具有靶向抗血栓活性的rgdvyigsk、製備和應用的製作方法

2023-05-27 07:44:06 1

專利名稱：具有靶向抗血栓活性的rgdvyigsk、製備和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有靶向抗血栓活性的多肽RGDVYIGSK。本發明還涉及它的製備方法以及它作為抗血栓劑的應用，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
細胞黏附在細胞黏附性疾病(癌轉移、血栓形成、化學致炎和骨質疏鬆)的發展過程中起關鍵作用。調節性糖蛋白例如昆布氨酸、纖維蛋白原、RGD肽、YIGSR和YIGSK等都可以參與細胞黏附過程。它們與整合素受體有很強的結合能力。例如在血小板聚集過程中，RGDV與活化的血小板表面受體GP Ilb/IIIa結合起至關重要的作用。RGDV與活化的血小 板表面受體GP Ilb/IIIa的特異性結合，賦予了 RGDV —種重要性質，即RGDV可以向血小板活化的部位富集。在這樣一個前提下，把RGDV與抗細胞黏附的YIGSK綴合，便可以獲得靶向抗細胞黏附多肽。

發明內容
本發明的目的之一是對RGDV與HGSK進行綴合，製備得到具有靶向抗血栓活性的多肽。本發明的目的之二是提供一種製備抗血栓活性的RGDVYIGSK的方法。該方法包括I.採用液相合成方法，通過逐步接肽分別合成RGDV和YIGSK的保護中間體；2.脫去RGDV保護中間體的C端保護基；3.脫去YIGSK保護中間體的N端保護基；4.把C端游離的RGDV保護中間體和N端游離的HGSK保護中間體綴合，再脫去保護基得到RGDVYIGSK。其中，所述的N端保護基是對多肽的N端進行保護時所常用的保護基團，例如可以是叔丁氧羰基(Boc);所述的C端保護基是對多肽的C端進行保護時所常用的保護基團，例如可以是苄氧基(OBzl)，甲氧基(OMe)等。以上所述的液相合成中間體並加以保護的方法是本領域的常規並公知的技術。動物模型試驗證明，本發明的RGDVYIGSK具有較強的抗血栓活性。為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。本發明中所出現的縮略語的說明THF四氫呋喃DCC二環己基醯亞胺
DCU二環己基脲OBzl苄氧基Boc叔丁氧羰基OMe甲氧基 HOBtN-羥基苯並三唑NMMN-甲基嗎啉
具體實施例方式實施例I HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的製備I) Boc-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl 的製備將O. 59g(2. Ommol)Boc-Ser (Bzl)溶解在 6ml 無水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. Ommol) N-羥基苯並三唑(HOBt)和 O. 45g(2. 2mmol) 二環己基羰二亞胺(DCC)。攪拌10分鐘後加入I. 084g(2. OmmoDTos · Lys(Z)-OBzl的無水THF溶液。反應混合物用N-甲基嗎啉(NMM)調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的二環己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5%KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4,濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH, 30 I)，得到I. 216g(94% )目標化合物。ESI-MS (m/z) 648 [M+H] +。2) HCl · Ser (Bzl)-Lys(Z) -OBzl 的製備將O. 648g (I. Ommol) Boc-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 溶解在 IOml 氯化氫-乙酸乙酯(6mol/l)溶液中，室溫攪拌2小時，TLC檢測原料點消失，減壓抽去乙酸乙酯，反覆加少量乙醚進行減壓抽氣以除去產品中的酸氣。最後加少量乙醚將產品研磨成固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS (m/z) 548 [M+H] +。3) Boc-Ile-Gly-OMe 的製備將O. 498g(2. Ommol)Boc-Ile · H2O 溶解在 5mL 無水 THF 中，O °C 下力卩入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後加入 O. 251g(2. Ommol)HCl -Gly-OMe的無水THF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8_9，0°C攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到 O. 567g(94% )目標化合物。ESI-MS (m/z) 303 [M+H]+。4) HCl · Ile-Gly-OMe 的製備將O. 567g(l. 87mmol)Boc-Ile-Gly-OMe 溶解在 15ml 氯化氫 _ 乙酸乙酯溶液(6mo I/1)中，室溫攪拌2小時，TLC檢測原料點消失，減壓抽去乙酸乙酯，反覆加少量乙醚進行減壓抽氣以除去產品中的酸氣。