豬免疫力相關分子標記克隆及應用的製作方法

2023-05-27 06:40:26

專利名稱：豬免疫力相關分子標記克隆及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於家畜基因工程技術領域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬免疫力相關的分子 標記的克隆及應用。
背景技術：
我國是世界上養豬生產和豬肉消費第一大國，養豬業已經是農村支柱產業之一，家畜的疾病是畜牧生 產的大敵，由於疾病造成的經濟損失約佔畜牧業產值的12% 15%，實際情況還要嚴重。濫用抗生素導 致出口豬肉藥物殘留的尷尬，先進的疫苗還是抵擋不住周期性豬病的爆發。同時，國內外對豬肉消費提出 了新的要求，如"綠色豬""環保豬"等，這些新問題給豬的雨中育種工作提出了新的要求。近年來，現 代育種技術在改良豬生產性狀方面做出了很大貢獻，但對健康和抵抗疾病的能力的遺傳改良還很有限。因 此，迫切需要從遺傳學的角度米提高豬的抗病性，同現有的措施相配合來解決這些問題。
採用分子遺傳學方法從本質上提高豬自身抗病能力的核心是提高豬的免疫力。免疫力是衡量動物健康 水平的重要指標，它屬於數量性狀，受到多基因的調控，分子機制非常複雜，對豬免疫力及其分子機制的 解析是畜牧領域的一個研究熱點，而旨在提高豬免疫力的育種工作也被稱作抗病育種。在抗病育種工作過 程中免疫相關的重要基因的克隆和相關分子標記的開發與應用又是研究的重中之重。
本發明選取的Cavl基因便是這樣一個在細菌和病毒攻擊宿主過程中發揮至關重要作用的基因之一。 Cavl屬於Caveolin家族，編碼Caveolinl蛋白(中譯名窖蛋白)。Caveolinl蛋白是構成脂筏和細胞窖的主 要成分，它分布於許多不同類型的細胞中。研究發現該基因參與多種細胞生命活動，如細胞內吞、膽固醇 運輸、胞膜形成、信號傳導、腫瘤生成。而在這些生命過程中，Caveolinl都發揮著極為重要的作用，因此 對其功能的研究已經成為瑪在生命科學的一個熱點。
隨著研究的深入，人們發現Caveolinl蛋白還參與多種細菌和病毒性病原體入侵宿主細胞的過程，如 HIV-1等病毒和Mycobacteria. E. coli等細菌。國外研究表明H!V21的跨膜糖蛋白gp41有一個保守的 Caveolin結合基序(CBD)。值得注意的是，在HIV感染的細胞中，存在一個穩定的gp41與Caveolinl蛋 白的複合物，因此抗CBD的抗體可能能夠抑制gp41與窖蛋白的相互作用，利用這一原理可以開發治療艾 滋病的疫苗。
不僅如此，Caveolin-1亦在病原體增殖過程中發揮重要作用，Marjomaki等分析了 Echovirasl (EV)在 結合到受體後早期感染及其進入宿主細胞的途徑。EV1結合到宿主細胞表面後'病毒衣殼構象發生變化。 該研究發現EV1在細胞核周圍的囊泡結構中存在，電鏡顯示EV1病毒顆粒存在於胞膜窖中。不表達 Caveolinl的細胞不能感染EVl,這說明Caveolinl蛋白在EV1.病毒複製增殖中是非常重要的。
但是目前國內外對Cavl基因研究主要集中在人類醫學領域，對豬Cavl基因研究較少。而且迄今為止 尚沒有利用豬Cavl基因來尋找與豬免疫力相關的分子標記的報導。因此'申請人克隆了與豬免疫力相關 Cavl基因的cDNA，利用該cDNA序列進行了多態性和關聯分析.等研究'以期得到新的作為豬免疫力相關 的分子標記。

發明內容
本發明的目的在於克隆與豬免疫力相關的分子標記，利用該分子標記作為豬標記輔助育種的應用。 本發明通過以下技術方案實現
申請人克隆得到一種與豬免疫力相關的分子標記，它是序列表SEQIDNO: l所示的核苷酸序列。在 序列表SEQIDNO: 1的第387bp處有1個由G387-C387的鹼基突變，導致HaeIII-RFLP多態性；在序列 表SEQ ID NO: 1的第474bp處有1個由A474-G474的鹼基突變，導致MM-RFLP多態性。在序列表SEQ ID NO: 1的第512bp處有1個由G512-A512的鹼基突變，導致Acil-RFLP多態性。
其中，克隆豬Cavl基因的引物對的DNA序列如下所示
正向弓l物5'AATCTCCTCAGAGCCTTCATCC3'，反向弓l物5'CGCTGTACTGGCAAATTGAAAC 3'。 檢測SEQIDNO: l所述的分子標記(即檢測鹼基突變)所用的引物對的DNA序列如下所示 正向引物5' -ACTGGTTTTACCGTTTGC-3'，反向引物5'- GAAACTCGAAATTGGCAC-3'。
