一種煙醯胺的製備方法與流程

2024-04-14 01:54:05 2

1.本發明涉及發酵工程技術領域，具體而言，涉及一種煙醯胺的製備方法。


背景技術：

2.煙醯胺，化學名為3-吡啶甲醯胺，分子式c6h6n2o，是b族維生素，廣泛存在於自然界中，主要來源於穀類食品以及肉類食品等。煙醯胺是煙醯胺腺嘌呤二核苷酸和煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的重要組成部分，主要作用為生物脫氫酶的輔酶。有研究表明煙醯胺可以減緩皮膚衰老，改善皮膚暗淡等功能，具有良好的美白以及保溼作用，在化妝品領域應用廣泛；另外，煙醯胺也可以作為飼料添加劑提高牲畜的生長速率以及抗病能力，在飼料添加劑領域需求很大。
3.煙醯胺可由化學合成法製備，主要以3-甲基吡啶先氧化合成煙酸，然後通過氫氧化銨作用脫水合成煙醯胺。該方法製備的煙醯胺收率低、純度低且反應條件苛刻，不備大眾所接受。生物轉化法具備特異性高、綠色環保、反應條件溫和及無需多步分離純化等優點，目前已經受到了廣泛的關注。
4.目前，生物轉化法最多的還是以3-氰基吡啶為底物，通過腈水合酶催化獲得煙醯胺。中國專利cn 106367447 a公開了一種煙醯胺的製備方法，獲得產腈水合酶的菌株，進而以3-氰基吡啶為底物轉化合成煙醯胺，反應條件溫和並且煙醯胺產量以及純度明顯有所提高。但是3-氰基吡啶主要由化工合成，具有一定的毒性，閃點較低容易發生自然。而煙醯胺主要應用在食品、保健品、化妝品等領域，少量的3-氰基吡啶殘留對產品質量產生了極大的影響，並且底物價格昂貴、來源少，不利於大規模工業生產。因此，創建一條底物廉價易得，且為生物基來源，無毒無害，綠色環保的煙醯胺生產路線迫在眉睫。
5.鑑於此，特提出本發明。


技術實現要素：

6.本發明的目的在於提供一種煙醯胺的製備方法，該方法通過控制天冬氨酸以及甘油流加能夠得到高純度、高產量煙醯胺。
7.本發明是這樣實現的：
8.本發明提供了一種煙醯胺的製備方法，包括如下步驟：
9.在工程菌的發酵液中流加天冬氨酸與甘油，通過發酵生成煙醯胺；
10.天冬氨酸的流加速率為5-30g/(l*h)，天冬氨酸與甘油的添加量的比例為0.5-2:1；
11.工程菌為能夠表達天冬醯胺合成酶、天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合成酶和吡啶甲酸脫羧酶的菌株。
12.在一些實施方式中，天冬氨酸的流加速率為10-20g/(l*h)。
13.在一些實施方式中，天冬氨酸的流加速率為12-15g/(l*h)。
14.在一些實施方式中，天冬氨酸與甘油的添加量的比例為0.9-1.5:1。
15.在一些實施方式中，天冬氨酸與甘油的添加量的比例為0.9-1.1:1。
16.在一些實施方式中，在發酵過程中，天冬氨酸的添加總量為100-250g/l。
17.在一些實施方式中，天冬氨酸的添加總量為165-175g/l。
18.在一些實施方式中，發酵過程中的ph控制在5.5-8.0。
19.在一些實施方式中，發酵過程中的ph控制在6.5-7.0。
20.在一些實施方式中，發酵過程中的發酵溫度為25-35℃。
21.在一些實施方式中，發酵溫度為28-30℃。
22.在一些實施方式中，工程菌為重組大腸桿菌，重組大腸桿菌中含有編碼天冬醯胺合成酶、天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合成酶和吡啶甲酸脫羧酶的基因。
23.在一些實施方式中，工程菌的發酵液的製備方法：將工程菌的種子液接種至培養基中發酵，至發酵液中工程菌的濃度為od600nm＝20時，加入誘導劑，即得工程菌的發酵液。
24.在一些實施方式中，培養基包括改良tb培養基。
25.在一些實施方式中，改良tb培養基的成分包括12g/l蛋白腖、24g/l酵母粉、10g/l甘油、2.31g/l磷酸二氫鉀和12.54g/l磷酸氫二鉀。
26.在一些實施方式中，工程菌的發酵液的發酵溫度為37℃，ph＝6.5-7.0。
27.在一些實施方式中，誘導劑包括異丙基
–
β-d-半乳糖苷，誘導劑的濃度為0.5mm。
28.本發明具有以下有益效果：
29.本發明以天冬氨酸為底物，利用重組大腸桿菌發酵代謝合成煙醯胺，通過控制天冬氨酸和甘油的比例以及流加的速度，獲得高純度、高產量的煙醯胺發酵液。底物天冬氨酸廉價易得，且大多數為生物基來源，不依賴於石化產品，屬於可再生資源，此外，由於它的天然屬性，在食品、保健品、化妝品領域更易於被消費者認可接受。
附圖說明
30.為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對範圍的限定，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他相關的附圖。
31.圖1為本發明的煙醯胺生物合成路線圖；
32.圖2為實驗例中天冬氨酸的標準曲線圖；
33.圖3為實驗例中煙醯胺的標準曲線圖；
34.圖4為實驗例中3-氨基甲醯吡啶甲酸標準曲線圖。
具體實施方式
35.為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。
36.本發明採用的煙醯胺的合成途徑如圖1所示，其是在天冬醯胺合成酶、天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合成酶和吡啶甲酸脫羧酶的催化下將天冬氨酸轉化為煙醯胺，並且反應過程
中需要大量atp以及甘油醛3-磷酸的參與反應，因此還需要同時加入甘油。本發明的發明人經過大量創造性勞動發現，高濃度甘油條件下，大量的atp用於菌體的自身代謝生長，用於合成煙醯胺的atp極少，煙醯胺的產量很低，且中間產物甘油醛3-磷酸的積累會抑制相關酶活；而極低甘油條件下，菌體的代謝基本停滯，不能夠滿足煙醯胺合成所需的atp以及甘油醛3-磷酸，煙醯胺的產量也很低。此外，天冬氨酸作為發酵底物，而且是酸性胺基酸，隨著天冬氨酸的加入，為了維持一定的ph需要不斷加入氨水調控ph。當天冬氨酸加入量過多時，發酵液中積累大量的天冬氨酸以及銨根離子，對菌體代謝以及相關酶酶活產生抑制，煙醯胺產量很低；當天冬氨酸加入量很少時，發酵液中缺乏底物天冬氨酸以及銨根離子，煙醯胺合成受阻。
