能夠降解甲基叔丁基醚的多噬菌菌株及其用途的製作方法

2023-05-27 11:15:16

專利名稱：能夠降解甲基叔丁基醚的多噬菌菌株及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠降解醚及其降解產物的細菌。更精確地，本發明涉及多噬菌(Variovorax)菌株，涉及混合的細菌菌群，還涉及醚及其降解產物的細菌降解方法。本發明還涉及一種或多種所述菌株在淨化受汙染的土壤和水中的用途。
背景技術：
醚(如乙基叔丁基醚(ETBE)、叔戊基甲基醚(TAME)和甲基叔丁基醚(MTBE))被廣泛用作無鉛汽油中的辛烷值強化劑。在芬蘭，MTBE被以9到13的體積百分比摻入汽油中。MTBE(其在歐洲於20世紀80年代取代鉛)和芳香族化合物相比作為辛烷值強化劑(燃料氧化劑)更有效並且從環境觀點看使用更安全。一些叔醇，例如叔丁基醇(TBA)和叔戊基醇(TAA)也是潛在的燃料氧化劑。TBA是降解ETBE和MTBE的中間體。
供水系統中MTBE的檢測集中在汽油洩漏和濺出導致的土壤和地下水汙染。對於MTBE的致癌性、致畸性、致突變性和神經毒性有不同的看法。然而，像其他醚一樣，MTBE具有刺激性味道和氣味，因此在非常低的濃度35μg/l下都可檢測到。美國EPA推薦的飲用水中MTBE最大濃度為在動物中導致可觀察到的影響健康的最低濃度的2萬分之一到10萬分之一。在某些水文地質條件下，水溶性MTBE傾向於比其他汽油成分在地下水中移動得稍快、稍遠。
MTBE是土壤和地下水中的持久性物質。個人消費者可以使用安裝在水龍頭的活性炭柱作為除去MTBE的味道和氣味的暫時性方法。然而，土壤或地下水中不應該存在MTBE和其他汽油成分。這麼大規模的機械的和/或化學的清除方法將是非常棘手和昂貴的(如果可能的話)。最近的研究表明在例如石油災難後自然本身的令人驚奇的生物除汙能力。生物除汙是活的生物體發揮作用以降解土壤、地下物質、水和淤泥中有害的有機汙染物或將有害無機汙染物轉變到環境安全水平的過程。在過去的幾十年中，在燃料氧化醚和其他汽油成分的生物降解潛力和生物清除策略方面進行了研究。
Salanitro等(Salanitro J.P.，Diaz L.A.，Williams M.P.和Wisniewski H.L.(1994)Appl.Environ.Microbiol.602593-2596)和US5 750 346首先表明了通過混合的微生物培養物以34mg/g細胞/小時有氧降解MTBE。研究中觀察到的TBA降解得甚至比MTBE還慢。MTBE的無氧降解首先由Mormille等(Mormille M.R.，Liu S.和Suflita J.M.(1994)Environ.Sci.Technol.281727-1732)報導。公認MTBE的無氧降解緩慢，但是在許多情況下可以通過加入O2、營養物和微生物增加劑得到改善。
Steffan等(Steffan R.J.，McClay K.，Vainberg S.，Condee C.W.和Zhang D.(1997)Appl.Environ.Microbiol.634216-4222)建議丙烷氧化細菌通過切割甲醛使MTBE經過叔丁氧基甲醇降解成TBA。TBA被進一步經過2-甲基-2-羥基-1-丙醇降解成為2-羥基異丁酸(HIBA)，然後HIBA經過2-丙醇、丙酮和羥基丙酮被降解成丙酮酸。
