露於1m分級劑量15分鐘或暴露於2-BA-2-DMHB 2小時的步驟。當細胞露置光敏劑或含有光敏劑時，要小心謹慎以避免整個過程中細胞見光。
在MTT測定法中，將光電位定義為在暗處達到體外LD50所需的化合物與在24J cm-1紅光時達到LD50所需的化合物的摩爾濃度比[8]。
編程核的鑑別在37℃將處理過的細胞和對照細胞置於含5％FBS的DMEM中培養24小時，然後通過分離和離心收集、並置於含5μM HO342的生長培養基中(不含FBS)培養5分鐘。採用Nikon FxA顯微鏡通過螢光顯微鏡檢查核裂解。在420-450nm時用EM監測得到EX波長為330-380nm[14]。活細胞和死亡的細胞兩者都具有螢光；通過出現核的凝聚或裂解的明亮螢光區域可確定編程細胞(17)。
DNA電泳通過一些改進後，按前面所述的方法提取DNA[18]。用0.2％胰蛋白酶/0.5mM EDTA溶液分離細胞(2×106)、用PBS衝洗並通過離心使成顆粒。將細胞顆粒懸浮於含0.5％十二烷基硫酸鈉(SDS)、2mM EDTA、100mg/mlK蛋白酶，和SOmM Tris-HC緩衝劑(pH8.0)的溶解緩衝液中。在37℃溶解24小時後，用等體積的水飽和的苯酚/氯仿/異戊基醇(25∶24∶1)提取DNA。收集含水相，用0.5體積醋酸銨和2.5體積冷的無水乙醇沉澱DNA，並在-20℃儲存過夜。將DNA溶解在TE(1M Trls-HCI緩衝液中的0.5M EDTA，pH8.0)並在37℃用不含脫氧核糖核酸酶的核糖核酸酶A(100mg/ml)培養1小時。在60V將樣品置於含0.5μg ml-1溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳3小時，並通過UV透照法進行目測檢驗。
DNA裂解的流動血細胞計數檢測將碘化丙錠(PI)染色技術用於確定細胞DNA的情況[19]。用冰冷的PBS衝洗細胞兩次，然後使滲透並於4℃將其固定在80％乙醇中達24小時。用PBS衝洗細胞兩次，並於37℃將其懸浮在含核糖核酸酶A(100mg/ml)的PBS中30分鐘。此刻將PI溶液(PBS中的10mg/ml)加入核糖核酸酶溶液中的細胞中，於4℃繼續培養30分鐘。之後，通過Epics XL流動細胞計數器(Coulter，USA)對細胞進行分析。結果以表現出DNA的亞二倍體量(＜2N)的細胞佔所分析的細胞的總數的百分比表示。
實施例8.結果反應性氧類的產率通過DPA漂白法測定HB(0.76)和2-BA-2-DMHB(0.44)的單線態氧的產率，如表2所示。
表2DMSO中光敏劑的量子產率化合物 量子產率相對的量子產率(1O2)(O2-)HB 0.7612-BA-2-DMHB0.442.7在此採用DMPO自旋-捕獲ESR測量法以證實HB和2-BA-2-DMHB的光敏作用所產生的過氧化物陰離子基團的形成。結果顯示2-BA-2-DMHB產生O2的能力強於HB產生O2的能力(表2)。
分配比和定位採用0-5μM的細胞外的藥物濃度，我們觀察到HB的分配比為49.1±2.2、2-BA-2-DMHB的分布比為107.2±4.3。這些結果顯示，當使用等摩爾水平的藥物時，2-BA-2-DMHB的細胞內水平約兩倍於HB的細胞內水平。
螢光顯微鏡檢測表明，對於HB，出現了很顯著的溶酶體攝取，而內質網(ER)染色也較明顯，而2-BA-2-DMHB的分配則主要在ER(圖2)。
