用於製備有機肥的菌劑及其應用的製作方法

2024-04-15 23:44:05 1

1.本發明涉及微生物和有機肥領域，具體涉及一種用於製備有機肥的菌劑及其應用。


背景技術：

2.我國是一個農業大國，農產品加工業也隨之較為繁榮，每年農業生產和農產品加工過程中都會產生大量的農產品廢棄物和副產品，對這些廢棄物和副產品的處理一直都是農業產業鏈中的一個重要環節。由於現代化農業生產過程中大量施用化肥和農藥，在農作物種植過程中經常出現土壤肥力下降、作物生長慢、產量低、病蟲害頻發等問題，經研究發現，施用有機肥能夠對土壤微生物群落結構進行調整，提高土壤的更新或恢復能力，提高土壤肥力。而在有機肥製備過程中，需要大量有機質原料，這又為農業廢棄物和副產品提供了很好的處理途徑。有機肥的推廣應用不僅可以解決現代農業生產中由於化肥和農藥的濫用帶來的問題，還可以實現廢棄物資源化和能源再利用的目標，對於農業產業鏈的完善和實現農業可持續發展具有重要意義。
3.然而，傳統的有機肥堆肥工藝耗時長，而且生產出的有機肥品質良莠不齊，不同工藝生產的有機肥中的營養成分含量和配比差別都較大，對於土質和病蟲害情況的改善效果也不理想。因此，亟需開發高效生產高質量有機肥的方法和產品。


技術實現要素：

4.本發明的目的是為了克服現有技術存在的傳統有機肥生產工藝耗時長、產品質量得不到保證的問題，提供一種用於製備有機肥的菌劑及其應用。本發明提供的菌劑能夠有效降低有機肥堆肥時間，改善有機肥中的菌群結構，提高有機肥的品質，而且採用本發明提供的菌劑製備的有機肥能夠有效改善土壤肥力和微生物群落結構，提高農作物產量的同時有效提高其抗病蟲害能力。
5.為了實現上述目的，本發明一方面提供一種用於製備有機肥的菌劑，所述菌劑中含有黑麴黴(aspergillus niger)和基質，其中，所述黑麴黴為保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴。
6.本發明第二方面提供一種有機肥，所述有機肥中有機質含量為45-50重量％，碳氮比在20以下，糞大腸菌群數＜3個/g，ph 7-8，全砷含量不超過7mg/kg，全汞含量不超過1mg/kg，全鉛含量不超過12mg/kg，全鎘含量不超過3mg/kg，全鉻含量不超過10mg/kg，且該有機肥中含有黑麴黴，優選所述黑麴黴為保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴。
7.本發明第三方面提供一種有機肥的製備方法，所述方法包括將有機肥原料與保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴或如前所述的菌劑混合，進行堆肥。
8.本發明第四方面提供如上所述的方法製備獲得的有機肥。
9.本發明第五方面提供如上所述的有機肥在促進植物生長、防治植物病害、調節土壤理化性質或調節土壤生物活性方面的應用。
10.通過上述技術方案，本發明能夠取得如下有益效果：
11.(1)本發明提供的菌劑用於製備有機肥時能夠有效降低堆肥時間，提高有機肥堆肥效率，而且該菌劑用量少、適用的原料範圍廣，十分利於該菌劑的大規模推廣應用；
12.(2)本發明提供的菌劑製備的有機肥中營養成分含量高，而且菌群結構得到良好改善，其中有益菌含量和豐度大幅提高，有害菌含量和豐度得到了很大程度的降低，說明本發明提供的菌劑非常適用於生產高品質有機肥；
13.(3)本發明提供的菌劑製備的有機肥能夠有效改善土壤的肥力和土壤中微生物的群落特徵，促進了土壤的更新和修復，有利於農業產業的健康、可持續發展。例如，該有機肥施用後，黑麴黴將於種植過程中繼續作用，有利於抑制植物種植過程中致病菌(包括尖鐮孢菌屬、黑粉菌、串珠鐮孢菌屬等)的生長，提高作物產量。
14.(4)採用本發明提供的菌株製備的有機肥進行農作物種植，不僅可以促進農作物生長，提高產量，而且還能提供農作物的抗病蟲害能力，有利於提高農業產業的經濟效益。
15.生物保藏
16.本發明提供的黑麴黴(aspergillus niger)，已於2021年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(縮寫為cgmcc)，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc no.22437。
附圖說明
17.圖1是實施例1中獲得的黑麴黴cgmcc no.22437的鏡下菌體形態圖；
18.圖2a-2c分別是實施例3中大桶堆肥試驗中空白對照組、陽性對照組i和實驗組在堆肥過程中的溫度變化曲線圖；
19.圖3是實施例3中大桶堆肥試驗中獲得的在不同堆肥時間時，不同配方有機肥樣品中真菌群落組成對比圖；
20.圖4是實施例3中大桶堆肥試驗中獲得的在不同堆肥時間時，不同配方有機肥樣品中細菌群落組成對比圖。
具體實施方式
21.在本文中所披露的範圍的端點和任何值都不限於該精確的範圍或值，這些範圍或值應當理解為包含接近這些範圍或值的值。對於數值範圍來說，各個範圍的端點值之間、各個範圍的端點值和單獨的點值之間，以及單獨的點值之間可以彼此組合而得到一個或多個新的數值範圍，這些數值範圍應被視為在本文中具體公開。