Hardison等(Hardison L.K.，Curry S.S.，Ciuffetti L.M.和HymanM.R.(1997)Appl.Environ.Microbiol.，633059-3067)證明了粘束孢種(Graphium sp.)的一株絲狀真菌ATCC 58400能夠用二乙基醚作為碳源和能源共代謝降解低濃度(750ppb)MTBE。檢測到叔丁基甲酸(TBF)和TBA是MTBE的降解產物。中間體形成的動力學表明TBF的產生在TBA積累之前並且TBF被生物地或非生物地水解產生TBA。
Hanson等(Hanson J.R.，Ackerman C.E.和Scow K.M.(1999)Appl.Environ.Microbiol.，654788-4792)分離了細菌菌株PM1，其能夠利用MTBE作為其唯一碳源和能源。對初始濃度為5、50和500μgMTBE/ml，MTBE被2×106個細胞/ml降解的初始線性速率分別為0.07、1.17和3.56μg/ml/小時。
Pivateau等(Pivateau P.，Fayolle F.，Vandecasteele J-P.和Monot F.(2001)Appl.Microbiol.Biotechnol.55369-373)分離了一株需氧細菌菌株CIP I-2052，其能夠利用TBA和ETBE作為其唯一碳源和能源。最大TBA降解速率是35.8±8.5mg TBA/g細胞乾物質/小時。
在″In Situ and On-Site Bioremediation，The Sixth InternationalSymposium″(2001年6月4-7日，San Diego，California)報導了MTBE通過TBF降解。Martinez-Prado等在大會摘要中描述了一株牝牛分歧桿菌(Mycobacterium vaccae)菌株，其能夠通過TBA共代謝地降解MTBE但是不能利用MTBE作為其唯一碳源和能源。Hyman等描述了一株暫時鑑定為多噬菌菌株的VB-1，其能夠在汽油中發現的芳香族化合物上生長後共代謝地降解MTBE。Soon-Woong等提供了一張海報，其描述了丁烷生長的微生物也能夠經過TBF共代謝地降解MTBE。然而，沒有描述能夠利用MTBE作為其唯一碳源和能源的細菌菌株。
這樣，因為燃料及其添加劑產生的汙染物，如土壤和地下水中的燃料氧化醚不能完全避免，並且生物降解方法仍然相當低效和緩慢，所以仍然需要更有效和更快的降解這些汙染物的生物方法。還需要降解醚的能力增強的新的生物體。本發明現在提供滿足這些需求的方法。
發明概述本發明在於多噬菌(Variovorax)菌株的發現，該菌株能夠降解醚及其降解產物，並且甚至能夠利用MTBE作為它們的唯一碳源和能源。這些菌株能夠快速高效地降解醚及其的降解產物。
本發明提供了多噬菌菌株，其特徵是其能夠利用甲基叔丁基醚(MTBE)作為其唯一碳源和能源。這種菌株提供了一種生物降解例如土壤和地下水中的燃料氧化醚和它們的降解產物的有效途徑。本發明還提供了混合的細菌菌群，其特徵是其含有一種或多種本發明菌株。
本發明還提供了細菌降解醚和它們的降解產物的方法，其特徵是用含有一種或多種能夠利用甲基叔丁基醚(MTBE)作為它們的唯一碳源和能源的多噬菌菌株發酵含有一種或多種醚或它們的降解產物的溶液。
本發明還涉及一種或多種本發明多噬菌菌株在淨化受汙染的土壤和水中的用途。
附圖簡述

圖1描述了本發明細菌菌株的MTBE降解途徑。X表示質子[H]載體。