光細胞毒性和致死劑量光敏劑的劑量產生50％細胞毒性，從每一光敏劑的存活曲線可判斷黑暗或光亮中的LD50。HB和2-BA-2-DMHB的體外暗毒性和光毒性的存活曲線如圖3所示。黑暗中HB的LD50約為20μM，而2-BA-2-DMHB的LD50大於100μM(圖3a)。因此，2-BA-2-DMHB較HB具有更低的細胞毒性。
在將HeLa細胞單獨暴露於紅光時未見誘導細胞毒性(圖3b，c)，將相應的MTT光密度當作100％細胞存活。為了將我們的結果與Estey的結果相比[8]，我們選擇24J cm-2作為試驗劑量。在此光劑量時，HB的LD50約為2μM，其光電位係數為10，這與EMT6 Ed小鼠腫瘤細胞上的HB相等[8]。然而在此光劑量時，2-BA-2-DMHB在0.25-0.5μM(約0.04μM)濃度範圍內產生了50％光毒性。因此，2-BA-2-DMHB具有大於250倍的光電位係數。
Hoechst 33342核染色使用核染色Hoechst 33342研究染色細胞的形態學。在缺乏光照射時，2-BA-2-DMHB處理的HeLa細胞的核保持完整，類似於正常細胞的核(圖4a，b)。然而，在照射後24小時後的2-BA-2-DMHB-感光的細胞內(LD70)發現了編程核(圖4c)。
凝膠電泳核小體間的連接區域的DNA裂解產生許多大小為180-200鹼基對的片段是編程細胞死亡的一個典型證明。採用瓊脂糖凝膠電泳以檢驗編程DNA片段的產生。圖5表示分別在LD70和LD90用HB和2-BA-2-DMHB處理後24小時在HeLa細胞內觀察到的特徵性的DNA梯(圖5，2.3道和5，6道)。當將細胞單獨暴露於光敏劑時未觀察到DNA梯(圖5，1和4道)。在照射後3小時和6小時未檢測到明顯的DNA梯(數據未顯示)。
流動細胞計數分析通過流動細胞計數來分析用HB和2-BA-2-DMHB處理的細胞。結果表明在感光的細胞中出現了亞倍體細胞群(圖6)。編程HeLa的百分數隨照射後的培養時間而增加(圖7)。2-BA-2-DMHB誘導的編程細胞死亡較HB更快。還發現只有當編程HeLa的百分比大於20％時才能檢測到明顯的DNA梯。
結果人們認為單線態氧主要引起光動力學作用誘導的細胞死亡[22，23]。然而，有趣的是本研究中單線態氧產率(表2)與光電位沒有太大的關聯。而2-BA-2-DMHB的單線態氧產率大於HB的一半，2-BA-2-DMHD的O2-產率為HB O2-的2.7倍或許在竹紅菌素光敏作用誘導的細胞死亡中起著重要的作用。而且，當使用等摩爾藥物時，2-BA-2-DMHB的細胞內水平大約兩倍於HB；這或許是為什麼2-BA-2-DMHB較HB具有更優越的光敏作用的原因之一。
實施例9現在認為誘導快速編程反應的能力在PDT成功治療癌症中很重要[25]。上述實施例證明HB和2-BA-2-DMHB誘導了HeLa細胞中的編程細胞死亡，正如DNA片段的Hoechst 33342核染色、瓊脂糖凝膠電泳和流動細胞計數檢測所證實的(圖4-6)。編程HeLa的百分數隨照射後的培養時間而增加。照射後3小時和6小時沒有明顯的典型DNA梯，但在24小時後很清楚，這提示通過酶的方法導致了DNA裂解而不是通過對DNA的直接光化學損害而產生的[11，26]。這些實施例還表明HB主要定位在溶酶體的網狀組織和內質網，而2-BA-2-DMHB主要定位在內質網。內質網和線粒體兩者都是細胞中的Ca2+庫[27]。細胞中的反應性氧類可損害ER和線粒體中的Ca2+運輸系統，導致細胞內的Ca2+內穩態的瓦解和持續的Ca2+增加，最終引起編程細胞死亡[28]。