申請人建立一種製備上述分子標記和檢測上述分子標記的方法，該方法的步驟如下
用由人Cavl基因預測的豬Cavl基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的 表達序列標籤；然後拼接豬表達序列標籤-重疊群；根據表達序列標籤-重疊群設計引物，擴增得到目的片 段；從豬品種耳組織中提取基因組DNA，以豬Cavl基因cDNA序列為模板設計引物，PCR擴增，PCR 產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列，應用PCR-RFLP方法檢測豬Cavl 基因的多態性。
更詳細的技術方案參見《具體實施方式
》。


圖1:是本發明的技術流程圖。
圖2:本發明克隆的豬Cavl基因部分cDNA序列，圖中下劃線部分為編碼區(CDS),方框標記為鹼 基的突變位點，從左到右依次是G387-C387, A474-G474和G512-A512。
圖3:是本發明中用於檢測分子標記的所克隆的豬Cavl基因部分序列，圖中方框標記為3個鹼基的突 變位點，從左到右依次是G387-C387, A474-G474和G"2-A512，序列首尾的陰影區為引物對。
圖4:是本發明中豬Cavl基因CDS部分序列擴增的電泳圖譜，片段大小為324bp (瓊脂糖膠濃度為 2%)。圖中Marker泳道為DNA分子量標準(DL2000)。
圖5:是豬Cavl基因測序後發現的3個突變位點，從左到右依次是G387-C387， A474-G474和 G512-A512。
圖6:是本發明中豬Cavl基因PCR-HaeIII-RFLP的三種基因型(GG， CG和CC)電泳圖譜。 圖7:是本發明中豬Cavl基因PCR-MbiI-RFLP的三種基因型(AA， AG和GG)電泳圖譜。
具體實施例方式
實施例1:
一、Cavl基因的克隆 1.引物設計 '
利用引物設計軟體Primer 5.0，以由人Cavl基因預測的豬Cavl基因cDNA (Genebank登錄號NM—214438)為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標籤；然後拼接豬表達序列 標籤-重疊群；根據表達序列標籤-重疊群設計出包含完整編碼區的擴增引物。引物由北京奧科生物技術公 司合成，引物對的DNA序列如下
正向引物5' AATCTCCTCAGAGCCTTCATCC3'， 反向引物5' CGCTGTACTGGCAAATTGAAAC3'。 2. PCR產物的純化和測序 (1) PCR擴增
10uL的反應體系中加入cDNA模板0.5nL，雙蒸水7.5^L， 1 OxPCRbuffer lpL, dNTP 0.3nL ,1DmM引 物前後各0.3nL， Taq酶lU。 PCR反應條件為94'C預變性5min後，94"C變性30s、 55。C退火30s、 72°C 延伸25s， 33個循環，最後72'C延伸5min 。 PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(2) PCR產物的純化及測序
利用北京博人泰克生物基因技術公司生產的B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒進行純化回收，具 體方法參考該試劑盒的操作說明書，步驟如下收集足夠的PCR產物上樣電泳，切下目的條帶，膠塊要盡 量小。瓊脂糖凝膠的濃度為1%;按100 U 1膠塊加700 U 1溶膠液的比例，在55。c的烘箱中使凝膠完全溶解； 在溶解後裝入3S柱，9000rpm離心30秒鐘，去掉廢液；C500ul漂洗液漂洗，12000rpm離心30秒鐘， 重複漂洗一次。倒掉廢液後，再於12000rpm離心2Min;在3S柱中加入30 H 1的洗脫緩衝液12000rmp離 心洗脫。純化回收的目的片段就在洗脫所得的液體中；將部分產物送北京奧科生物公司直接測序。
(3) DNA序列同源性檢索鑑定
通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序後獲得的序列與GenBank數據 庫中公布的參考序列進行比對，結果顯示成功克隆得到豬cavl基因含CDS區的部分片段(見圖2)。 二、 Cavl基因編碼區突變位點的掃描
1. 引物設計