發明詳述本發明的多噬菌菌株能夠降解醚和它們的降解產物並且能夠利用MTBE作為它們的唯一碳源和能源。所要降解的醚可以是任何醚——線性的或支鏈的醚。這些醚優選地為燃料氧化醚，如乙基叔丁基醚(ETBE)、叔戊基甲基醚(TAME)、二異丙基醚(DIPE)、二乙基醚(DEE)和MTBE。醚的降解產物包括從醚開始經中間代謝最終以二氧化碳結束的代謝途徑中可發現的作為中間體的所有化合物。降解產物優選地為燃料氧化醚的降解產物，如叔醇。一些降解中間體，如TBA(一種叔醇)也可以被該菌株用作唯一碳源和能源。
令人驚奇地發現本發明的細菌能夠比現有技術中的任何微生物更有效地降解MTBE和TBA。本發明的多噬菌菌株優選地屬於奇異多噬菌(Variovorax paradoxus)種。奇異多噬菌的兩個菌株奇異多噬菌JV-1和奇異多噬菌CL-3被保藏在德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zelikulturen GmbH)(DSMZ，Braunschweig，德國)，保藏號分別為DSM 14357和DSM 14433。菌株JV-1能夠代謝至少20毫克、優選至少60毫克、最優選至少80毫克MTBE/克幹細胞/小時。菌株CL-3能夠代謝至少80毫克、優選至少100毫克TBA/克幹細胞/小時。儘管本申請集中於細菌降解燃料氧化醚和它們的降解產物的能力，但是不排除其他生物除汙過程，如芳香族化合物或石油烴類的降解。
通過氣相色譜質譜(GC-MS)和送料試驗研究MTBE和TBA降解的代謝途徑。圖1闡明了所提議的途徑。通過(GC-MS)檢測到TBF和TBA是短暫的中間體，它們於菌株在MTBE上生長時在培養液中積累。代謝物形成的動力學表明TBF積累先於TBA積累。預計叔丁氧基甲醇(在該研究中檢測不到)是MTBE和TBF之間的一種不穩定的中間體。TBA和甲酸一起誘導MTBE降解。從而，提議甲酸將被從TBF切割下來並降解成CO2。釋放的氫然後還原載體(X)，該載體增強了MTBE的降解。
在本發明的一個實施方案中，菌株JV-1被用於降解溶液中MTBE及其降解產物的方法中。在本發明的另一個實施方案中，菌株CL-3被用於降解溶液中的TBA及其降解產物。
在本發明的另一個實施方案中，菌株JV-1和CL-3被一起使用以便降解燃料氧化醚和它們的降解產物。菌株的共培養在降解過程中是有利的，因為在降解途徑開始時菌株JV-1是非常高效的MTBE降解劑而菌株CL-3降解TBA(MTBE的一種降解中間體)非常高效。TBA的有效降解很重要，因為TBA的積累將抑制途徑的第一步。
本發明的方法特別適於降解含有MTBE和/或TBA的溶液。
本發明的菌株適於用在大規模反應器中溶液的生物除汙。所要生物除汙的溶液可以是任何含水溶液，如城市廢水、工業廢水或受汙染的地下水或任何其他受汙染水的汙泥。優選地，該反應器是具有能夠附著微生物的固定載體的有氧生物反應器。優選地，使用含有一種或多種本發明細菌菌株的混合培養物。多種菌株的混合培養物是有利的，因為在水和汙泥中有多種不同汙染物。這樣，需要許多不同降解途徑以便達到所有汙染物的可接受的降解水平。在混合菌群中包含的其他細菌或其他微生物優選從水淨化過程中得到和富集，例如來自活性汙泥。
在本發明的另一個實施方案中，醚和它們的降解產物根據本發明被用來自受汙染土壤(如加油站附近土壤)的水溶液提取然後被生物除汙。
待處理以降解汙染物的溶液可以是任何水溶液，如受汙染的地下水、汙泥或從受汙染土壤收集的水。只要有足夠水分使得微生物能夠生存和發揮功能，那麼可以淨化受汙染的土壤。優選地，將土壤的水分收集到反應器中以保證微生物降解汙染物的最適條件。備選地，水分從土壤循環到反應器並返回到土壤(如果需要，進行幾次)以便保證土壤中汙染物降低到環境可接受的水平。當土壤被例如具有高水溶性的醚汙染時，該實施方案尤其有用。