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權利要求
1.一種組合物，包括具有下列結構的氨基取代的脫甲氧竹紅菌素衍生物 其中，R1、R2、R3、R4為OCH3、NHCH2Ar或NHCH(CH2)n，其中Ar為苯基或吡啶基，-CH(CH2)n為脂環基，n＝3、4、5、6。
2.根據權利要求1的組合物，其中R1和R2為OCH3，R3和R4為OCH3、NHCH2Ar或NHCH2(CH2)nAr，Ar為苯基、吡啶基、萘基、多環芳香部分或雜環部分，n為0-12。
3.一種製備脫甲氧竹紅菌素的方法，包括將竹紅菌素溶解在含脂族胺的溶劑中，攪拌所得到的溶液；除去溶劑，得到殘餘物；洗滌殘餘物；並分離殘餘物。
4.根據權利要求3的方法，其中分離殘餘物包括採用薄層色譜法分離殘餘物。
5.根據權利要求3的方法，其中竹紅菌素為竹紅菌甲素或竹紅菌乙素。
6.根據權利要求3的方法，其中脂族胺為環戊胺、環己胺、苄胺、3-吡啶基甲胺或4-吡啶基甲胺。
7.根據權利要求3的方法，其中脂族胺為環丁胺、組胺、2-噻吩甲胺、2-吡咯甲胺或色胺。
8.根據權利要求3的方法，其中溶劑為苯、吡啶、環己烷或1，4-二氧六環。
9.根據權利要求3的方法，其中溶劑為氯苯、甲苯、己烷、石油醚、四氫呋喃或N，N-二甲基甲醯胺。
10.一種治療方法，包括給予脫甲氧竹紅菌素衍生物，將脫甲氧竹紅菌素衍生物暴露於預定波長的光源而激活脫甲氧竹紅菌素衍生物。
11.根據權利要求10的方法，其中竹紅菌素為具有下列結構的氨基取代的脫甲氧竹紅菌素衍生物 其中，R1、R2、R3、R4為OCH3、NHCH2Ar或NHCH(CH2)n，Ar為苯基或吡啶基，-CH(CH2)n為脂環烴基團，n＝3、4、5、6。
12.根據權利要求11的方法，其中R1、R2、R3和R4為OCH3或NHCH2(CH2)nAr，Ar為苯基、萘基、多環芳香部分或雜環部分，n為0-12。
13.根據權利要求10的方法，其中竹紅菌素為2-丁基氨基-2-脫甲氧-竹紅菌乙素。
14.一種治療組合物，包括2-丁基氨基-2-脫甲氧-竹紅菌乙素。
15.一種光動力學治療方法，包括給予有效量的含2-丁基氨基-2-脫甲氧-竹紅菌乙素的組合物。
16.一種治療方法，包括給予2-丁基氨基-2-脫甲氧-竹紅菌乙素。
17.一種光動力學治療方法，包括給予一種包含具有下列結構之一的化合物的組合物 其中R1、R2、R3、R4為OCH3或丁基氨基。
18.一種製備2-丁基氨基-2-脫甲氧-竹紅乙素的方法，包括將竹紅乙素溶解在含正丁胺的溶劑中；除去溶劑，得到殘餘物；洗滌殘餘物；並分離殘餘物。
全文摘要
本發明涉及用於光動力學療法的方法和組合物，公開了新的苝醌衍生物、包含苝醌衍生物和結合劑的綴合物，以及使用這些組合物的治療方法。本發明涉及具有光動力學活性的光敏劑領域。它們具有強的光動力學活性和低的暗毒性，這使得它們成為較HPD更有效的抗癌和抗AIDS病毒的光動力學製劑。
文檔編號C07C213/02GK1541201SQ01821343
公開日2004年10月27日 申請日期2001年10月24日 優先權日2000年10月25日
發明者張曼華, 徐尚傑, 吳韜, 陳申, 沈濤 申請人:阿爾塔切姆法爾馬有限公司, 中國科學院感光化學研究所