最後加少量乙醚將產品研磨成固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS (m/z) 203 [M+H]+。5) Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 的製備將O. 525g(l. 87mmol)Boc-Tyr 溶解在 5ml 無水 THF 中，O °C 下加入O. 270g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入 O. 377g(l. 87mmol)HCl · Ile-Gly-OMe的無水THF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5 % KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,60 I)。得到 O. 808g(93% )目標化合物。ESI-MS (m/z) 466 [M+H]+。6)Boc-Tyr-Ile-Gly 的製備將O. 808g(l. 87mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，(TC下加入 NaOH水溶液(1.5mol/l)，調節pH值到11，攪拌反應O. 5h，TLC檢測反應結束。加飽和KHS04調節pH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續用KHSO4調節PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合併，用飽和NaCl萃洗三次，無水NaSO4乾燥3小時，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到0.834g(99% )目標化合物。ESI-MS(m/ζ)450[Μ-ΗΓ。7) Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的製備將O. 857g(l. 9mmol)Boc-Tyr-Ile-Gly 溶解在 5ml 無水 THF 中，O °C 下加入O. 257g(l. 9mmol)H0Bt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入 I. 039g(l. 9mmol)HCl · Ser (Bzl)-Lys(Z) -OBzl的無水THF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4,濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH, 30 I)。得到 1.71g(92%)目標化合物。ESI-MS (m/z) 981 [M+H]+。8) HCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的製備將O. 98g(I. Ommol)Boc-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl 溶解在 20ml 氯化氫-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室溫攪拌2小時，TLC檢測原料點消失，減壓抽去乙酸乙酯，反覆加少量乙醚進行減壓抽氣以除去產品中的酸氣。最後加少量乙醚將產品研磨成固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS (m/z) 881 [M+H] +。實施例2 Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Val 的製備I) Boc-Asp (OMe)-Val-OBzl 的製備將O. 494g(2. Ommol)Boc-Asp (OMe)溶解在 5ml 無水 THF 中，O °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入 O. 758g(2. Ommol)Tos · Val-OBzl的無水THF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5 % KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 O. 819g(94% )目標化合物。ESI-MS (m/z) 437 [M+H]+。2) HCl · Asp(OMe)-Val-OBzl 的製備將O. 819g (I. 98mmol) Boc-Asp (OMe)-Val-OBzl 溶解在 IOml 氯化氫-乙酸乙酯溶液(6mol/l)中，室溫攪拌2小時，TLC檢測原料點消失，減壓抽去乙酸乙酯，反覆加少量乙醚進行減壓抽氣以除去產品中的酸氣。最後加少量乙醚將產品研磨成固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS (m/z) 337 [M+H] +。