下面提供的實施例僅僅用於說明的目的，它們並不用於限制本發明的範圍。
實施例實施例1菌株的分離和鑑定通過用MTBE作為唯一碳源和能源選擇性富集從活性汙泥中分離出本發明的菌株。向1升具有50ml包含10mg/l酵母抽提物的CLM培養基(1g K2HPO4·3H2O，0.25g NaH2PO4.2H2O，0.1g(NH4)2SO4，0.05gMgSO4·7H2O和Ca(NO3)2·4H2O溶於1升蒸餾水或去離子水)的氣密燒瓶中加入MTBE(10μl)和50ml汙泥並在22℃下靜止孵育。底物消失後(4個月)加入更多MTBE。6個月後，將該混合的富集培養物懸浮於60ml含有酵母抽提物、微量元素和MTBE(10μl)的CLM培養基中並在22℃下靜止孵育(1個月)，用含有MTBE(10μl/100ml)、微量元素和維生素的CLM培養基進行1∶5(體積/體積)稀釋並孵育直到可看到混濁。保持培養物(叫做CL-EMC-1)接種間隔為1.5-2個月，用MTBE作為唯一碳源和能源。在該階段，用MTBE或TBA作為它們的唯一碳源和能源分離菌株的試圖失敗了。3年後，通過4個月的定期(15天)重新接種，CL-EMC-1的混合富集培養物適應了200mg/l MTBE。
將該培養物(其利用MTBE作為唯一碳源和能源最大達到1.5g/l)塗含有MTBE的CLM瓊脂平板。檢驗分離的菌落生長在含有MTBE的CLM瓊脂上的能力。平板上的菌落通過將單一菌落於CLR瓊脂(在1升含有1.5到2.0％(重量/體積)細菌用瓊脂(Difco Laboratories，Detroit，USA)的CLM培養基中包含1g大豆蛋白腖、0.2g胰蛋白腖和0.2g酵母抽提物)上劃線連續稀釋而純化。將一株分離的純菌株命名為JV-1，其利用MTBE作為其唯一碳源和能源。
將20ml CL-EMC-1培養物加入到1升裝有80ml含0.05g/l TBA、微量元素和維生素的CLM培養基的氣密燒瓶中並在22℃下靜止孵育。底物消失(2周)後再加TBA。一個月後將20ml該培養物用含有TBA(0.1g/l)的CLM培養基1∶10(體積/體積)稀釋並在28℃、152轉/分鐘下在旋轉搖床上孵育直到混濁(7天)。該步驟重複3次。然後將培養物在22℃下在含有0.05g/lTBA的CLM瓊脂上塗平板。檢測分離的菌落用TBA作為唯一碳源和能源在CLM培養基上生長的能力。劃線(通過在CLR瓊脂上連續稀釋單菌落)使生長在平板上的菌落變純。一株分離的純菌株(命名為CL-3)利用TBA高達7g/l。
DSMZ(德國微生物菌種保藏中心，Braunschweig，德國)鑑定了這兩株分離的菌株JV-1和CL-3。兩株菌株都有奇異多噬菌的特點。它們是革蘭氏陰性細菌，具有棒狀細胞，寬0.5-0.7μm，長1.5-3.0μm。16SrDNA的部分序列和多噬菌具有99.3％的相似性，其他相似性要低得多。細胞脂肪酸圖譜和生理學檢驗數據清楚地證實了該結果。生理學檢驗結果在下表1中給出表1反應 菌株JV-1菌株CL-3革蘭氏反應- -3％以下酶的溶菌作用 + +氨肽酶(Cerny) + +氧化酶弱 +過氧化氫酶+ +色素形成 黃色黃色遊動性+弱 無數據鞭毛 + 無數據在30℃生長+ +ADH - -
脲酶++明膠水解--自養生長--硝化還原--反硝化作用 --利用葡萄糖 ++乙酸苯酯++檸檬酸 ++蘋果酸 ++阿拉伯糖++葡萄糖酸++己二酸 弱 弱海藻糖 +無數據丙二酸 ++L-扁桃酸--[反]烏頭酸 ++對羥基苯甲酸++L-組氨酸++Etanolamine --甘露醇 ++果糖++(D-果糖)水楊苷 ++蔗糖--阿糖醇 ++肌醇++2-酮葡萄酸 ++間酒石酸++
