一種血紅密孔菌gw菌漆酶的製備方法
2023-05-27 03:31:41
專利名稱：一種血紅密孔菌gw菌漆酶的製備方法
技術領域：
本發明屬於微生物酶學領域，具體的講涉及真菌擔子菌門的一種血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)CGMCC NO.1008的新菌株以及通過培養該菌株製備漆酶的方法。
背景技術：
漆酶(p-diphenol oxygen oxidoreductase，EC 1.10.3.2.)是一種藍色、含有多個銅離子的酚氧化酶，能催化酚類物質的氧化還原反應。漆酶(laccase)可降解木質素中的酚類和非酚類結構，在木質素的生物降解中發揮著重要的作用，同時由於木質素中的許多化學鍵普遍存在於芳香族化合物中，而漆酶對木質素的降解又是氧化性的和非特異性的，這就使得漆酶也能降解芳香族化合物。漆酶氧化的底物包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通過不斷研究，漆酶可氧化的非酚底物範圍還在不斷擴大。漆酶能把分子氧直接還原為水，在沒有H2O2存在下，可催化有機汙染物的氧化。漆酶又能使木素類多酚物質以游離基方式進行氧化聚合，替代傳統木材工業採用合成樹脂膠粘劑或其它化學品。用無汙染、低能耗的酶學的方法取代汙染嚴重的化學方法，把汙染消除在源頭。因此，漆酶在生物技術和環境保護方面有著巨大的應用潛力。
白腐菌是能夠將木質素徹底降解為二氧化碳和水的唯一生物。白腐菌還能夠產生木質素過氧化物酶(LiP)和錳氧化物酶(MnP)，但其產生的漆酶比木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶更具有熱穩定性。因此，這一生物類群引起了世界生物學家的極大興趣。
白腐菌中的血紅密孔菌被認為是研究漆酶的理想菌株。然而，現有已知的菌株其漆酶產率較低，從檢索的文獻資料來看，國內的產量都較低，而國外的產量較高的也較少。因此，漆酶的高產菌株的研究迫在眉睫，從而需要提供能夠以高產率且較易製備漆酶的新菌株。
發明內容
本發明的目的提供一種能產生漆酶的血紅密孔菌(Pycnoporussanguineus(LFr)Murr.)的新變異菌株。另一個目的是通過的提供血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008變異菌株先培養；再從這些培養物中經常規的酶分離技術如離心分離、超濾濃縮、硫酸銨分級沉澱、離子交換柱、凝膠過濾柱、冷凍乾燥提供提取製備漆酶的方法。該變異菌株能夠產生大量具有高活力的漆酶。根據本發明提供的方法，血紅密孔菌GWCGMCC NO.1008的雙核菌絲在液體培養基中產生的最高漆酶活力可達到43U/mL。
本發明的新變異菌株血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)GW已經於2003年9月23日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，中國，北京，保藏，並收到保藏登記號血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.)GW CGMCC NO.1008。
本發明的血紅密孔菌GW GWCGMCC NO.1008是通過紫外線照射由親本血紅密孔菌G05變異而獲得的。
本發明的菌株血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008具有以下微生物學特性1、形態學特性在顯微鏡下，本發明菌株在固體培養基上生長的菌絲，菌絲易斷裂。
親本菌株(G05)和本發明菌株血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008之間的形態學特徵差異見於表1。
表1
2、生理特性本發明的菌株是一種需氧菌，在30℃顯示出最佳的生長能力，它在發酵培養基中產生漆酶，並伴隨著有大量的色素產生，加入小麥麩皮後，漆酶的產量會提高2-3倍。用麥芽糖、蔗糖或葡萄糖作為碳源時菌株生長的速度差別不大，但用麥芽糖比用蔗糖或葡萄糖時產生的漆酶量要多。
使用本發明的菌株製備漆酶的方法包括在含有碳源、氮源、無機物和其他營養物的培養基中培養血紅密孔菌GW的方法，固體種子培養基為麥芽汁，2％瓊脂；發酵培養基為麥芽糖1.5％，酒石酸銨0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O 0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa·3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的「％」百分比是以水為基質的固體重量對水體積的百分比，小麥麩皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。還包括從培養物中回收漆酶的方法。