利用引物設計軟體Priraer 5.0,以上述測序結果為模板序列，參考通過表達序列標籤-重疊群比對分 析得到的潛在的多態位點，設計出用於多態位點掃描的PCR擴增引物對。引物由北京奧科生物技術公司合 成，所述引物對的DNA序列如下
正向引物5' ACTGGTTTTACCGTTTGC 3'，
反向弓l物5' GAAACTCGAAATTGGCAC 3'。
2. PCR產物的純化和測序 (1) PCR擴增
PCR擴增4個豬種DNA，分別是梅山豬和通城豬(中國地方豬血緣)，大白豬和長白豬(外來豬或國 外豬血緣，下同)。
10uL的反應體系中加入DNA模板0.5nL，雙蒸水7.5^L' 10xPCR buffer lpL， dNTP 0.3pL ，lOmM引 物前後各0.3mL, T叫酶1U。 PCR反應條件為94。c預變性5min後'94。c變性30s、 59。c退火30s、 72°c 延伸25s， 33個循環，最後72'C延伸5min 。
PCR產物經2X瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖4)，用引物擴增得到了 324bp特異性擴增片段'用於回收
5測序。
(2) PCR產物的純化及測序
利用北京博大泰克生物基因技術公司生產的B型小量DNA片段快速膠回收試劑盒進行純化回收，具 體方法參考試劑盒說明節，步驟如下收集足夠的PCR產物上樣電泳，切下目的條帶，膠塊要儘量小。瓊 脂糖凝膠的濃度為1%;按100ul膠塊加？00ul溶膠液的比例，在55。C的烘箱中使凝膠完全溶解；在溶解 後裝入3S柱，9000rpm離心30秒鐘，去掉廢液；CS0OlU漂洗液漂洗，12000rpm離心30秒鐘，重複漂 洗一次。倒掉廢液後，再於12000rpm離心2Min;在3S柱中加入30 U 1的洗脫緩衝液12000rmp離心洗脫。 純化回收的目的片段就在洗脫所得的液體中；將部分產物送北京奧科生物公司測序。
(3) DNA序列中突變位點的確定
通過NCBI-BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)工具，將測序後獲得的序列與GenBank數據 庫中公布的參考序列進行比對，結果顯示4個品種中的克隆測序均獲得成功(見圖3)。
將4個豬品種的測序峰圖導入S叫Man軟體迸行比對分析，結果顯示測序質量很高，在豬Cavl基因 編碼區有3個位點出現明顯的雙峰，這說明該基因在這3個位點處發生了鹼基突變(見圖5)。這3個位點 分別是在序列表SEQ ID NO: 1的第3S7bp處有1個G387- C387的鹼基突變，導致HaeII-RFLP多態性； 在序列表SEQ ID NO: 1的第474bp處有1個A474-G474的鹼基突變，導致Mbil-RFLP多態性。在序列表 SEQ ID NO: 1的第S12bp處有1個G512-A512的鹼基突變，導致Acil-RFLP多態性。 三、PCR-RFLP基因型檢測方法的^t
1. 引物設計
仍然使用上述實驗設計的引物對(用於檢測所述分子標記或稱為檢測鹼基突變)，其DNA序列如下 正向引物5' ACTGGTTTTACCGTTTGC 3'， 反向引物5' GAAACTCGAAATTGGCAC 3'。
2. PCR擴增
lOuL的反應體系中加入DNA模板0.5pL,雙蒸水7.5pL， 10xPCR buffer lpL， dNTP 0.3nL ，lOmM引 物前後各0.3nL， Taq酶lU。 PCR反應條件為94"C預變性5min後，94'C變性30s、 59。C退火30s、 72t) 延伸25s， 33個循環，最後72'C延伸5min 。 2pL PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢觀1』，陽性樣品用於下 一步酶切檢測。
3. RFLP檢測
(1) HaeIII-RFLP檢測分子標記G387-C387
將PCR產物3nL, 10xBufferlnL，限制性內切酶HaeIII為0.2ftL(2U),加雙蒸水補至10*,將樣品 混勻後離心，37'C培養箱放置1042h,用2%瓊脂糖凝皎電泳檢測酶切結果，在紫外燈下拍照，記錄基因 型，結果見圖6。
分子標記基因型分析如圖6所示，三種基因型其中GG型為未發生酶切的純合型(電泳檢測時只有 324bp—條DNA帶)，CC型為發生酶切的純合型(電泳檢測時出現228bp和96bp兩條DNA帶)，CG為 雜合型(電泳檢測時出現324bp, 228bp和96bp三條DNA帶)。