37.基於上述影響因素，本發明提供了一種煙醯胺的製備方法，其通過控制天冬氨酸和甘油的比例及其流加的速度、發酵溫度以及發酵ph，可以減少中間產物的積累，提高菌體的活性以及減少相關酶的底物抑制現象，有利於煙醯胺的積累。該方法包括在工程菌的發酵液中流加天冬氨酸與甘油，經發酵生成煙醯胺。其中工程菌為能夠表達天冬醯胺合成酶、天冬氨酸氧化酶、喹啉酸合成酶和吡啶甲酸脫羧酶的菌株。
38.上述煙醯胺的製備方法包括以下步驟：
39.1、上述工程菌的構建方法為：將天冬醯胺合成酶、天冬氨酸氧化酶喹啉酸合成酶和吡啶甲酸脫羧酶的基因連接到雙啟動子表達載體上，然後將獲得的重組表達載體導入至大腸桿菌中，即獲得重組大腸桿菌。
40.可選地，天冬醯胺合成酶來源於escherichia coli，genbank編號uni59343.1；天冬氨酸氧化酶來源於kibdelosporangiμm sp.，genbank編號ctq91828.1；喹啉酸合成酶來源於thermodesμlfobiμm narugense，genbank編號aee15319.1；吡啶甲酸脫羧酶來源於alcaligenes faecalis，genbank編號ars01287.1。
41.可選地，天冬醯胺合成酶的胺基酸序列如seq id no.1；天冬氨酸氧化酶的胺基酸序列如seq id no.2所示；喹啉酸合成酶的胺基酸序列如seq id no.3所示；吡啶酸脫羧酶的胺基酸序列如seq id no.4所示。
42.可選地，雙啟動子表達載體包括petduet-1和pcdfduet-1質粒。較為優選地，petduet-1裝載天冬醯胺合成酶基因和天冬氨酸氧化酶基因，pcdfduet-1裝載喹啉酸合成酶基因和吡啶甲酸脫羧酶基因。
43.可選地，宿主菌為大腸桿菌escherichia colibl21(de3)。質粒轉化大腸桿菌的步驟包括：將上述兩種質粒轉化入大腸桿菌escherichia colibl21(de3)，利用氨苄青黴素以及硫酸鏈黴素平板篩選陽性克隆，即獲得重組大腸桿菌。
44.2、用改良的tb培養基培養重組大腸桿菌，直至菌體od600nm＝20時，降低溫度、調節ph以及加入誘導劑，並開始流加底物天冬氨酸以及甘油的混合液。
45.可選地，上述改良的tb培養基的製備方法為：將12g/l蛋白腖、24g/l酵母粉、10g/l甘油、2.31g/l磷酸二氫鉀、12.54g/l磷酸氫二鉀溶解在水中，121℃滅菌後用氨水調ph＝7.0。
46.可選地，上述重組大腸桿菌的培養溫度36-38℃，ph為6.5-7.2。
47.可選地，當菌體od600nm＝20時，降低培養溫度使混合液與發酵液反應，此時反應溫度為25-35℃，較為優選地，反應溫度為28-30℃；ph控制在5.5-8.0，較為優選地ph控制在
6.5-7.0。
48.可選地，誘導劑為終濃度為0.1-1mm的iptg。
49.可選地，在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.5-2：1；較為優選地，甘油與天冬氨酸總量比例為0.9-1.5；更為優選地，甘油與天冬氨酸總量比例為0.9-1.1。
50.可選地，天冬氨酸流加速率控制在5-30g/(l*h)，較為優選地，天冬氨酸流加速率控制在10-20g/(l*h)，更為優選地，天冬氨酸流加速率控制在12-15g/(l*h)。
51.可選地，天冬氨酸添加總量為100-250g/l，較為優選地，天冬氨酸添加總量為165-175g/l。
52.3、採用hplc檢測分析發酵液中的天冬氨酸剩餘量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量、煙醯胺產量以及利用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中甘油含量。
53.本發明通過控制天冬氨酸和甘油的比例以及流加的速度，提高相關酶活力，避免發酵液中副產物的產生，獲得高純度、高產量的煙醯胺發酵液，減少後端的純化成本，同時最終發酵液中甘油濃度小於1g/l，節約發酵成本，避免資源浪費，可應用於大規模工業化生產，滿足市場需求。
54.以下結合實施例對本發明的特徵和性能作進一步的詳細描述。
55.以下實施例中所涉及的菌株及質粒為：購自novagen公司的petduet-1質粒、pcdfduet-1質粒、escherichia coli bl21(de3)、escherichia coli top10。所採用的重組大腸桿菌的發酵液的培養過程如下：
56.1、將重組大腸桿菌置於lbg培養基中，該lbg培養液包括蛋白腖10g，酵母提取物5g，nacl 10g，甘油5g，純水定容至1.0l，在37℃、ph7.0的條件下進行過夜培養，得到重組大腸桿菌種子液。
57.2、將上述重組大腸桿菌種子液轉接至改良的tb培養基(12g/l蛋白腖、24g/l酵母粉、10g/l甘油、2.31g/l磷酸二氫鉀、12.54g/l磷酸氫二鉀，121℃滅菌，用氨水調ph＝7.0)中培養，發酵條件為37℃，ph＝7.0。當發酵液中的菌體培養至od600nm＝20，加入終濃度為0.5mm iptg進行誘導。
58.實施例1
59.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
60.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為100g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
61.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
62.實施例2