檸康酸 無數據+乙酸 無數據+Sebacinate 無數據+庚二酸 無數據+D-木糖 無數據+水解esculine - -在2升含有0.2升如下面的實施例2所描述的具有微量元素與維生素的基本鹽培養基的瓶中研究菌株JV-1和CL-3在丁烷上的生長。瓶子用裝有襯了特氟隆的矽氧烷隔墊的螺旋帽密閉。將50ml、100ml和200ml體積的丁烷(純度99％)加入瓶中作為超壓。在540nm處初始吸光度為0.1(30mg/l細胞乾重)時接種後在22℃對菌株JV-1和CL-3平行地靜止孵育和於旋轉搖床(152轉/分鐘)上孵育。在任何瓶中孵育5個月期間在培養液中沒有檢測到生長(540nm的吸光度小於0.1)。
實施例2 實驗室規模的MTBE和TBA的降解在2升含有0.2升培養基的用帶特氟隆包裹的塞子封口的氣密燒瓶中在實驗室條件下研究菌株JV-1在MTBE上和CL-3在TBA上的生長。用於富集和培養本發明細菌的基本鹽培養基的成分如下(g/l蒸餾水或去離子水)K2HPO4·3H2O，1；NaH2PO4·2H2O，0.25；(NH4)2SO4，0.1；MgSO4·7H2O，0.05；Ca(NO3)2·4H2O，0.02；FeCl3·6H2O，0.002，pH7.0-7.3。該培養基還含有下面的元素(mg/l)H3BO3，2；FeSO4·7H2O，2；Na2SeO3·5H2O，1；Na2MoO4·2H2O，1；CoCl2·6H2O，1；MnSO4·2H2O，0.5；ZnSO4·7H2O，0.5；AlCl3·6H2O，0.05；NiCl2·6H2O，0.02；CuSO4·7H2O，0.01，pH 7.0-7.3。在121℃下對培養基滅菌20分鐘。維生素儲存液如下(mg/l蒸餾水或去離子水)核黃素，10；煙酸，5；泛酸鈣，5；硫胺素，5；葉酸，2；鹽酸吡哆素，1；維生素B12，1；生物素，1。將維生素溶液(10ml)過濾除菌並加入高壓滅菌冷卻後的培養基中。菌株JV-1的接種密度是每毫升培養基1.1×106到1.2×107個細胞，菌株CL-3的接種密度是每毫升培養基1.6×106到1.1×107個細胞。加入合適的碳源(MTBE或TBA)。在22℃下靜止孵育菌株JV-1，在28℃下於旋轉搖床上孵育菌株CL-3。
實施例3對新途徑的氣相色譜質譜研究用氣相色譜質譜(GC-MS)(用裝備有HP5973質量選擇探測器和PONA交聯的甲基矽氧烷毛細管柱(50m×0.2mm；0.5μm膜厚，AgilentTechnologies，U.S.A))分析從實施例2得到的培養液樣品中的MTBE、TBF和TBA。將爐溫保持在35℃15分鐘，然後以10℃/分鐘升溫到70℃，保持在該溫度3分鐘然後以20℃/分鐘升溫到250℃並保持在該溫度5分鐘。載氣(氦氣)保持在恆定的柱流速0.5ml/分鐘。通過電子離子化(70eV)用完全掃描監測分析樣品(m/z＝25到200)。通過法定標準和GC-MS軟體(Wiley275)中的資料庫進行化合物鑑定的質譜解析。
實施例4 實驗室規模的MTBE的降解和與現有技術的比較菌株JV-1生長在上面提到的條件下，用MTBE作為唯一碳源和能源。表明該菌株降解MTBE比Hanson等報導的菌株PM1(現有技術中已知的最好的MTBE降解細菌)快得多。實驗結果和JV-1與PM1的比較如表2所示。
表2.奇異多噬菌JV-1株與能夠降解MTBE的菌株PM1的比較


*＝Hanson等測量的。