(2) Mbil-RFLP檢測分子標記A474-G474
6將PCR產物3jiL, 10xBuffer ljiL,限制性內切酶Mbil為0.2pL (2U)，加雙蒸水補至10^L，將樣品 混勻後離心，37'C培養箱放置12h，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果，在紫外燈下拍照，記錄基因型， 如圖7。
分子標記基因型分析如圖7所示，三種基因型其中型AA為未發生酶切的純合型(電泳檢測時只有 324bp —條DNA帶)，GG型為發生酶切的純合型(電泳檢測時出現185bp和13%p兩條DNA帶)，AG 為雜合型(電泳檢測時出現324bp, 185bp和139bp三條DNA帶)。
實施例2:
PCR-MbiI-RFLP多態性在不同豬種中的分布狀態檢測
(一) PCR-MbiI-RFLP檢領!l
利用PCR-MbiI-RFLP檢測了 5個豬種，其中包括中國地方豬種血緣，分別是二花臉豬和清平豬，外 來豬或國外豬血緣分別是長白豬，大白豬和杜洛克豬。
(二) 檢測結果分析
該突變在不同豬種中的基因型和等位基因頻率如表1所示。結果顯示在中國地方豬血緣中等位基因G 佔優勢，即在編碼區474位主要以鹼基G的形式存在，在國外豬血緣中等位基因A佔優勢，即在編碼區 474位主要以鹼基A的形式存在，但在外來豬血緣長白豬不明顯。
表1. Cav1基因編碼區474位(A474G)等位基因與基因型頻率在不同品種的分布
基因型與等位基因大白豬杜洛克豬長白豬二花臉豬清平豬
AA185200
AG25500
GG0011114
總計201081114
A0. 950. 750. 560. 000. 00
G0.050.250.441. 001. 00
A表示腺苷 G表示鳥苷實施例3:
本發明克隆的分子標記在免疫性狀關聯分析中的應用 (一)構建家系及基因型掃描
用於關聯分析的免疫性狀資源家系是由武漢市華中農業大學和廣東省華農溫氏畜牧股份有限公司聯 合組建的純種長白豬群體(外來豬血緣)，親本為17頭長白豬公豬和36頭長白豬母豬，Fl代長白仔豬共 302頭。F1代在0、 17、 32日齡採集抗凝血和非抗凝血，採用常規方法對3種病毒抗體水平(豬繁殖與呼 吸綜合症病毒抗體水平、豬瘟病毒抗體水平、偽狂犬病毒抗體水平)和18項血常規進行檢測。
根據免疫性狀資源家系的群體結構和影響因素，申請人運用混合線性模型來分析Cavl基因不同基因
7型對測定的免疫指標的影響，採用SAS(Version 8.1)軟體中Mixed Models程序進行數據處理與統計分析， 模型如下
Y,jkimn = i1十Genotypei + Sexj + Parity^十Environmenti十Sirem + Damn (Sirem) + &^咖 其中Y表示上述免疫指標；u表示每個性狀的均值；Genotype表示基因型效應，(i=3: 1個突變產生 3種基因型),sex表示性別(j=2), parity表示胎次(b2:)， environment表示環境效應(1=2)，這些都是固定效 應；sire表示公畜效應(n^17)， dam表示母畜效應(11=36)，這些是隨機效應；e表示隨機殘差。 (二) Cavl基因分子標記性狀與免疫性狀的關聯分析 (1)分子標記G387-C387 (即OnJ基因HaeIII -RFLP)
應用PCR-HaeIII-RFLP檢測分子標記G387-C387基因型並進行關聯分析，結果表明在檢測群體中， CC基因型個體有90個，CG基因型個體有145個，GG基因型個體有62個。該標記對17日齡的豬繁殖 與呼吸綜合症病毒(藍耳病病毒)抗體水平，白細胞記數，淋巴細胞百分比和大血小板比率影響顯著。其 中GG基因型個體具有更好的免疫力和健康水平，G等位基因是豬免疫力的有利基因，具體表現在攜帶該 等位基因的個體能夠在白細胞，淋巴細胞和血小板等免疫指標方面表現出更旺盛的活力，而且其機體能夠 產生恰當水平的藍耳病病毒陽性抗體。同時G等位基因也是豬O日齡的紅細胞分布寬度的有利基因。具體 結果見表2-6所示
表2: Cavl基因HaeIII-RFLF多態性與0日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因
(0日齡)HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP
豬繁殖與呼吸綜
合徵(藍耳病)0. 4325平均RBC體積0, 9905淋巴細胞絕對值0. 3373