3) Boc-Arg (Tos) -Gly-OMe 的製備將O. 856g(2. Ommol)Boc-Arg(Tos)溶解在 5ml 無水 DMF 中，O °C 下加入O. 27g(2. OmmoDHOBt 和 O. 45g(2. 18mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入 O. 251g(2. Ommol)HCl ·Gly-OMe的無水DMF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8_9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 0.96g(96%)目標化合物。ESI-MS (m/z) 500 [M+H]+。4) Boc-Arg (Tos)-Gly 的製備將O. 96g (I. 9mmol) Boc-Arg (Tos)-Gly-OMe 溶解在 IOml 甲醇中，O °C 下加入 NaOH水溶液(1.5mol/l)調節pH值到11，攪拌反應O. 5h，TLC檢測反應結束。加飽和KHSO4調節pH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續用KHSO4調 節PH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合併，用飽和NaCl萃洗三次，無水NaSO4乾燥3小時，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到0.903g(98% )目標化合物。ESI-MS(m/ζ)484[Μ-ΗΓ。5) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OMe) -Val-OBzl 的製備將O. 903g (I. 86mmol) Boc-Arg (Tos) -Gly 溶解在 5ml 無水 THF 中，0 °C 下加入O. 252g(l. 86mmol)H0Bt 和 O. 428g(2. 08mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入 0. 693g(l. 86mmol)HCl *Asp (OMe)-Val-OBzl的無水THF溶液。反應混合物用NMM調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的DCU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHCl3 CH3OH,30 I)。得到 1.39g(93%)目標化合物。ESI_MS(m/z)804[M+H]+。6) Boc-Arg (Tos) -Gly-Asp (OMe) -Val 的製備將O. 804g (I. Ommol) Boc-Arg (Tos)-Gly-Asp (OMe)-Val-OBzl 溶解在 IOml 甲醇中，(TC下加入NaOH水溶液(I. 5mol/l)調節pH值到11，攪拌反應O. 5h，TLC檢測反應結束。加飽和KHSO4調節pH值到6 7，濾除析出的鹽，濾液減壓蒸餾除去全部甲醇，殘留水溶液繼續用KHSO4調節pH值到2，用乙酸乙酯萃取三次，乙酸乙酯層合併，用飽和NaCl萃洗三次，無水NaSO4乾燥3小時，過濾，濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯，得到O. 684g(96% )目標化合物。ESI-MS (ι /ζ)712[Μ-ΗΓ。實施例3 RGDVYIGSK的製備I)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val-Tyr-Ile-Gly-Ser(Bzl)-Lyz(Z)-OBzl 的製備將O. 713g(I. Ommol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val 溶解在 5ml 無水 THF中，O °C 下加入 O. 135g(l. OmmoDHOBt 和 O. 23g(l. 09mmol)DCC。攪拌 10 分鐘後，加入O. 916g(l. OmmoDHCl · Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl) -Lys (Z) -OBzl 的無水 THF 溶液。反應混合物用NMM調節pH 8-9，(TC攪拌24小時。停止反應，過濾除去沉澱出的ECU。濾液減壓濃縮，殘留物溶於乙酸乙酯中，得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液、5% KHSO4水溶液和飽和NaCl水溶液洗。乙酸乙酯層用無水NaSO4乾燥3小時。濾除NaSO4,濾液減壓濃縮除去乙酸乙酯。殘留物用柱層析分離(CHQ3 CH3OH, 30 I)。得到1.4g(89%)目標化合物。1HNMR(BHSC-300, CDCl3-d3) δ = 7. 76 (d, J = 5. OHz, 10H) ,7. 87 (d, J = 7. OHz,2H)，7· 34 (d, J = 7. 0Ηζ，2Η)，7· 19 (m, 15H)，6· 95 (d, J = 7. 0Ηζ，2Η)，6· 65 (d, J = 7. OHz，2Η)，5· 7(s，1Η)，5· 34(s，4H)，5· 17 (q, J = 6. OHz, 1Η)，5· 0(s，1Η)，4· 92 (q, J = 6. 0Ηζ，2Η)，4. 63(s，2H)，4· 52 (t, J = 6. 0Ηζ，4Η)，4· 09 (d, J = 6. 0Ηζ，4Η)，3· 87 (d, J = 5. 0Ηζ，2Η)，