63.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
64.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為200g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
65.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨
酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
66.實施例3
67.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
68.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.5，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
69.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
70.實施例4
71.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
72.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為2，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
73.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
74.實施例5
75.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
76.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在5g/(l*h)。
77.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
78.實施例6
79.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
80.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在30g/(l*h)。
81.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
82.實施例7
83.(1)誘導溫度控制在25℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
84.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
85.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
86.實施例8
87.(1)誘導溫度控制在35℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
88.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
89.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
90.實施例9
91.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在5.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
92.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
93.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
94.實施例10
95.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在8.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
96.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
97.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
98.實施例11
99.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
100.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為165g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
101.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
102.實施例12
103.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
104.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬
氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
105.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
106.實施例13
107.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
108.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.9，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
109.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
110.實施例14
111.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
112.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
113.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
114.實施例15
115.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
116.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.9，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在12g/(l*h)。
117.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
118.實施例16
119.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
120.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在14g/(l*h)。
121.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
122.實施例17
123.(1)誘導溫度控制在28℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
124.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
125.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
126.實施例18
127.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
128.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
129.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
130.實施例19
131.(1)誘導溫度控制在28℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
132.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.9，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
133.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
134.實施例20
135.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
136.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在12g/(l*h)。
137.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
138.實施例21
139.(1)誘導溫度控制在28℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
140.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
141.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
142.實施例22
143.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混
合液，發酵過程中用氨水控制ph。
144.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為170g/l，天冬氨酸流加速率控制在12g/(l*h)。
145.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
146.實施例23
147.(1)誘導溫度控制在28℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
148.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
149.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
150.實施例24
151.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
152.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為0.9，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在15g/(l*h)。
153.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
154.實施例25
155.(1)誘導溫度控制在28℃，ph控制在6.5，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