抗體
中間白細胞絕對
豬瘟抗體0. 6025平均HGB量0. 8463值0. 8683
中性粒細胞絕對
偽狂犬抗體0. 4240平均HGB濃度0. 1449值0.1155
白細胞總數0. 0811血小板0. 4441RBC分布寬度0. 0354*
紅細胞總數0. 1381淋巴細胞(％)0. 1298PLT分布寬度0. 6270
血紅蛋白含量0. 2078中間白細胞(％)0. 5980血小板體積0. 6669
紅細胞壓積0.簡中性粒細胞(％)0. 8187大血小板比率0.8150
*表示差異顯著，P<0.05; **表示差異極顯著P<0.01 (以下表格中同)
由表2可知，Cavl基因HaeIII-RFLP多態性與O日齡紅細胞分布寬度顯著關聯(p=0.0354 <0.05)'
此位點對該日齡的其它免疫性狀沒有顯著影響。
8表3 : Cavl基因Haein-RFLP不同基因型仔豬O日齡紅細胞分布寬度的最小二乘均值
基因型紅細胞分布寬度
cc14. 7240±0. 3072
CG14.2703±0.2732
GG14. 5746±0. 3223
P值0. 0354*
CC-CG0. 0199*
CC-GG0. 5739
CG-GG0. 1493
由表3可知，CC基因型仔豬的紅細胞分布寬度顯著高於CG基閔型(p<0.05),也高於GG基因型。 紅細胞分布寬度越小，說明紅細胞功能越正常，異常紅細胞越少，因此G等位基因是O日齡的紅細胞分布 寬度的有利基因。
表4: Cavl基因HaeIII-RFLP多態性與17日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl華因免疫性狀Cavl基因
(0日齡)HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP
豬繁殖與呼吸綜
合徵(藍耳病)0. 0370*平均RBC體積0. 9259淋巴細胞絕對值0.0176*
抗體
豬瘟抗體0. 2366平均HGB量0. 7408中間白細胞絕對 值
偽狂犬抗體0.7173平均HGB濃度0. 1065中性粒細胞絕對 值
白細胞總數0. 0126*血小板0. 1445RBC分布寬度0. 7800
紅細胞總數0. 9001淋巴細胞(％)0. 7，PLT分布寬度0. 0527
血紅蛋白含量0. 7155中間白細胞(％)血小板體積0. 0522
紅細胞壓積0. 9849中性粒細胞(％)大血小板比率0. 0352本
*表示差異顯著，PO,05; **表示差異極顯著P<0.01 (以下表格中同)
由表4可知，Cavl基因Haelll-RFLP多態性與仔豬17日齡豬的繁殖與呼吸症候群(藍耳病)抗體， 白細胞總數，淋巴細胞絕對值和大血小板比率顯著相關(p<0.05)'此位點對其它免疫性狀沒有顯著影響。 表5 : Cavl基因HaelII-RFLP不同基因型仔豬17日齡藍耳病抗體，白細胞總數，淋巴細胞絕對值和大血小板比率的最小二乘均值
基因型藍耳病抗體白細胞總數淋巴細胞絕對值大血小板比率
cc0. 9474±0. 173410. 0700±0. 47797. 2758±0. 527530. 3845 ±1.2761
CG1.0092±0. 16679.'9349±0. 36716. 7747±0.425928. 7126±1. 1095
GG0. 8032 ±0. 180311. 5089±0. 55588. 3363±0. 603431.0398±1. 3931
P值0. 0370*0.0126*0.0176*0. 0352*
CC-CG0. 38270. 78170. 31300. 0811
CC-GG0. 16960.0191*0. 09490. 6128
CG-GG'0. 0134*0. 0038*0. 0047水0. 0284*
由表5可知，GG基因型個體的17日齡的豬繁殖與呼吸綜合症病毒(藍耳病病毒)抗體水平為0.80士0.18, 顯著低於CG基閒型1.01±0.17 (p<0.05),同時也低於CC基因型0.95±0.17，但均處於抗體陽性閾值範圍 內，這說明GG基因型能夠產生足夠的抗體，但其免疫反應又沒有過分亢進；GG基因型個體的17日齡的 白細胞數為11.51±0.56，顯著高於CG基因型9.93±0.37 (p<0.05),並且也高於CC基因型10.07土0.48; 同時GG基因型個體的17日齡的淋巴細胞數為8.34±0.60，顯著高於CG基因型6.78±0.43 (p<0.05)，並 且也高於CC基因型7.28±0.53,這說明GG基因型17日齡仔豬的免疫力較強；GG基因型個體的17日齡 的大血小板比率為31.04±1.39,顯著高於CG基因型28.71±1.11 (p<0.05)，也高於CC基因型30.38±1.28, 足夠的大血小板是血液正常功能的必需，GG基因型17日齡的仔豬大血小板比例更高，其血液更為健康。 上述結果表明G等位基因是n日齡的仔哮免疫力的有利標記。'