#＝對於初始濃度分別是5、50和500μg MTBE/ml時，2×106個細胞/ml降解MTBE的初始速度分別是0.07、1.17和3.56μg/ml/小時。
實施例5 實驗室規模的TBA降解和與現有技術的比較菌株CL-3在上面提到的條件下生長，用TBA作為唯一碳源和能源。表明該菌株降解TBA比菌株CIP I-2052(Pivateau等報導，現有技術中已知的最好的TBA降解細菌)快得多。實驗結果和CL-3與CIP I-2052的比較如表3所示。
表3.奇異多噬菌CL-3株與能夠降解TBA的菌株Burkholderiacepacia CIP I-2052的比較

*＝Pivateau等所測實施例6大規模生物除汙三年內在大規模實驗中試驗本發明的菌株。在帶有固定載體的100 m3有氧生物反應器中孵育MTBE汙染的地下水。將反應器用含有菌株JV-1和CL-3以及其他從活性汙泥中分離的細菌的混合細菌培養物進行接種。流速是35m3地下水/天。平均水溫是16℃，但是發明人已經證明菌株JV-1甚至可以在8℃下降解MTBE。反應器運行3年。觀察到MTBE和其他有機汙染物的顯著減少。實驗結果如下表

PCT/RO/134表


只對受理局

只對國際局

權利要求
1.多噬菌菌株，其特徵在於它能夠利用甲基叔丁基醚(MTBE)作為其唯一碳源和能源。
2.權利要求1的菌株，其特徵在於它屬於奇異多噬菌(Variovorax paradoxus)種。
3.權利要求2的菌株，其特徵在於它是奇異多噬菌JV-1，其保藏號是DSM 14357。
4.權利要求2的菌株，其特徵在於它是奇異多噬菌CL-3，其保藏號是DSM 14433。
5.混合的細菌菌群，其特徵在於它含有一種或多種權利要求1到4任一項的菌株。
6.用細菌降解醚和它們的降解產物的方法，其特徵是用含有一種或多種能夠利用甲基叔丁基醚(MTBE)作為它們的唯一碳源和能源的多噬菌菌株的細菌菌群發酵含有一種或多種醚或它們的降解產物的溶液。
7.權利要求6的方法，其特徵是用含有一種或多種屬於奇異多噬菌種的菌株的細菌菌群發酵。
8.權利要求7的方法，其特徵是用含有奇異多噬菌JV-1的細菌菌群發酵，奇異多噬菌JV-1的保藏號是DSM 14357。
9.權利要求7的方法，其特徵是用含有奇異多噬菌CL-3的細菌菌群發酵，奇異多噬菌JV-1的保藏號是DSM 14433。
10.權利要求6到9任一項的方法，其特徵是發酵燃料氧化醚或它們的降解產物。
11.權利要求10的方法，其特徵是發酵含有一種或多種下列化合物乙基叔丁基醚(ETBE)、叔戊基甲基醚(TAME)、二異丙基醚(DIPE)、二乙基醚(DEE)、甲基叔丁基醚(MTBE)和叔丁基醇(TBA)的溶液。
12.權利要求11的方法，其特徵是發酵含有甲基叔丁基醚(MTBE)和叔丁基醇(TBA)的溶液。
13.一種或多種權利要求1的多噬菌菌株的用途，用於淨化受汙染的土壤或水。
全文摘要
即使是少量的用作汽油中辛烷值強化劑的水溶性醚也是土壤和地下水中的幹擾性成分，因為它們具有刺激的味道和氣味。本發明涉及受汽油汙染的土壤和地下水的生物淨化，更具體地，涉及能夠降解醚和它們的降解產物的多噬菌菌株，還涉及含有所述細菌的混合細菌菌群。本發明還涉及醚和它們的降解產物的細菌降解方法，並涉及本發明的一種或多種多噬菌菌株在受汙染的土壤和地下水的淨化中的用途。
文檔編號B09C1/00GK1571833SQ02820518
公開日2005年1月26日 申請日期2002年10月16日 優先權日2001年10月17日
發明者J·沃蒂拉, G·扎伊採夫 申請人:克萊沃爾有限公司