3.67(s,3H) ,3. 05 (d, J = 6. 0Ηζ,2Η) ,2. 96 (q, J = 6· 0Hz，2Η)，2· 7 (d，J = 7. 0Ηζ,5Η),2· 5(m，1Η)，2· 35(s，3H)，2· 0(s，1Η)，I. 7-1. 9(q，J = 7· 0Hz，4Η)，I. 4 (s，9Η)，I. 45-1. 6 (m，4Η)，O. 8-1. 3 (m, J = 8. OHz，16Η)。ESI-MS (m/z) 1576 [M+H]+。元素分析 C78H105N13O20S 理論值C 59. 41, Η,6. 71, Nil. 55.實測值 C 60. 80, H 6. 67, N 11.38。2)RGDSYIGSK 的製備將200mg(0. 127mmol)Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OMe)-Val-Tyr-Ile-Gly-Ser (Bzl)-Lys (Z)-OBzl溶於4mL三氟醋酸中，加入ImL三氟甲磺酸和ImL苯甲醚，(TC下攪拌反應I小時，減壓抽氣5分鐘，一次性加入IOOmL乙醚，析出的產品固體粉末使用S^hadex G 10進行提純，得到 112mg(89% )目標化合物。1HNMR(BHSC-300，CDCl3-d3) δ = 11. O (s, 2Η)，7. 80 (d,J = 5. 0Ηζ，8Η)，6· 95 (d, J = 7. 0Hz，2H)，6· 68 (d, J = 7. 0Hz，2H)，5· 7 (s，1H)，5· 0(s，1H)，
4.92 (q, J = 6. OHz, 1H) ,4. 86 (q, J = 6. 0Hz, 1H), 4. 62 (s, 1H), 4. 51 (t, J = 6. 0Hz,3H),4. 09 (d, J = 6. 0Hz，4H)，4. 03 (d, J = 7. 0Hz，2H)，3. 56 (m, 1H)，3. 05 (d, J = 6. 0Hz，2H)，
2.73 (t, J = 6. 0Hz, 2H), 2. 68 (m, 1H), 2. 65 (q, J = 6. 0Hz，4H)，2. 5 (m，1H)，2. 0 (s，8H)，I. 79(q, J = 7. OHz，4H)，I. 55(m，4H)，0. 8-1. 3 (m，J = 8. OHz，16H)。ESI-MS (m/z) 995 [M+H]+。元素分析 C43H71N13O14 理論值 C 51. 95, Η, 7. 20, N 18. 32.實測值 C 52. 11, H 7. 29, N 18.51。試驗例I RGDSYIGSK的抗血栓活性試驗I)大鼠手術與器械 SD大鼠(雄性，220 230g)按1200mg -kg^1劑量腹腔注射烏拉坦溶液進行麻醉。麻醉大鼠仰臥位固定，分離右頸總動脈，於近心端夾動脈夾，近心端和遠心端分別穿入手術線，將遠心端的手術線於皮毛用止血鉗夾緊，準備在遠心端插管。2)插管插管為矽烷化過的聚乙烯膠管，分三段，中段為聚乙烯膠管，長60. 0mm，內徑
3.5mm ;兩端為相同的聚乙烯管,管長100. Omm,內徑I. Omm,外徑2. Omm該管的一端拉成尖管(用於插入大鼠頸動脈或靜脈)，外徑為I. Omm0將編好號的乾淨青黴素小瓶中分別裝入6cm長的黑色手術線，稱重；然後取出絲線，按照編號放入準備好的插管的中段較粗的插管中。打開大鼠右側動脈夾，用注射器通過尖管端將管中注滿肝素生理鹽水溶液(50IU · kg—1)，然後將插管的動脈端插入大鼠右側頸總動脈，將計算量的肝素緩緩注入大鼠體內。3)給藥藥品生理鹽水(3ml · kg-1)、阿斯匹林(劑量為30mg/kg)的生理鹽水溶液、RGDVYIGSK的(劑量為ΙΟμπιοΙ/kg)的生理鹽水溶液。夾閉大鼠右側頸動脈夾，拔下插管靜脈端的注射器，將吸有計算量的藥品水溶的藥液注射器插入插管的靜脈端，打開大鼠右側頸動脈夾，將藥品緩緩推入大鼠體內。夾閉右側頸動脈夾，將茶館的靜脈端插入分離好的大鼠左側頸靜脈，打開動脈夾，使血液開始循環。並同時開始計時。此過程中插管中央的粗管中的絲線上會因為血液循環而產生血栓。4)血栓稱重計時開始15分鐘後，剪斷動靜脈插管，停止循環，用眼科鑷小心取出絲線，在濾紙上輕輕蘸掉血滴，放入事先稱重好的青黴素小瓶中，精確稱重並記錄。計算出血栓的溼重。每個藥品重複11次給藥。統計各組的血栓溼重(歹土SD)，並做t檢驗。5)結果RGDVYIGSK具有很好的抗栓活性。結果列入表I。表1RGDVYIGSK在大鼠模型上的抗血栓活性
權利要求
1.具有靶向抗血栓活性的多肽RGDVYIGSK。
2.一種製備權利要求I的RGDVYIGSK的方法，包括 (1)採用液相合成方法，通過逐步接肽分別合成RGDV的保護中間體和YIGSK的保護中間體； (2)脫去RGDV的保護中間體的C端保護基； (3)脫去HGSK的保護中間體的N端保護基； (4)把N端游離的YIGSK保護中間體和C端游離的RGDV保護中間體綴合得到RGDVYIGSK的保護中間體； (5)把RGDVYIGSK的保護中間體脫去保護基，得到RGDSYIGSK。
3.權利要求I的RGDVYIGSK在製備抗血栓藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種具有靶向抗血栓活性的多肽RGDVYIGSK，還公開了它的製備方法以及它作為抗血栓劑的應用，屬於生物醫藥領域。本發明通過RGDV與YIGSK綴合，製備得到具有靶向抗血栓活性的多肽。動物模型試驗證明，RGDVYIGSK具有較強的抗血栓活性。
文檔編號A61P7/02GK102702312SQ20121010508
公開日2012年10月3日 申請日期2006年11月30日 優先權日2006年11月30日
發明者彭師奇, 王超, 趙婧華, 趙明 申請人:首都醫科大學