表6:Cavl基因HaeIII-RFLP多態性與32日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因
(0日齡) HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP(0日齡)HaeIII-RFLP
豬繁殖與呼吸綜0. 7598平均RBC體積0. 8746淋巴細胞絕對值0. 7729
合徵(藍耳病)
抗體
豬瘟抗體0. 4555平均HGB量0. 9704中間白細胞絕對
值
偽狂犬抗體0. 7198平均HGB濃度0. 9150中性粒細胞絕對
值
白細胞總數0. 6938血小板0. 2316RBC分布寬度0. 9749
紅細胞總數0. 2600淋巴細胞(％)0. 7901PLT分布寬度0. 8538
血紅蛋白含量0, 3598中間白細胞(％)血小板體積0. 8127
紅細胞壓積0. 1991中性粒細胞o)大血小板比率0. 8363
10*表示差異顯著，PO.05;"表示差異極顯著PO.Ol (以卜表格中同)
由表6可知，Cavl基因HaeIII-RFLP多態性與32日齡所測免疫性狀沒有顯著影響。 (2)分子標記A474-G474 (即CaW基因MbiI-RFLP) 應用PCR-Mbil-RFLP檢測分子標記A474-G474基因型並進行關聯分析，結果表明在檢測群體中， AA基因型個體有30個，AG基因型個體有118個，GG基因型個體有147個。該標記對仔豬0日齡的紅 細胞平均血紅蛋白含量和淋巴細胞百分比，17日齡的血小板數和32日齡的血紅蛋白濃度影響顯著。不管 是在0日齡還是17和32日齡，GG基因型仔豬均較其他基因型仔豬具有更好免疫力和健康水平，G等位 基因是豬免疫力和健康水平的有利基因。具體結果見表7-12:
表7: Cavl基因MbiI-RFLP多態性與O日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因
(0日齡)MbiI-RFLP(0日齡)MbiI-RFLP(0日齡)MbiI-RFLP
豬繁殖與呼吸綜
合徵(藍耳病)0. 2780平均RBC體積0. 3029淋巴細胞絕對值0. 4561
抗體
豬瘟抗體0. 3018平均HGB量0. 3910中間白細胞絕對 值0. 4388
偽狂犬抗體0. 5148平均HGB濃度0. 0233*中性粒細胞絕對 值0. 1235
白細胞總數0.0881血小板0.1762RBC分布寬度0. 4289
紅細胞總數0. 7321淋巴細胞(％)0.0121*PLT分布寬度0. 2艦
血紅蛋白含量0. 7836中間白細胞(％)0. 3562血小板體積0. 4897
紅細胞壓積0. 6359中性粒細胞(％)0. 9049大血小板比率0. 3677
*表示差異顯著，PO.05;"表示差異極顯著PO.Ol (以下表格中同)
由表7可知，Cavl基因MbiI-RFLP多態性與0日齡紅細胞平均血紅蛋白濃度和淋巴細胞百分比顯著 關聯(p=<0.05)，此位點對該日齡其它免疫性狀影響不顯著。
表8 : Cavl基因MbiI-RFLP不同基因型仔豬0日齡紅細胞平均血紅蛋白濃度和淋巴細胞百分比的最小
_二乘均值 _
_基因型_紅細胞平均血紅蛋白濃度_淋巴細胞百分比
AA 267.47±4.9820 81.7837±7. 1146
AG 277. 94±3. 8363 75. 3248±4. 7787
GG 276. 15±3. 8187 86. 0835±4. 6978
11P值 ' 0.0233* 0.0121
AA-AG 0.0062** 0.2856
AA-GG 0,0339* 0.4945
_AG-GG_0.4819_0. 0033**_
由表8可知，GG基因型仔豬O日齡的紅細胞平均血紅蛋白濃度為276.15土3.82，顯著高於AA基因型267.47±4.98 (p<0.05)並高於AG基因型277.94±3.84。同時GG基因型仔豬的0日齡的淋巴細胞百分比為86.0835±4.70，顯著高於AG基因型75.3248±4.78 (p<0.05)，也高於AA基因型81.78±7.11,這提示GG基W型0日齡仔豬的血液含氧量較高，免疫力較強，更健康，G等位基因是有利基肉。
