與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用的製作方法
2023-05-27 16:58:21
與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記，採用標記引物Xcfd80.2和Xbarc146.1對小麥品種京411的DNA進行PCR擴增，擴增產物在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，獲得的擴增產物的分子量分別為160bp和142bp，即為小麥穗粒重主效基因位點QKws.cas-6A的分子標記。本發明所提供的小麥穗粒重主效基因位點的分子標記可用於檢測小麥品種或品系中是否含有增加穗粒重的主效基因位點QKws.cas-6A，以便快速篩選出具有該基因位點的小麥品種或品系用於育種，可大大加快小麥高產品種的選育進程。
【專利說明】與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及小麥分子生物技術與育種應用領域，具體地說是一種與增加小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用。
【背景技術】
[0002]小麥是世界上最主要的糧食作物之一，也是我國第二大糧食作物，其高產、穩產直接影響到我國人們生活水平和國家糧食安全。提高小麥單產、培育高產新品種是確保我國小麥總產水平、保障糧食安全的根本出路。小麥產量性狀是複雜的數量性狀，受多個數量性狀基因位點(Quantitative trait locus, QTL)控制,具有遺傳力低、受環境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育高產小麥品種時，傳統的育種方法常存在時間長、耗費大、成本高、成果小的問題。分子標記輔助育種是一種採用與特定性狀相關聯的分子標記作為輔助手段進行育種的有效方法，具有不受環境條件限制、在植物發育的各個組織和生育時期均可檢測、選擇效率高的優勢。
[0003]穗數、穗粒數和千粒重是小麥產量構成的三要素。數十年來，在提高小麥產量方面，通過增加穗·數和千粒重來提高小麥產量已經取得較大進展，目前較難取得進一步突破。穗粒重由穗粒數和粒重組成，選育小穗數、穗粒數多，且穗粒數和粒重協調發展的新品種類型，即穗粒重高的高產品種類型是提高小麥產量潛力、培育高產新品種的重要研究方向(何中虎等，作物學報，2011，37:202-215)。因此，研究穗粒重基因，通過分子標記技術，提高小麥穗粒重獲得高產小麥新品種，在育種工作中具有極其重要的意義。
【發明內容】
[0004]本發明的目的就是提供一種與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用，通過發明獲得的與穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記，來檢測小麥品種或品系中是否具有增加穗粒重的基因位點，以加快小麥高產品種的選育進程。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:
本發明所提供的一種與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記，該分子標記為XcfdS0.2 mXbarc146.2，其所述分子標記Zc/a似2的左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標記油7的左端引物序列如SEQ IDNO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
[0006]一種與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記的獲取方法，它包括以下步驟:採用分子標記i/aw.的引物，
左端引物序列 ATAGGGGTTTTGAATCACTCC (如 SEQ ID 勵:1所述)、
右端引物序列 TTGGATTTGCAGAGCCTTCT (如 SEQ ID NO:2 所述)
和分子標記I的引物，
左端引物序列 AAGGCGATGCTGCAGCTAAT (如SEQ ID勵:3所述)、右端引物序列 GGCAATATGGAAACTGGAGAGAAAT (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 4 11101/1)各1.0 μ I, 10XBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5 U/μ 1)0.2 μ l,dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其餘用(1(1!120補足；PCR擴增程序為:94°C預變性7 min;94°C變性30 s，60/51°C退火45 s，72°C延伸60s，34個循環；72°C後延伸7 min ;最後10°C終止反應；擴增產物分別在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，獲得的擴增產物的分子量分別為160 bp和142 bp，即得到與小麥穗粒重主效基因位點QKws.cas-6A緊密連鎖的分子標記。
[0007]本發明所述的與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記在選育高產小麥中的應用，即為將與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記用於檢測小麥品種或品系的方法，該方法它包括以下步驟:
a.用Zc/a似和油抵I的標記引物對小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各1.0 μ 1，IOXBuffer 2.0μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ I) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其餘用ddH20補足;PCR擴增程序為:94°C預變性7 min ;94°C變性30 s，60/51°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環；72°C後延伸7 min ;最後10°C終止反應；