22.本發明中，「碳氮比」是指物料中碳元素與氮元素的重量比，即碳含量與氮含量的比值。其中，可以通過重鉻酸鉀容量法檢測確定物料中的碳含量，通過凱氏定氮法檢測確定物料中的氮含量。
23.本發明中，未作特殊說明的情況下，「碳氮比」和「c/n」是同一概念，可以互換使用。
24.本發明的發明人在研究的過程中分離獲得一株黑麴黴(aspergillus niger)，經試驗發現，該黑麴黴菌株纖維素酶產量較高，且將其用於有機肥製備時，能夠加速肥料腐熟，同時具有提高有機肥中有益菌群的豐度，改善有機肥中微生物群落分布的優點。該黑麴黴菌株已於2021年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，保藏編號
為cgmcc no.22437。
25.本發明一方面提供一種用於製備有機肥的菌劑，所述菌劑中含有黑麴黴和基質，其中，所述黑麴黴為保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴。
26.本發明提供的菌劑優選通過麩曲法製備，因此，該菌劑中的基質可以為本領域採用麩曲法製備黴菌菌劑時常用的(麩曲)物料。根據本發明的優選實施方式，其中，所述基質為麩曲。
27.優選地，所述基質(麩曲)中含有食品加工副產品和微量元素補充劑。
28.更優選地，所述食品加工副產品選自麩皮、豆粕、玉米皮、米糠、礱糠和稻殼中的至少一種。
29.更優選地，所述微量元素補充劑用於提供n、s、p、k、mg、mn和fe中的至少一種。
30.本發明中，對所述菌劑中黑麴黴的含量沒有特別限定。根據本發明的優選實施方式，其中，所述菌劑中，以活孢子計，所述菌劑中黑麴黴的含量為10
8-10
10
cfu/g。10
8-10
10
cfu/g是指在每克菌劑中，該黑麴黴孢子數的含量達到10
8-10
10
cfu的數量級水平。具體而言，108數量級水平是指大於等於1
×
108至小於1
×
109的範圍，例如1
×
108、5
×
108、9.99
×
108等均屬於「108數量級水平」。也即，本發明提供的菌劑中黑麴黴的含量可以為大於等於1
×
108cfu/g至小於1
×
10
11
cfu/g。
31.優選地，所述菌劑中還含有纖維素酶。優選所述纖維素酶的酶活為400-550u/g。更優選為450-500u/g。
32.根據本發明的一種優選實施方式，其中，所述菌劑可以通過以下方法製備獲得：將黑麴黴接種至麩曲原料中進行培養。
33.任意本領域現有用於黑麴黴培養的材料均可作為麩曲原料用於本發明提供的方法中。優選地，所述麩曲原料選自食品加工副產品。
34.更優選地，所述麩曲原料選自麩皮、豆粕、玉米皮、米糠、礱糠和稻殼中的至少一種。
35.根據本發明的一種優選實施方式，其中，以所述麩曲原料的總重量計，該麩曲原料中含有麩曲基質和微量元素補充劑。
36.優選地，所述麩曲基質中含有麩皮70-75重量％、豆粕5-15重量％、玉米皮10-20重量％，銨鹽(例如硫酸銨等無機銨鹽)1-3重量％。
37.所述微量元素補充劑用於提供黑麴黴培養過程中所需的微量元素，優選地，所述微量元素補充劑用於提供n、s、p、k、mg、mn和fe中的至少一種。
38.更優選地，所述微量元素補充劑選自尿素、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵和硫酸錳中的至少一種。
39.所述微量元素補充劑的用量沒有特別限制，可以根據實際培養需要進行調整。優選地，所述微量元素補充劑的總添加量為麩曲基質的0.01-0.5重量％。
40.優選地，在進行黑麴黴培養前，需要對所述麩曲原料的水分含量進行調整。優選水分含量為所述麩曲原料總重量的60-70重量％。
41.優選地，在進行黑麴黴培養前，先將所述麩曲原料於28-30℃靜置培養7-10天。
42.優選地，所述黑麴黴的麩曲接種方式可以採用任意本領域常用的接種方式進行。例如，可以挑取培養5-7天的黑麴黴固體平板上生長的孢子(例如用滅菌的接種環挑取)，將
其接種於經滅菌處理的麩曲上，從而完成黑麴黴的麩曲接種。
43.優選地，所述黑麴黴培養的條件可以包括：溫度28-30℃，時間7-10天。
44.優選地，所述黑麴黴培養的條件使得培養完成後收穫的成熟麩曲中，以活孢子數計，所述黑麴黴的含量為10
8-10
10
cfu/g。10
8-10
10
cfu/g是指在每克成熟麩曲中，該黑麴黴孢子數的含量達到10
8-10
10
cfu的數量級水平。也即，該成熟麩曲中黑麴黴的含量可以為大於等於1
×
108cfu/g至小於1
×
10
11
cfu/g。
45.更優選地，所述黑麴黴培養的過程中需要進行翻種的操作。「翻種」指的是在採用麩曲法製備黴菌菌劑過程中，對麩曲進行輕微翻動，使其保持均勻，避免結塊的操作。
46.根據本發明的一種優選實施方式，其中，所述黑麴黴培養的方式包括：將黑麴黴(孢子)接種至麩曲原料中，28-30℃培養7-10天。前3-5天中，每隔10-15h進行一次翻種。