表9: Cavl基因MbiI-RFLP多態性與17日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因
(0曰齡)MbiI-RFLP(0日齡)MbiI-RFLP(0日齡)MbiI隱RFLP
豬繁殖與呼吸綜
合徵(藍耳病)0.9100平均RBC體積0. 9521淋巴細胞絕對值0. 6508
抗體
豬瘟抗體0.3101平均HGB量0. 7420中間白細胞絕對 值
偽狂犬抗體0. 7443平均HGB濃度0. 2404中性粒細胞絕對 值
白細胞總數0. 1317血小板0. 0226*RBC分布寬度0. 3025
紅細胞總數0. 9254淋巴細胞(％)0. 4993PLT分布寬度0. 7031
血紅蛋白含量0. 9366中間白細胞(％)血小板體積0.5155
紅細胞壓積0. 9917中性粒細胞(％)大血小板比率0. 5778
*表示差異顯著，PO.05;"表示差異極顯著P<0.01 (以下表格中同)
由表9可知，Cavl基因MbiI-RFLP多態性與仔豬17日齡的血小板數顯著相關(p<0.05)，此位點對
其它免疫性狀沒有顯著影響。
表10 : Cavl基因MbiI-RFLP不同基因型仔豬17日齡血小板數的最小二乘均值
基因型_ 血小板數
AA 422. 08±33. 9423
AG 417. 78±23. 1484
GG 470. 20±23, 0822
12P值 0. 0226 *
'AA-AG 0. 8840*
AA-GG 0. 1240
AG-GG 0.0068林
由表10可'知，GG基因型個體的17日齡的血小板數為470.2土23.08,高於AA基因型422.08±33.94和極顯著高於AG基因型417.78±23.15 (p<0.05),血小板的減少通常是機體疾病的徵兆，所以GG基因型仔豬因其血小板含量較高而更為健康，G等位基因是有利基因。
表11: Cavl基因MbiI-RFLP多態性與32日齡免疫性狀的關聯分析結果
免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因免疫性狀Cavl基因
(0日齡)MbiI-RTLP(0日齡)MbiI-RFLP(0曰齡)MbiI-RFLP
豬繁殖與呼吸綜0. 7629平均RBC體積0. 9'899淋巴細胞絕對值0. 5074
合徵(藍耳病)
抗體
豬瘟抗體0. 2968平均HGB量0. 9745中間白細胞絕對
值
偽狂犬抗體0. 5026平均HGB濃度0. 7027中性粒細胞絕對
值
白細胞總數0. 8687血小板0. 7790RBC分布寬度0. 2789
紅細胞總數0. 3400淋巴細胞(％)0. 1389PLT分布寬度0. 7117
血紅蛋白含量0.0157*中間白細胞(％)血小板體積0. 9706
紅細胞壓積0. 2849中性粒細胞(％)大血小板比率0. 8637
*表示差異顯著，P<0.05; **表示差異極顯著P<0.01 (以下表格中同)
由表11可知，Cavl基因MbiI-RFLP多態性與32日齡所測免疫性狀沒有顯著影響。
表12 : Cavl基因Mbil-RFLP不同基因型仔豬32日齡血紅蛋白含量的最小二乘均值
基因型_血紅蛋白含量
AA 113. 69±4. 0853
AG 123. 35±2. 9492
GG 122. 67±2. 9787
P值 ' 0.0157*
AA-AG 0.0042**
AA-GG 0.0122求AG-GG 0. 7556
由表12可知，GG基因型仔豬32日齡的血紅蛋白含量為122.67士2.98，顯著高於AA基因型113.69±4.09(p<0.05)，也高於AG華因型123.35±2.95，這提示GG基因型32日齡仔豬的血液攜氧能力更強，更健康，G等位基因為有利基因。
14_序列表_
〈110〉華中農業大學
豬免疫力相關分子標記克隆及應用

2009-02-18<160〉 2
<170〉 Patentln version 3. 1〈210〉 1<211〉 620〈212〉 DNA
<213〉 豬(Sus scrofa)
(1)..(620)<223〉
mutation〈222〉 (512).. (512)
mutation〈222> (474).. (474)〈223>
〈220〉 .