156.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1.1，天冬氨酸添加總量為175g/l，天冬氨酸流加速率控制在12g/(l*h)。
157.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
158.實施例26
159.(1)誘導溫度控制在30℃，ph控制在7.0，並開始投加底物天冬氨酸以及甘油的混合液，發酵過程中用氨水控制ph。
160.(2)在混合液中甘油與天冬氨酸總量比例為1，天冬氨酸添加總量為165g/l，天冬氨酸流加速率控制在12g/(l*h)。
161.(3)當底物流加結束後，繼續發酵至煙醯胺產量不再變化，用hplc檢測底物天冬氨酸剩餘量、煙醯胺產量、3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量。用sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中剩餘甘油濃度。
162.實驗例
163.(1)天冬氨酸的標準曲線繪製
164.稱取天冬氨酸標準樣0.1g，移至50ml容量瓶中，用稀氫氧化鈉溶解定容，後取0.5ml、1ml、2ml、4ml、5ml分別移至5個10ml容量瓶中，用稀氫氧化鈉定容，分別獲得濃度為0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.8g/l、1g/l，然後用opa衍生法檢測天冬氨酸濃度，通過hplc進行檢測，色譜條件：色譜柱為c18，流動相a為0.1％甲酸水，流動相b為甲醇，流動相a：流動相b(v:v)＝20：80，流速：1ml/l，柱溫：30℃，波長：333nm，進樣體積：10μl，保留時間：11min，天冬氨酸出峰時間約為6.6min，以濃度(g/l)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪製天冬氨酸標準曲線，結果如圖2所示，y＝1
×
107x-428227，r2＝0.9999(r2是線性擬合常數)。
165.opa衍生劑：10mg opa加入100μl甲醇，然後加入900μl 0.4mph＝10.0硼酸緩衝液，最後加入50μlβ-巰基乙醇，混勻。
166.取400μl天冬氨酸檢測樣品加入100μl opa衍生劑，25℃條件下反應2min後，用hplc檢測。
167.(2)煙醯胺的標椎曲線繪製
168.稱取煙醯胺標準樣0.1g，移至50ml容量瓶中，用水溶解定容，取0.5ml、1ml、2ml、4ml、5ml分別移至6個10ml容量瓶中，用水溶解定容，分別獲得濃度為0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.8g/l、1g/l的標準樣品，分別通過hplc進行檢測，色譜條件：色譜柱為c18，流動相a為0.1％甲酸水，流動相b為甲醇，流動相a：流動相b(v:v)＝90：10，流速：1ml/l，柱溫：30℃，波長：259nm，進樣體積：10μl，保留時間：11min，煙醯胺出峰時間約為5.2min，以濃度(g/l)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪製煙醯胺標準曲線，結果如圖3所示，y＝2
×
107x-106369，r2＝0.9999(r2是線性擬合常數)。
169.(3)3-氨基甲醯吡啶甲酸的標椎曲線繪製
170.稱取3-氨基甲醯吡啶甲酸標準樣0.1g，移至50ml容量瓶中，用水溶解定容，取0.5ml、1ml、2ml、4ml、5ml分別移至6個10ml容量瓶中，用水溶解定容，分別獲得濃度為0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.8g/l、1g/l的標準樣品，分別通過hplc進行檢測，色譜條件與本實驗例中上述(2)中的色譜條件一致，3-氨基甲醯吡啶甲酸出峰時間約為3.1min，以濃度(g/l)為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪製喹啉酸標準曲線，結果如圖4所示，y＝2
×
107x-16964，r2＝0.9999(r2是線性擬合常數)。
171.(4)實施例1至實施例26發酵液中甘油濃度的測定
172.分別取2ml實施例1至實施例26獲得的發酵液，離心後，取1ml上清液分別移至20個50ml容量瓶中，用水稀釋定容，再經sba-40e生物傳感分析儀檢測發酵液中甘油濃度。
173.(5)實施例1至實施例26發酵液中煙醯胺、天冬氨酸、3-氨基甲醯吡啶甲酸濃度的測定分別取2ml實施例1至實施例26獲得的發酵液，離心後，取1ml上清液用水稀釋至不同的倍數，再經hplc檢測分析，得到該實施例中煙醯胺、天冬氨酸、3-氨基甲醯吡啶甲酸的濃度。
174.(6)實施例1至實施例26發酵過程中，天冬氨酸氧化酶以及喹啉酸合成酶酶活相對很高，其相對應的底物不會積累，而起限制性因素的酶為天冬醯胺合成酶以及吡啶甲酸脫羧酶。因此，發酵過程中只考慮天冬氨酸以及3-氨基甲醯吡啶甲酸的積累。
175.如表1所示的煙醯胺的產量，天冬氨酸剩餘量，3-氨基甲醯吡啶甲酸剩餘量都是根據相對應的標準曲線獲得；天冬氨酸利用率＝(煙醯胺產量*天冬氨酸相對分子質量)/(天冬氨酸添加量*煙醯胺相對分子質量)。
176.表1實施例1-26檢測數據表
177.[0178][0179]
通過表1的數據可以看出，不同的天冬氨酸和甘油的比例以及流加的速度，發酵溫度以及發酵ph對煙醯胺的生產具有重要影響。而本發明通過調控上述因素，最終可將165g/l以上天冬氨酸轉化為煙醯胺，煙醯胺產量達到150g/l以上，天冬氨酸利用率達到99％以上，甘油濃度小於1g/l，有利於工業化生產。
[0180]
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。