47.本發明提供的菌劑可以是採用以上方法製備獲得的麩曲。即將該菌劑中僅含有黑麴黴cgmcc no.22437(孢子及其代謝產物)作為主要活性成分。或者，本發明提供的菌劑中還可以包含一定的輔料。例如輔助菌、硅藻土、二氧化矽、碳酸鈣等。
48.根據本發明的優選實施方式，其中，所述菌劑中還含有輔助菌。
49.優選地，所述菌劑中，以活細胞數或活孢子數計，所述黑麴黴與輔助菌的含量比為1：0.01-0.5。
50.本發明中，「輔助菌」指的是在本發明提供的菌劑中，除黑麴黴cgmcc no.22437外，根據應用需要，添加的其他菌種(例如生防菌等)。優選地，所述輔助菌選自芽孢桿菌屬(bacillus)、假單胞菌屬(pseudomonas)、酵母屬(saccharomyces)、假絲酵母屬(candida)、隱球酵母屬(cryptococcus)、麴黴屬(aspergillus)和木黴屬(trichoderma)中的至少一種。
51.更優選地，所述輔助菌選自側短芽孢桿菌(brevibacillus laterosporu)、枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(bacillus licheniformis)、巨大芽孢桿菌(bacillus megaterium)、蘇雲金芽孢桿菌(bacillus thuringiensis)、螢光假單胞菌(pseudomonas fluorescens)、綠針假單胞菌(pseudomonas chlororaphis)、畢赤酵母(pichia pastoris)、產朊假絲酵母(candida utilis)、羅倫隱球酵母(cryptococcus laurentii)、米麴黴(aspergillus oryzae)和綠色木黴(trichoderma viride)中的至少一種。
52.本發明提供的菌劑中，輔助菌可以單獨包裝，也可以與前述菌劑混合後包裝和使用。
53.本發明第二方面提供一種有機肥，所述有機肥中有機質含量為45-50重量％，碳氮比在20以下，糞大腸菌群數不超過5個/g，ph 7-8，全砷含量不超過7mg/kg，全汞含量不超過1mg/kg，全鉛含量不超過12mg/kg，全鎘含量不超過3mg/kg，全鉻含量不超過10mg/kg，且該有機肥中含有黑麴黴，優選所述黑麴黴為保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴。一般而言，在該有機肥中的黑麴黴主要以菌絲體形態存在。
54.優選地，所述有機肥中有機質含量為45-48重量％，碳氮比為16-20，糞大腸菌群數不超過3個/g，ph 7.5-8，全砷含量為5-6.5mg/kg，全汞含量為0.1-0.9mg/kg，全鉛含量為10-11mg/kg，全鎘含量為1-2mg/kg，全鉻含量為5-9mg/kg。
55.優選地，所述有機肥中不含蛔蟲(蛔蟲死亡率100％)。
56.本發明第三方面提供一種有機肥的製備方法，所述方法包括將有機肥原料與保藏編號為cgmcc no.22437的黑麴黴或如前所述的菌劑混合，進行堆肥。
57.根據本發明的優選實施方式，其中，所述有機肥原料中，n含量以元素計為1.6-2.8重量％，全磷含量為4.5-5.5重量％，全鉀含量為0.5-0.8重量％，總養分7-9重量％，有機質含量60-80重量％。其中，全磷含量以p2o5計，全鉀含量以k2o計。
58.優選地，所述有機肥原料中，碳氮比不超過35，優選碳氮比為25-30。
59.本發明提供的方法中對於有機肥原料的選擇沒有特別限制，任意本領域現有用於有機肥製備的物料均可適用於本發明。優選地，所述有機肥原料選自動物糞便、農業廢棄物、食品加工副產品、發酵生產副產品、廚餘垃圾和工業副產物中的至少一種。
60.更優選地，所述農業廢棄物選自農作物秸稈、稻草、樹皮、草和秸稈中的至少一種。
61.更優選地，所述食品加工副產品選自蔗渣、甘蔗濾泥、豆腐渣、葡萄皮渣、米糠、麩皮、穀氨酸渣、檸檬酸糟和豆粕中的至少一種。
62.更優選地，所述發酵生產副產品選自發酵濾渣、發酵殘餘菌絲體、菌泥、醪液、酒糟蛋白和可溶性酒精糟濾液中的至少一種。
[0063]「甘蔗濾泥」是指蔗糖廠製糖過程中，甘蔗汁的澄清工藝產生的副產品，其中含有甘蔗纖維、(少量)蔗糖、膠體物質、蛋白質等成分。根據甘蔗汁澄清工藝的不同，可以將甘蔗濾泥分為三類：石灰法甘蔗濾泥、碳酸法甘蔗濾泥和亞硫酸法甘蔗濾泥(簡稱「亞法濾泥」)。本發明提供的方法中可以採用以上三種甘蔗濾泥中的至少一種作為有機肥原料(之一)。考慮到不同種類的甘蔗濾泥中的營養成分、水分含量以及ph等對堆肥效果和有機肥品質的影響，根據本發明的一種特別優選的實施方式，可以選用亞硫酸法甘蔗濾泥作為(主要)有機肥原料。
[0064]
優選地，所述亞硫酸法甘蔗濾泥用作主要有機肥原料時，其含量可以佔有機肥原料總重量的85重量％以上。更優選為85-90重量％。
[0065]