在本發明的培養基中所使用的主要碳源可包括但不限於麥芽糖。在本發明的培養過程中所使用的氮源可包括但不限於酒石酸銨。本發明在發酵中使用的無機組分可包括硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、氯化鈷等。
第四天加入誘導物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)10μM，發酵可在30±0.1℃的需氧條件下進行12天。菌株產生的漆酶產物分泌於細胞外，貯存於培養基中，通過使用常規分離方法(但並不限於這些步驟)從培養基中分離出漆酶。例如離心除去菌絲，使用超濾除去一部分小分子物質並進一步濃縮發酵上清液，硫酸銨分級沉澱，過離子交換柱，過凝膠過濾柱，冷凍乾燥。通過這些步驟可以除去大部分的雜蛋白和幾乎全部的色素。
已經被本發明人證實，本發明菌在目前的條件下，其雙核菌絲髮酵得到的漆酶活力可高達43U/ml。而且本發明菌不產生木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶，便於漆酶的提取。
按照本發明提供的方法製備的漆酶可以在酚類、芳胺、芳香羧酸及其它們的衍生物的生物降解中的應用。另外在造紙製漿生物漂白和廢水處理中和木材加工替代化學膠合劑都可應用。所以，本發明的重要意義在於可以替代傳統木材加工工業所採用的具有汙染嚴重的化學方法合成樹脂膠粘劑或其它化學品，採用本發明的無汙染、低能耗的漆酶取代傳統的木材加工工業，在環境保護中有著巨大的應用潛力。
圖1血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008的菌落形態圖2血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008的菌絲形態(x1100)具體實施方式
通過以下實施例將更加進一步地說明本發明，但本發明並非受這些實施例1在本發明中漆酶活力的測定是採用國際通用的方法，用2，2』-連氮-雙-(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(英文簡稱ABTS){2，2-azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}來測定的。酶活力的計算是據酶活力的定義進行的。一個酶活力單位U的定義在特定條件下，每分鐘內催化1μM底物的酶量。由朗伯-比爾定律A＝ε·L·C，得到C＝A/ε·L.
根據酶活力的定義得到U＝C·V/T，那麼得到酶活力的計算公式為U＝A·V/(ε·L·T).
在以上的公式中，其中C表示底物在T時間內的濃度的變化的量(單位μM)，A表示紫外分光光度計吸收值的變化，V表示反應的體系的體積(單位mL)，ε＝3.6×104M·cm-1＝36(μmol/ml)-1·cm-1，為氧化型ABTS的摩爾消光係數，L為比色皿的光徑(單位cm)，T為反應的時間(單位分鐘)。
本發明中酶活力測定條件為反應體積V＝1mL，比色皿的光徑L＝0.5cm，反應時間T＝30秒。其中反應體系的體積1mL內含有的500μL的50mM的酒石酸緩衝液(pH 4)，390μL的水，100μL的500μM的ABTS，10μL的發酵液，選用波長為420nm。如果發酵液含有漆酶活力太高，可適當稀釋。
實施例2將血紅密孔菌Pycnoporus sanguineus(LFr)Murr.(GW)接種至固體種子培養基麥芽汁，2％瓊脂上。30℃下培養6-8天。取菌落最邊沿的菌塊(直徑1cm，10塊)，接種到500ml三角瓶內裝100ml的經高壓溼熱滅菌的發酵培養基麥芽糖1.5％，酒石酸銨0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O 0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O 0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa.3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的「％」百分比是以水為基質的固體重量對水體積的百分比，小麥麩皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。8磅高壓溼熱滅菌30分鐘，200rpm，30℃，暗培養，第四天加入誘導物2，5二甲基苯胺(2，5-Dimethylaniline)10μM，培養12天。按照實施例1的方法測定漆酶活力，菌絲髮酵得到的漆酶活力可高達43U/ml。