b.將上述擴增產物分別在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，如汾Z2的擴增產物分子量大小為160 bp的分子標記和油I的擴增產物分子量大小為142 bp的分子標記同時出現，則該小麥品種或品係為具有增加穗粒重的基因位點QKws.cas-6A的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬於不具有該基因位點的品種或品系。
[0008]本發明提供的與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進行雜交得到FnF1自交產生F2，採用單粒傳法獲得含有182個株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取所述RIL群體各株系的DNA，採用簡單重複序列標記(SSR標記)、基於表達序列標籤的SSR標記(EST-SSR)和Glu標記對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟體將獲得的所述RIL群體的基因型資料構建小麥的分子遺傳圖譜，其LOD ≥ 3.0 ；
(iv)將所述RIL群體進行田間種植，並對RIL群體的各株系分別進行表型調查，獲得各株系的穗粒重的特徵數據；
(v)利用基於混合線性模型的QTLNetwork2.1作圖軟體對每個分子標記的群體基因型資料與對應每個株系的穗粒重進行連鎖分析，在( 0.001時，染色體6A上的穗粒重QTL均在2-Xbarcl46.1區間，且峰值均在2這一位點上；
實Xcfd80.2熱Xbarc 146.1標記引物在小麥品種京411的DNA中獲得的擴增產物的分子量分別為160 bp和142 bp，即為與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記。
[0009]本發明所述小麥品種京411的DNA是指對小麥品種京411植株的葉片分離提取後獲得的DNA。[0010]本發明所述小麥品種京411和小偃54均為審定品種。其中京411於1991年通過北京市品種審定；1992年通過天津市、山西省和全國品種審定；京411可以從國家農作物種質資源庫索取，全國統一編號為ZM020984。小偃54於2000年通過陝西省品種審定，該品種可以從江蘇省農業種質資源保護與利用研究中心索取，編號為蘇4394。
[0011]本發明所述8%聚丙烯醯胺凝膠是指100 ml聚丙烯醯胺溶液中含有7.8 g丙烯醯胺和0.2 g的甲叉丙烯醯胺。
[0012]本發明公開的小麥穗粒重緊密連鎖的分子標記2取Xbarc 146.1充分體現了小麥品種或品系的穗粒重的主效基因位點，通過該分子標記對小麥衍生品種或品系PCR擴增，可以很快捷地對小麥品種或品系是否具有穗粒重主效基因位點mrs.cas-6A進行判斷，從而快速篩選出具有該 基因位點的小麥品種或品系，加快高產小麥品種的選育進程。
[0013]將本發明提供的與小麥穗粒重主效基因位點QKws.cas-6A緊密連鎖的分子標記方法用於小麥育種，不僅篩選快速精準，不受環境影響，選擇目標明確，而且節約了生產成本，大大提聞了聞廣小麥品種或品系的選擇效率和質量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為小麥穗粒重主效基因位點QKws.cas-6A在染色體6A上的作圖區間。
[0015]圖1中:空心長方形代表染色體，右側是分子標記的名稱，左側數字是標記之間的遺傳距離，單位是CM ;標有黑色下劃線的標記為Ui/做和尬抵I ;染色體左下方的灰色填充的長方形表示QTL作圖區間，KffS代表小麥穗粒重。
[0016]圖2為小麥品種京411為親本的F7代RIL群體的10個衍生品系用Xcfd80.2標記弓I物進行PCR擴增的電泳條帶圖。
[0017]圖3為小麥品種京411為親本的F7 RRIL群體的10個衍生品系用油抵7標記弓I物進行PCR擴增的電泳條帶圖。
【具體實施方式】
[0018]下面實施例用於進一步詳細說明本發明，但不以任何形式限制本發明。
[0019]實施例1
一種與小麥穗粒重主效基因位點緊密連鎖的分子標記，
採用標記引物--/卻.2,
左端引物序列 ATAGGGGTTTTGAATCACTCC (如 SEQ ID 勵:1所述)、
右端引物序列 TTGGATTTGCAGAGCCTTCT (如 SEQ ID NO:2 所述)
和分子標記I的引物，
左端引物序列 AAGGCGATGCTGCAGCTAAT (如SEQ ID勵:3所述)、
右端引物序列 GGCAATATGGAAACTGGAGAGAAAT (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 μ mol/L)各 1.0 μ I, IOXBuffer 2.0 μ I,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 yl，Taq 酶(5 U/μ 1)0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ I,DNA (30 ng/μ I) 2.0 口1，其餘用(1(1!120補足；PCR擴增程序為:94°C預變性7 min;94°C變性30 s，60/5rC退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環；72°C後延伸7 min ;最後10°C終止反應；所使用的PCR儀型號為=AppliedBiosystems Veriti Thermal Cycler (本發明中所有PCR擴增均米用該型號PCR儀);擴增產物分別在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，獲得的擴增產物的分子量分別為160 bp和142 bp,即為小麥穗粒重主效QTL的分子標記。
[0020]本發明提供的與小麥穗粒重主效基因位點mrs.cas-6A緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟:
(i)以小麥品種小偃54為母本、京411為父本進行雜交得到雜種FnF1自交產生F2，採用單粒傳法獲得含有182個株系的F7代RIL群體；
(ii)用SDS法(Sharpet al.，1989)提取上述RIL群體各株系的DNA，採用簡單重複序列標記(SSR標記)和基於表達序列標籤的簡單重複序列標記(EST-SSR標記)對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