更優選地，所述有機肥原料中還可以含有動物糞便(例如牛糞、雞糞、豬糞等)，微量元素補充劑(例如尿素、銨鹽等)，輔料(用於調節有機肥原料的含水量、降低濾泥粘性、提高透氣性、提供菌株生長所需環境等，例如農作物秸稈、蔗渣、樹皮、米糠、麩皮、草、秸稈、礱糠和稻殼等)等。
[0066]
進一步優選地，以甘蔗濾泥的重量為基準，所述動物糞便的含量可以為1-5重量％。所述微量元素補充劑的含量可以為0.1-1重量％，輔料的含量可以為5-20重量％。
[0067]
本發明的發明人在研究中還發現，本發明提供的菌劑只要少量添加即可獲得提高有機肥堆肥溫度，加速腐熟的效果。同時，對有機肥中的菌群群落組成結構帶來明顯改善。
[0068]
本發明提供的方法中，對於所述菌劑的用量沒有特別限制。根據本發明的優選實施方式，其中，以所述有機肥原料的總重量為基準，所述菌劑的添加量為0.01-0.5重量
‰
。
[0069]
優選地，所述菌劑的添加量使得所述有機肥原料與菌劑的混合物中，黑麴黴cgmcc no.22437的初始含量以活孢子數計為10
5-107cfu/g。10
5-107cfu/g是指在每克混合物中，該黑麴黴孢子數的含量達到10
5-107cfu的數量級水平。也即，該混合物中黑麴黴的含量可以為大於等於1
×
105cfu/g至小於1
×
108cfu/g。
[0070]
更優選地，所述菌劑的添加量使得所述有機肥原料與菌劑的混合物中，黑麴黴cgmcc no.22437的初始含量以活孢子數計為10
5-106cfu/g。
[0071]
任意本領域現有用於有機肥堆肥的方式和條件均可適用於本發明提供的方法中。根據本發明的優選實施方式，其中，所述堆肥的方式包括：溫度20-60℃，時間20-40天。
[0072]
優選地，所述堆肥的方式還包括當堆肥溫度達到60℃時進行翻堆以降溫的操作。翻堆是指在堆肥過程中對堆肥物料進行翻攪，以使其溫度分散均勻，避免局部溫度過高的操作。
[0073]
本發明第四方面提供如上所述的方法製備獲得的有機肥。
[0074]
本發明的發明人在研究的過程中還發現，通過上述方法獲得的有機肥中，n含量、全磷含量、全鉀含量和總養分含量相比於堆肥原料有所提高。該有機肥的其他特徵如前所述，在此不再贅述。
[0075]
根據本發明的優選實施方式，其中，相比於堆肥原料，所述有機肥中的n含量(以元素計)提高0.01-0.3重量％，全磷含量(以p2o5計)提高1-2重量％，全鉀含量提高0.1-0.3重量％。
[0076]
本發明的發明人在研究的過程中還發現，上述(由本發明提供的方法製備獲得的)有機肥在使用時能夠有效改善土壤中微生物群落分布，提高土壤肥力，改善土壤理化性質(例如提高土壤水分，降低粘性，疏鬆土壤，逐年提高土壤中有機質含量等)，在提高作物發芽率，促進植物生長方面具有良好的作用。同時，對於某些植物病蟲害還具有防治作用。
[0077]
本發明第五方面提供如前所述的有機肥在促進植物生長、防治植物病害、調節土壤理化性質或調節土壤生物活性方面的應用。
[0078]
根據本發明的優選實施方式，其中，所述植物病害選自甘蔗梢腐病和/或番茄枯萎病。
[0079]
以下將通過實施例對本發明進行詳細描述。應當能夠理解的是，以下實施例僅用於示例性地進一步解釋和說明本發明的內容，而不用於限制本發明。
[0080]
未作特殊說明的情況下，以下實施例中採用的試劑均購自正規化學或生物試劑供應商，純度為分析純。
[0081]
以下實施例中採用的培養基來源/製備方法如下：
[0082]
馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養基：購自北京奧博星生物技術有限責任公司。
[0083]
剛果紅-羧甲基纖維素培養基：
[0084]
配方：硫酸銨5g/l，磷酸二氫鉀1g/l，硫酸鎂0.5g/l，氯化鈉0.1g/l，氯化鈣0.1g/l，酵母浸粉0.2g/l，剛果紅0.2g/l，羧甲基纖維素鈉5g/l。
[0085]
製備方法：按照以上用量稱取試劑溶於去離子水中，調節ph至5.6，121℃高壓滅菌20min即獲得剛果紅-羧甲基纖維素液體培養基。在滅菌前加入瓊脂20g/l，即獲得剛果紅-羧甲基纖維素固體培養基。待滅菌後的剛果紅-羧甲基纖維素固體培養基冷卻至不燙手(約50℃)倒平板，冷卻後即獲得剛果紅-羧甲基纖維素培養平板。
[0086]
實施例1
[0087]
本實施例用於說明黑麴黴cgmcc no.22437的獲得和保藏。
[0088]
(一)菌株分離、純化和鑑定
[0089]
發明人自廣西崇左某糖廠採集的濾泥樣品中分離獲得一株黑麴黴菌株。具體分離純化步驟如下：
[0090]
稱取5g濾泥樣品，溶解於45ml無菌生理鹽水中混勻製成樣品溶液，而後採用稀釋
塗布平板法(稀釋度為10-1
、10-2
、10-3
)將稀釋後的樣品溶液均勻塗布於剛果紅-羧甲基纖維素培養平板。30℃培養4-5天，挑取透明圈明顯的，具有典型黴菌菌落特徵的單菌落。採用劃線法分離純化3次，獲得單個純化菌落。
[0091]
採用顯微鏡觀察純化菌落，根據菌體形態確定為黴菌菌株後，接種於pda斜面培養基中，進行形態鑑定。