實施例3取實施例2中得到的發酵液，進行離心除去發酵沉澱物，取上清液經真空抽濾，獲得的抽濾液經PLGC膜(10000D)超濾，進行初步濃縮。隨後採用兩步硫酸銨沉澱法沉澱，第一步用35％(W/V)的飽和硫酸銨4℃攪拌沉澱，10000rpm離心1小時，棄沉澱，留上清；第二步用第一步所得的上清液加80％(W/V)的飽和硫酸銨4℃溫和攪拌沉澱，4℃靜至2小時以上，然後10000rpm離心1小時，棄上清，留沉澱。將第二步得到的沉澱用兩倍體積的100mM磷酸鉀緩衝液(pH 5.7)溶解，然後進行透析，透析液為10mM的磷酸鉀緩衝液。其中超濾後漆酶的得率為81.82％，硫酸銨沉澱後的漆酶得率為88.89％，磷酸鉀緩衝液透析後的漆酶得率為96.46％。
實施例4在本實施例中，進一步分離純化漆酶蛋白。取實施例3中的濃縮液10mL用於離子交換柱層析。離子交換介質選用DEAE SepharoseF.F.，緩衝液為20mM的組氨酸緩衝液(pH6.0)，洗脫液為0.1-0.6MNaCl的組氨酸洗脫液，流速為1mL/分。然後冷凍乾燥濃縮得漆酶。
權利要求
1.一種由血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008發酵製備漆酶的方法，該方法包括先培養血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008；再從這些培養物中通過離心分離、超濾濃縮、硫酸銨分級沉澱、離子交換柱、凝膠過濾柱、冷凍乾燥分離技術提取製得漆酶。
2.根據權利要求1所述的方法，先培養使用的碳源為麥芽糖，氮源有酒石酸銨，使用的無機組分有硫酸亞鐵、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅、氯化鈣、氯化鈷。
3.根據權利要求1所述的方法，固體種子培養基為麥芽汁，2％瓊脂；發酵培養基為麥芽糖1.5％，酒石酸銨0.2％，KH2PO40.133％，NaH2PO4·12H2O 0.039％，MgSO4·7H2O 0.05％，琥珀酸鈉(CH2COONa)2·6H2O0.118％，FeSO4·7H2O 0.00315％，CaCl2·2H2O 0.01％，MnSO4·H2O 0.0035％，CH3COONa·3H2O 0.0408％，CoCl2·6H2O 0.006％，ZnSO4·7H2O 0.0028％，CuSO4·5H2O 0.0168％，上述的「％」百分比是以水為基質的固體重量對水體積的百分比，小麥麩皮6g，Tween-80 1ml，VitaminB1 10μg，VitaminB2 5μg，VitaminB6 5μg，加水至1L。
4.根據權利要求1所述的方法，血紅密孔菌GW CGMCC NO.1008培養經過4天，培養基要加入誘導物，2，5二甲基苯胺2，5-Dimethylaniline，第12天，從培養物中分離並提純漆酶，產酶活力高達43U/mL。
5.根據權利要求1所述的方法，先培養是在需氧、暗培養的條件下進行的。
6.根據權利要求4所述的方法，培養基加入誘導物2，5二甲基苯胺2，5-Dimethylaniline的量為10μM。
7.權利要求1-6所述的方法製備的漆酶在降解酚類、芳胺、芳香羧酸及其它們的衍生物中的應用。
8.權利要求1-6所述的方法製備的漆酶在造紙製漿生物漂白和廢水處理中的應用。
9.權利要求1-6所述的方法製備的漆酶在木材加工替代化學膠合劑的應用。
全文摘要
本發明公開了一種血紅密孔菌GW(CGMCCNO.1008)菌株與其他已知生產漆酶的同類及其親本菌株不同。還提供了通過發酵培養該菌製備漆酶的方法。該菌株的雙核菌絲產酶能力可以高達43U/mL。漆酶氧化的底物包括酚類及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等，為此，本發明的意義在造紙製漿生物漂白和廢水處理中、木材加工行業中替代化學膠合劑發揮著重要的作用。
文檔編號C02F3/00GK1621519SQ20031011837
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月25日 優先權日2003年11月25日
發明者郭林, 王文惠, 張虎成, 李偉 申請人:中國科學院微生物研究所