mutation '
(387).. (387、

<220〉
<221〉 CDS
〈222> (1)…(537)
〈223>
1
atg tcg ggg ggg caa tac gta gac tea gag gga cat etc tac acc gtcMet Ser Gly Gly Gin Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val1 5 10 . 15
15ccc ate egg gaa cag ggc aac ate tac aag ccc aac aac aag gcc atg 96
Pro lie Arg Glu Gin Gly Asn lie Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met
20 25 30
gca gag gaa atg aac gag aag caa gtg tat gac gcg caci acc aag gag 144
Ala Glu Glu Met Asn Glu Lys Gin Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu
35 40 45
ata gac ttg gtc aac cgc gat ccc aag cat etc aax; geic gac gtt gtc 192
lie Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val
50 55 60
aag att gat ttt gaa gat gtg att gca gaa cca gaa ggg aca cac agt 240
Lys lie Asp Phe Glu Asp Val lie Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser
65 70 75 80
ttc gat ggc ate tgg aag gcc age ttc acc acc ttc act gtg acg aag 288
Phe Asp Gly lie Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
85 .90 95
tac tgg ttt tac cgt ttg ctg tct gcc etc ttt ggc ate cca atg gcg 336Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly lie Pro Met Ala
100 105 110
etc ate tgg ggc att tac ttt gcc att etc tec ttc ctg cac ate tgg 384Leu lie Trp Gly lie Tyr Phe Ala lie Leu'Ser Phe Leu His lie Trp
115 120 125
gcg gtt gta ccc tgc att aag agt ttc ctg att gag att cag tgc ate 432Ala Val Val Pro Cys lie Lys Ser Phe Leu lie Glu lie Gin Cys lie
130 135 140
age cgt gtc tat tec ate tac gtc cac acc ttc tgt gac cca etc ttt 480Ser Arg Val Tyr Ser lie Tyr Val His Thr Phe Cys Asp Pro Leu Phe145 150 155 160
gag get att ggc aaa ata ttc age aat ate cac ate aac 3tg cag aas 528Glu Ala lie Gly Lys lie Phe Ser Asn lie His lie Asn Met Gin Lys
165 170 175
gaa ata tea gtgacatttc朋gggtataa gtstacccaa ttcttctttg 577Glu lie
tcccttttaa ttttcttggt gecaattteg agtttcaatt tga 620
16<210〉 2
〈211> 178
PRT
〈213〉 豬(Sus scrofa)
<■ 2
Met Ser Gly Gly GintTyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val
15 10 15
Pro lie Arg Glu Gin Gly Asn lie Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met
20 25 30
Ala Glu Glu Met Asn Glu Lys Gin Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu
35 40 45
lie Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val
50 55 60
Lys lie Asp Phe Glu Asp Val lie Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser65 70 75 80
Phe Asp Gly lie Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys
85 ' 90 95
Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly lie Pro Met Ala
簡 105 110
Leu lie Trp Gly lie Tyr Phe Ala lie Leu Ser Phe Leu His lie Trp
115 120 125
Ala Val Val Pro Cys lie Lys Ser Phe Leu lie Glu lie Gin Cys lie
130 135 140
Ser Arg Val Tyr Ser lie Tyr Val His Thr Phe Cys Asp Pro Leu Phe145 150 155 160
Glu Ala lie Gly Lys lie Phe Ser Asn lie His lie Asrt Met Gin Lys165 170 175
Glu lie
1權利要求
1、一種與豬免疫力相關的分子標記，它是序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
2、 根據權利要求1所述的分子標記，其特徵在於序列表SEQ ID NO: l的第387bp處有 1個由G387- C387的鹼基突變，導致Haelll-RFLP多態性。
3、 根據權利要求1所述的分子標記，其特徵在於序列表SEQ ID NO: l的第474bp處有 1個由A474-G474的鹼基突變，導致Mbil-RFLP多態性。
4、 根據權利要求1所述的分子標記，其特徵在於序列表SEQ ID NO: l的第512bp處有 1個由G512-A512的鹼基突變，導致Acil-RFLP多態性。
5、 檢測權利要求2-4所述鹼基突變的正、反向引物對的DNA序列如下所示正向引物5， - ACTGGTTTTACCGTTTGC-3，，反向引物5' - GAAACTCGAAATTGGCAC-3'。
6、 一種製備如權利要求l-4所述的分子標記的方法，其特徵在於按照以下步驟用豬CsW基因cDNA為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性80%以上的表達序列標籤； 然後拼接豬表達序列標籤-重疊群；根據表達序列標籤-重疊群設計引物，擴增得到目的片段； 從豬品種耳組織中提取基因組DNA，以豬"W基因cDNA序列為模板設計引物，PCR擴增，PCR 產物純化和克隆測序，獲得如序列表SEQ ID NO: l所示的核苷酸序列，應用PCR-RFLP方法檢測豬CaW基因的多態性。
7、 權利要求卜4任一項所述的分子標記在豬輔助選擇育種中的應用。
8、 權利要求5所述的引物對在豬分子標記輔助選擇育種中的應用。
全文摘要
本發明屬於家畜分子標記製備技術領域，具體涉及一種作為豬標記輔助選擇應用的與豬免疫力相關的分子標記的製備與應用。所述的分子標記由豬Cav1基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所示。序列表SEQ ID NO1的第387bp處有一個G387-C387的鹼基突變，導致HaeIII-RFLP多態性；序列第474bp處有一個A474-G474的鹼基突變，導致MbiI-RFLP多態性；序列第512bp處有一個G512-A512的鹼基突變，導致AciI-RFLP多態性。本發明還公開了擴增Cav1基因部分編碼區所用的引物以及用於分子標記的檢測方法。本發明為豬的標記輔助選擇提供了3個新的分子標記。
文檔編號C12Q1/68GK101487054SQ20091006079
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月19日 優先權日2009年2月19日
發明者梅 餘, 劉向東, 曹建華, 朱猛進, 李世軍, 李新雲, 李長春, 趙書紅 申請人:華中農業大學