[0092]
挑取pda斜面培養基中的黴菌菌株，採用點接種法接種於剛果紅-羧甲基纖維素培養平板，每個菌株點接種3個平行。30℃培養4-5天，挑選其中透明圈大的菌株，進行分子鑑定(委託上海生工生物工程股份有限公司進行its1序列檢測)。結果如下：
[0093]
ccgtgtctattataccctgttgcttcggcgggcccgccgcttgtcggccgccgggggggcgcctttgccccccgggcccgtgcccgccggagaccccaacacgaacactgtctgaaagcgtgcagtctgagttgattgaatgcaatcagttaaaactttcaacaatggatctcttggttccggcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataactaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggcatgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcccggcttgtgtgttgggtcgccgtccccctctccggggggacgggcccgaaaggcagcggcggcaccgcgtccgatcctcgagcgtatggggctttgtcacatgctctgtaggattggccggcgcctgccgacgttttccaaccattttttccaggttgacctcggatcaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataaggcggaggaatta(seq id no:1)
[0094]
本次篩選獲得1株黴菌菌株，其鏡下菌體形態如圖1所示，(最佳產酶期的)菌絲體生物學形態特徵如下：菌體呈圓形，整體緊實，周圍有較短輻射菌絲，直徑在60-120μm，中間緊實，外圍鬆散。綜合該菌株的形態學特徵、生理生化特徵以及分子鑑定結果，確定其為黑麴黴(aspergillus niger)。
[0095]
(二)菌株保藏
[0096]
以上實驗分離獲得的黑麴黴(aspergillus niger)菌株已於2021年5月27日保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號為cgmcc no.22437。
[0097]
實施例2
[0098]
本實施例用於說明本發明提供的菌劑的製備和特徵。
[0099]
(一)菌劑製備
[0100]
採用麩曲法進行黑麴黴菌劑製備，具體方法如下：
[0101]
麩曲原料製備：按照麩皮73重量％、豆粕10重量％、玉米皮15重量％、硫酸銨2重量％的比例配製麩曲基質。而後按照麩曲基質的總重量計，加入尿素0.15重量％，磷酸二氫鉀0.05重量％和硫酸鎂0.1重量％。混合均勻後，調節水分含量至45重量％左右(水添加量與麩皮重量的比值約為10:7)，於28℃靜置發酵10天，獲得麩曲原料。
[0102]
挑取採用pda斜面平板培養的實施例1中分離獲得的黑麴黴cgmcc no.22437，接種於麩曲原料中，進行培養。
[0103]
28℃條件下進行培養，其中，前96h中每12h進行一次翻種，避免結塊。培養10天，獲得成熟麩曲。該成熟麩曲即可作為菌劑使用。
[0104]
(二)菌劑特徵檢測
[0105]
黑麴黴含量測定：稱取1g成熟麩曲，加入300ml無菌水(含0.2體積％吐溫80)中混勻，40khz超聲處理30min，獲得孢子懸液。採用血球計數板進行對該孢子懸液進行計數。根
據計數結果計算獲得該成熟麩曲中黑麴黴活孢子數為6
×
109cfu/g。
[0106]
纖維素酶活力測定：稱取5g成熟麩曲，加入45ml無菌水中混勻，40℃水浴浸提1h，過濾後獲得粗酶液。採用cmc法檢測該粗酶液的纖維素酶活性。根據檢測結果計算獲得該成熟麩曲中纖維素酶活性為485
±
15u/g。
[0107]
實施例3
[0108]
本實施例用於說明採用本發明提供的菌劑採用甘蔗濾泥作為主要原料進行有機肥製備時的效果。
[0109]
本實施例中，參考ny 525-2012，採用重鉻酸鉀容量法對樣品中的c元素含量進行檢測，採用凱氏定氮法對樣品中的n元素含量進行檢測，並對樣品中的有機質含量和樣品碳氮比進行檢測和計算；採用分光光度法對樣品中的全磷含量(以p2o5計)進行檢測；採用火焰光度法對樣品中的全鉀含量(以k2o計)進行檢測；根據測得的氮含量(以n計)、全磷含量(以p2o5計)和全鉀含量(以k2o計)，對樣品中的總養分含量進行計算。
[0110]
(一)大桶堆肥效果評價
[0111]
以下實驗中採用的甘蔗濾泥購自中糧屯河糖業股份有限公司(梁河糖廠)，該甘蔗濾泥為亞硫酸法濾泥，ph約為7，含水量約為60重量％。
[0112]
(1)堆肥條件
[0113]
堆肥原料：甘蔗濾泥86.5重量％，蔗渣3.5重量％。以甘蔗濾泥的重量計，加入4重量％水稻秸稈(調節含水量、降低濾泥粘性、提高透氣性)，0.6重量％尿素，2重量％牛糞和4重量％米糠(提供菌株生長環境)。餘量為水。