其中SSR和EST-SSR標記分析是將篩選株系的DNA進行PCR擴增，擴增產物在所述8%聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳分離分析，根據分子標記篩選結果，篩選出親本間有多態的引物，親本間有多態的引物在所選RIL群體的株系中進行分析，獲得所述RIL群體的基因型資料
(iii)利用MAPMAKER3.0作圖軟體，將獲得的RIL群體的基因型資料構建具有555個標記的小麥的分子遺傳圖譜，以LOD 3.0為標準；其中555個標記是由523個SSR、18個EST-SSR和14個Glu位點組成；
(iv)將RIL群體進行了兩年共六個試驗環境的田間種植及表型鑑定，分別考查不同年份和不同環境條件下的各個 株系的穗粒重，其中兩年六個試驗環境即2006年對照處理、2006年低氮處理、2006年低磷處理、2007年對照處理、2007年低氮處理和2007年低磷處理。
[0021]其中小麥種植方法:RIL群體中每個株系種植4行，行長1.5 m、行間距0.25 m、每行種植30粒種子，正常生長及收穫；穗粒重測定方法:將收穫後各株系的小麥穗子取10穗調查穗粒重，重複3次，取平均值計算穗粒重。
[0022](V)利用基於混合線性模型的QTLNetwork 2.1作圖軟體，以/7 ( 0.001為標準對每個分子標記的群體基因型資料與對應每個株系的穗粒重進行連鎖分析並作圖；
(vi)由QTL分析可得:在染色體6A上分別發現4個環境條件下重複出現穗粒重QTL峰值的位點為Xcfd80.J?，如圖1、表I所示。
[0023]表I穗粒重基因位點QKws.cas-6A的定位結果
【權利要求】
1.一種與小麥穗粒重主效基因位點OfM.cas-6A緊密連鎖的分子標記，其特徵在於該分子標記為Xcfd80.2和Xbarc146.1，其所述分子標記Xcfd80.2的左端引物序列如SEQ IDNO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標記Xbarc146.1的左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
2.一種與小麥穗粒重主效基因位點cas-6A緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特徵在於它包括以下步驟:以Xcfd80.2和Xbarc146.1標記引物對小麥品種京411的DNA分別進行PCR擴增，其PCR 擴增體系為 20 μ l，包括:左、右端引物(10 ymol/L)各 1.0 μ l, IOXBuffer 2.0 μ l,Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ l，Taq 酶(5 U/μ l) 0.2 μl, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6 μ 1，DNA(30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其餘用ddH20補足;PCR擴增程序為:94°C預變性7 min ;94°C變性30s，60/51°C退火45 s，72°C延伸60 s，34個循環；72°C後延伸7 min ;最後10°C終止反應；擴增產物分別在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，獲得對應的擴增產物的分子量分別為160bp和142 bp,即為小麥穗粒重主效基因位點cas-6A的分子標記；其中Xcfd80.2標記左端引物序列如SEQ ID NO:1所述、右端引物序列如SEQ ID NO:2所述;Xbarc 146.1標記左端引物序列如SEQ ID NO:3所述、右端引物序列如SEQ ID N0:4所述。
3.—種檢測小麥品種或品系的方法，其特徵在於它包括以下步驟: a.用和油必.1的標記引物對待測小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，包括:左、右端引物(10 ymol/L)各l.0 μ I, IOXBuffer2.0 μ 1，Mg2+ (25 mmol/L) 1.2 μ 1，Taq 酶(5 U/μ l) 0.2 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 0.6μ 1，DNA (30 ng/μ 1)2.0 μ 1，其餘用 ddH20 補足;PCR 擴增程序為:94°C預變性 7 min ；94°C變性 30 s，60/51°C退火 45 s，72°C延伸 60 s，34 個循環；72°C後延伸 7 min ;最後 10°C終止反應； b.將上述擴增產物分別在8%聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離後，如Zc/a似的擴增產物中分子量大小為160 bp的擴增片段和Xbarc146.1的擴增產物中分子量大小為142 bp的擴增片段同時出現，則該待測小麥品種或品係為具有增加穗粒重的主效基因位點OTm.cas-6A的品種或品系，否則，該待測小麥品種或品系屬於不具有該位點的品種或品系。
4.根據權利要求2所述的與小麥穗粒重主效基因位點OTm.似緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特徵在於所述小麥品種京411的DNA是指對小麥品種京411植株的葉片分離提取後獲得的DNA。
5.根據權利要求2所述的與小麥穗粒重主效基因位點mrs.cas-6A緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特徵在於所述8%聚丙烯醯胺凝膠是指100 ml聚丙烯醯胺溶液中含有7.8 g丙烯醯胺和0.2 g的甲叉丙烯醯胺。
6.根據權利要求3所述檢測小麥品種或品系的方法，其特徵在於所述的小麥的品種或品係為以小麥品種京411為親本，通過採用常規雜交並繁衍至F2代以上獲得的小麥品種或品系。
【文檔編號】C12N15/10GK103436533SQ201310427364
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】許雲峰, 安調過, 王瑞芳, 童依平, 劉冬成, 張愛民, 李濱 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所