[0114]
將堆肥原料按照上述比例混勻後，調節ph至7.2
±
0.2，調節含水量至60
±
2重量％，調節碳氮比(c/n)至約為30。經檢測，其中的有機質含量約為66.25重量％，該堆肥原料中的n含量約為1.99
±
0.17重量％，全磷含量約為4.87
±
0.09重量％，全鉀含量約為0.66
±
0.02重量％，總養分約為7.55
±
0.28重量％。
[0115]
採用高度30cm，直徑20cm的塑料桶進行大桶堆肥試驗，將堆肥原料中加入菌劑混勻後每桶裝料5kg，堆肥高度25cm，堆肥時間45天。
[0116]
按照加入的菌劑進行分組，每組設置3個平行：
[0117]
實驗組：加入實施例2獲得的成熟麩曲作為菌劑，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0118]
陽性對照組i：加入市售堆肥用菌劑(購自廣州市微元生物科技有限公司的堆肥發酵菌，其具有快速繁殖、快速分解有機質、降解蛋白、防臭、抑菌等功效，活細胞或活孢子(總)數約為2
×
10
10
cfu/g)，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0119]
陽性對照組ii：加入黑麴黴cgmcc no.5343(購自cgmcc，獲取方法可以參考cn201110367432.2，活孢子數約為7.1
×
109cfu/g)，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0120]
空白對照組：不加任何菌劑。
[0121]
對各組堆肥過程中的溫度進行監測，繪製溫度變化曲線(詳見圖2a-2c)
[0122]
從圖中可以看出，堆肥過程中高溫階段為第4-10天，其中實驗組(圖2c)的高溫階段溫度較陽性對照組i(圖2b)和空白對照組(圖2a)高3℃左右，且實驗組堆肥溫度高於40℃的時間較陽性對照組長約1.5天。這表明實驗組中採用的黑麴黴菌劑堆肥過程中黑麴黴生物活動活躍，快速成為優勢菌，縮短堆肥時間，有機肥無害化處理更徹底。
[0123]
(2)腐熟效果
[0124]
有機肥腐熟標準：c/n達到20以下，即可認為該有機肥已經腐熟。
[0125]
於以上大桶堆肥試驗過程中第14天和第27天對各組有機肥進行取樣，檢測並計算各組有機肥樣品中的氮含量(重量％)、碳含量(重量％)、有機質含量和c/n(c/n＝碳含量/氮含量)。結果如表1所示。
[0126]
表1
[0127][0128]
從表1中的數據可以看出，堆肥第27天時，加入本發明提供的菌劑進行堆肥的有機肥即已達到腐熟標準，而空白對照和陽性對照均未腐熟。由此說明了本發明提供的菌劑能夠加速有機肥堆肥速度，使得有機肥快速腐熟。
[0129]
(3)微生物群落組成
[0130]
採用如上大桶堆肥試驗對牛糞加入量不同的有機肥堆肥過程中微生物群落組成結構進行檢測(堆肥時間延長至90天)，以確定本發明提供的菌劑對有機肥中微生物群落組成結構的改善效果。
[0131]
低牛糞配方堆肥原料：甘蔗濾泥86.5％重量％，蔗渣3.5重量％。以甘蔗濾泥的重量計，加入4重量％水稻秸稈，0.6重量％尿素，2重量％牛糞和4重量％米糠。餘量為水。
[0132]
高牛糞配方堆肥原料：甘蔗濾泥84重量％，蔗渣3.4重量％。以甘蔗濾泥的重量計，加入4重量％水稻秸稈，0.6重量％尿素，6重量％牛糞和4重量％米糠。餘量為水。
[0133]
分別將以上堆肥原料按照上述比例混勻後，調節ph至7.2
±
0.2，調節含水量至60
±
2重量％，調節碳氮比(c/n)至約為30。經檢測，低牛糞配方堆肥原料中的有機質含量約為66.25重量％，以元素計，n含量約為1.99
±
0.17重量％，全磷含量約為4.87
±
0.09重量％，全鉀含量約為0.66
±
0.02重量％，總養分約為7.55
±
0.28重量％。高牛糞配方堆肥原料中的有機質含量約為75.91重量％，以元素計，n含量約為2.51
±
0.24重量％，全磷含量約為5.07
±
0.14重量％，全鉀含量約為0.71
±
0.03重量％，總養分約為7.99
±
0.58重量％。
[0134]
期間，第0天(即堆肥原料裝桶後)，第27天和第90天分別對堆肥物料進行取樣，通過高通量測序技術(委託上海美吉生物醫藥科技有限公司完成)檢測樣品中的細菌和真菌群落組成情況。結果詳見圖3(真菌群落組成)和圖4(細菌群落組成)。
[0135]
圖3和圖4中，「a1_0」、「a27_blank」和「a90_blank」分別為低牛糞配方空白對照組第0天樣品、第27天樣品和第90天樣品的檢測結果；「a27_con」和「a90_con」為低牛糞配方陽性對照組第27天樣品和第90天樣品的檢測結果；「a27_test」和「a90_test」為低牛糞配方實驗組第27天樣品和第90天樣品的檢測結果。「a2_0」為高牛糞配方空白對照組第0天檢測結果；「a27_test2」和「a90_test2」為高牛糞配方實驗組第27天樣品和第90天樣品檢測結果。
[0136]
從圖3和圖4可以看出，採用本發明提供的菌劑堆肥製作的有機肥中，微生物群落組成的變化較大，其中，作為堆肥過程中微生態環境重要組成成分，能夠分解纖維素和木質
素的高溫放線菌的豐度得到有效提高，尤其是作為高溫期分解纖維素和木質素優勢菌的高溫單孢菌(thermomonosporaceae)豐度較高，因此使用本發明提供的菌劑進行有機肥堆肥時的耗時較短，堆肥效率得以有效提高。而且通過對比還能看出，這些高溫放線菌的豐度在堆肥後期的豐度提高更多。
[0137]
從圖3和圖4中還可以看出，採用本發明提供的菌劑對非製作的有機肥中，有益菌(例如酵母屬等)豐度得到有效提高，而致病菌(如煙麴黴等)的豐度則有所降低。而且本發明提供的菌劑還促進了根瘤菌豐度的提高，這使得該有機肥在使用時能夠聯合固氮菌群，提高作物固氮酶基因的表達，從而促進作物生長。
[0138]
從圖3和圖4的結果中看，雖然與空白對照組相比，陽性對照組的樣品中微生物群落組成也有所變化，但是其微生物群落結構的優化效果比實驗組要差很多，例如對有益微生物和有害微生物豐度的調整、對根瘤菌豐度的提高程度等。這說明本發明提供的菌劑更適合用於有機肥堆肥使用。
[0139]
通過對比高牛糞配方和低牛糞配方的實驗組有機肥樣檢測結果，可以看出牛糞的添加比例的調整，對堆肥樣品微生物組成帶來明顯的差異。根據有機肥樣品的微生物群落組成特點，優先選擇低牛糞配方。
[0140]
(4)有機肥質量檢測
[0141]
參照有機肥標準ny 525-2012對以上大桶堆肥試驗中實驗組堆肥27天製備的低牛糞配方和高牛糞配方有機肥樣品進行質量檢測，結果顯示，該有機肥樣品符合該有機肥標準要求。進一步地檢測發現，有機肥樣品中還含有一定量的黑麴黴菌絲體。其中，低牛糞配方有機肥樣品的檢測結果如下：總養分》9.08重量％，n含量》2.02重量％，全磷含量》6.15重量％，全鉀含量》0.91重量％，全砷含量《5mg/kg，全汞含量《1mg/kg、全鉛含量《10.3mg/kg、全鎘含量《2.75mg/kg，ph 7.5左右，蛔蟲卵死亡率100％，糞大腸菌群數《3個/g。
[0142]
(二)工廠放大堆肥效果評價
[0143]
(1)堆肥速度和腐熟效果
[0144]
採用中糧糖業雲南梁河糖廠生產過程中產生的甘蔗濾泥為主要原料，在該廠附近開展堆肥示範試驗，該甘蔗濾泥為亞硫酸法濾泥，ph約為7，含水量約為70重量％。
[0145]
堆肥原料：甘蔗濾泥。以甘蔗濾泥的重量計，加入4重量％稻草(調節含水量、降低濾泥粘性、提高透氣性)，0.6重量％尿素，2重量％牛糞，4重量％蔗渣和4重量％米糠(提供菌株生長環境)。餘量為水。
[0146]
將堆肥原料按照上述比例混勻後，調節ph至7.2
±
0.2，調節含水量至60
±
2重量％，調節碳氮比(c/n)至約為30。經檢測，其中的有機質含量約為75重量％。
[0147]
在堆肥原料中加入菌劑混勻，堆成長、寬、高均為1m的堆肥垛進行堆肥，相鄰兩個垛的距離為1m。堆肥時間25天。堆肥過程中全程監控堆肥溫度，當溫度高於60℃時，採用翻車對其進行翻拋，以免發生局部溫度過高的問題。
[0148]
按照加入的菌劑進行分組，每組設置3個平行：
[0149]
實驗組：加入實施例2獲得的成熟麩曲作為菌劑，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0150]
陽性對照組i：加入市售堆肥用菌劑(購自廣州市微元生物科技有限公司的堆肥發酵菌，其具有快速繁殖、快速分解有機質、降解蛋白、防臭、抑菌等功效，活細胞或活孢子(總)數約為2
×
10
10
cfu/g)，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0151]
陽性對照組ii：加入黑麴黴cgmcc no.5343(購自cgmcc，獲取方法可以參考cn201110367432.2，活孢子數約為7.1
×
109cfu/g)，加入量為堆肥原料的0.1重量
‰
。
[0152]
空白對照組：不加任何菌劑。
[0153]
記錄各組在堆肥過程中的最高溫度，在堆肥第15天和第25天對各組有機肥進行取樣，檢測其中的有機質含量和c/n變化情況。結果詳見表2。
[0154]
表2
[0155][0156]
根據表2的結果可以看出，本發明提供的菌劑在工廠有機肥放大生產試驗中，對有機肥堆肥速度也有很明顯的提高效果，而且比現有市售黑麴黴的提高效果更好，25天即可實現有機肥腐熟，推廣應用該菌劑可以有效提高有機肥生產效率。
[0157]
實驗組堆肥25天的有機肥性狀特點：無惡臭味，顏色為黑褐色，無雜質，鬆散狀，溼時柔軟有彈性，幹時容易破碎。經檢測，該有機肥中蛔蟲死亡率100％，糞大腸菌群數＜3個/g，ph 7.6，全砷含量5.31mg/kg，全汞含量0.81mg/kg，全鉛含量9.32mg/kg，全鎘含量1.09mg/kg，全鉻含量7.05mg/kg。
[0158]
(2)種植試驗
[0159]
在甘蔗種植過程中按照以下分組施用不同肥料，甘蔗下種量12萬個芽/hm2，每組中1個小區面積50m2，每組4個重複。施肥量為750公斤/hm2，觀察甘蔗的發芽率、理論產量和梢腐病發生情況。結果詳見表3。
[0160]
實驗組：施用有機肥，施肥量為750公斤/hm2+基肥
[0161]
空白對照組：施用過磷酸鈣750公斤/hm2+基肥
[0162]
陽性對照組i和ii：分別施用以上放大生產試驗獲得的陽性對照組i和ii的有機肥(堆肥時間30天)，用法和用量與實驗組相同。
[0163]
發芽率計算方法：下種後25天記錄萌芽率，每隔7天統計1次，直至分櫱初期。取中間行進行出芽數記錄，重複取平均值。
[0164]
梢腐病發生情況統計方法：統計並計算1個小區內發病植株數佔總植株數的百分比，記為甘蔗梢腐病發病率。
[0165]
表3
[0166]
組別發芽率(％)理論畝產(kg)發病率(％)實驗組58.9132.151.2空白對照組52.180.265.1陽性對照組i54.8106.782.3陽性對照組ii55.6110.843.2
[0167]
種植試驗過程中，分別在肥料施用前和施用後1年後對各組土壤進行取樣，對土壤
樣品的微量元素含量和微生物群落結構分布進行檢測，結果顯示施用實驗組有機肥提高了土壤肥力，且土壤中根瘤菌的豐度也有相應提高。
[0168]
實施例4
[0169]
本實施例用於說明本發明提供的菌劑採用其他原料進行有機肥堆肥的效果。
[0170]
(1)堆肥效果
[0171]
以下實驗中採用的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌均購自廣州市微元生物科技有限公司，以活細胞計的含量分別為2
×
10
10
cfu/g、2
×
10
10
cfu/g和2
×
10
10
cfu/g。
[0172]
堆肥原料a：將牛糞和玉米秸稈按照的3:重量比1混合，調節其中水分含量約為50重量％，c/n約為30。
[0173]
堆肥原料b：將廚餘垃圾和秸稈按照20：1的重量比混合，調節其中水分含量約為50重量％，c/n約為30。
[0174]
堆肥原料c：將番茄秸稈、牛糞、玉米秸稈按照50：3：2的重量比混合，調節其中水分含量約為50重量％，c/n約為25。
[0175]
將以上三種堆肥原料中分別加入菌劑，其中，堆肥原料a和堆肥原料b中添加0.1重量
‰
實施例2中獲得的成熟麩曲，堆肥原料c分為三組，每組中分別添加0.1重量
‰
以下複合菌劑：
[0176]
複合菌劑1：實施例2中獲得的成熟麩曲+枯草芽孢桿菌，以活孢子/活細胞數計，黑麴黴與枯草芽孢桿菌的含量比為1：0.01。
[0177]
複合菌劑2：實施例2中獲得的成熟麩曲+地衣芽孢桿菌，以活孢子/活細胞數計，黑麴黴與地衣芽孢桿菌的含量比為1：0.1。
[0178]
複合菌劑3：實施例2中獲得的成熟麩曲+巨大芽孢桿菌，以活孢子/活細胞數計，黑麴黴與巨大芽孢桿菌的含量比為1：0.5。
[0179]
將其分別混勻後堆成長、寬、高均為1m的堆肥垛進行堆肥，相鄰兩個垛的距離為1m。堆肥過程中全程監控堆肥溫度，當溫度高於60℃時，採用翻車對其進行翻拋，以免發生局部溫度過高的問題。堆肥時間30天，獲得有機肥(按照採用的堆肥原料相應編號為有機肥a、有機肥b和有機肥c)。
[0180]
採用與實施例3中相同的方法，檢測並計算以上有機肥中有機質含量和c/n。結果如表4所示。
[0181]
表4
[0182]
有機肥編號有機質(重量％)c/na45.0019.57b47.9618.75c(複合菌劑1)45.2616.28c(複合菌劑2)46.7517.46c(複合菌劑3)46.9317.95
[0183]
(2)種植試驗
[0184]
在番茄種植過程中按照以下分組施用不同肥料，保苗株數2800株/畝，每組中一個小區50m2，每組4個重複，觀察番茄產量和枯萎病發生情況。結果詳見表5。
[0185]
實驗組：施用有機肥c(複合菌劑2)312kg/畝
[0186]
對照組：施用尿素32kg/畝，磷酸二銨12kg/畝，鉀肥18kg/畝
[0187]
番茄枯萎病統計方法：統計並計算1個小區內發病植株數佔總植株數的百分比，記為番茄枯萎病的發病率。
[0188]
表5
[0189]
組別產量(kg/畝)發病率(％)實驗組8537.122.13對照組8135.285.17
[0190]
種植試驗過程中，分別在肥料施用前和施用後100天對實驗組土壤進行取樣，對土壤樣品的微量元素含量和微生物群落結構分布進行檢測。結果顯示施用有機肥c(複合菌劑2)提高了土壤肥力，且土壤中鏈黴菌屬、芽孢桿菌屬等益生菌的相對豐度也有相應的提高。
[0191]
以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於此。在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，包括各個技術特徵以任何其它的合適方式進行組合，這些簡單變型和組合同樣應當視為本發明所公開的內容，均屬於本發明的保護範圍。