具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素bpn』變異體的製作方法

2023-05-27 07:21:11 1

專利名稱：具有更低吸附性和更高水解能力的枯草溶菌素bpn』變異體的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於多種清潔組合物的新型的酶變異體(variant)，以及編碼這些酶變異體的基因。背景酶構成了天然存在的蛋白質的最大一類。每類酶一般說來催化(加速一個反應而自身並沒有損耗)一個不同類別的化學反應。一類通稱為蛋白酶的酶，因為其水解(通過在被切開的化學鍵的兩側吸收水分子的H和OH部分而將一個化合物分解成兩個或多個更簡單的化合物)其它蛋白的能力而為人所知。通過將天然存在的和蛋白質工程化的蛋白酶作為添加劑摻入洗滌清潔劑製備物，可以利用其水解蛋白的能力。衣物上的許多汙物是蛋白質類的，許多特定的蛋白酶可以從根本上改善對這類汙物的清除。
遺憾的是，這些蛋白在它們天然的、細菌環境中的功效水平往往不能轉移至相對非天然的洗滌環境。具體地說，蛋白酶的特性例如熱穩定性、pH穩定性、氧化穩定性和底物特異性，對於該酶在天然環境之外使用來說並非必須是最優的。
蛋白酶的胺基酸序列決定了該蛋白酶的特性。蛋白酶胺基酸序列的變化可以在不同程度上改變酶的性質，或者甚至可以使酶失活，這依賴於胺基酸序列中變化的位置、性質和/或重要性。有幾種途徑已被用來改變野生型蛋白酶的胺基酸序列，以改善它們的特性，其目標是提高這些蛋白酶在洗滌環境中的功效。這些途徑包括改變胺基酸序列，以便在完全不同的條件下增強熱穩定性和改善氧化穩定性。
儘管本領域中描述的途徑多種多樣，對於用作清潔各種表面的蛋白酶的新的有效變異體仍存在著持續的需求。本發明的目標本發明的目標之一是提供枯草溶菌素(subtilisin)酶變異體，它與野生型的酶相比水解能力得到了改善。
本發明的另一個目標是提供包含這些枯草溶菌素酶變異體的清潔組合物。概述本發明涉及枯草溶菌素BPN』的變異體，它具有野生型BPN』胺基酸序列的經修飾的胺基酸序列，該野生型胺基酸序列包括一個第一環狀區、一個第二環狀區、一個第三環狀區、一個第四環狀區和一個第五環狀區；其中經修飾的胺基酸序列在一個或多個環狀區中的特定位點，包含與存在於野生型枯草溶菌素BPN』中的不同的胺基酸(即取代)，由此，BPN』變異體與野生型枯草溶菌素BPN』相比，對不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本發明還涉及編碼該枯草溶菌素BPN』變異體的基因。本發明還涉及用於清潔多種表面的包含該枯草溶菌素BPN』的組合物。說明I.枯草溶菌素變異體本發明涉及枯草溶菌素酶，特別是BPN』，通過使編碼該酶的不同核苷酸序列突變來修飾該酶的胺基酸序列。與野生型枯草溶菌素相比，本發明的修飾過的枯草溶菌素酶(以下稱作「『BPN』變異體」)對於不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本發明還涉及編碼該BPN』變異體的突變基因。
本發明的枯草溶菌素酶屬於一類通稱為蛋白酶的酶類。蛋白酶是使肽鍵斷裂的催化劑。蛋白酶中的一類是絲氨酸蛋白酶。絲氨酸蛋白酶可以通過如下事實辨別在酶的活性部位有一個必需的絲氨酸殘基。
酶水解可溶性底物的速率隨酶濃度而增加，這一發現已經被充分地證明了。於是，對於表面結合的底物，例如在許多清潔應用中所碰到的，水解的速率隨表面濃度的增加而增加的結論似乎是合情合理的。這已被證明是事實。(P.F.布魯德III和D.S.羅奇，LANGMUIR，「枯草溶菌素BPN』固定化底物上的活性」，第8卷，1325-1329頁(1992))。實際上，當酶的表面濃度不同時，對於不可溶底物的反應速率與表面濃度線性相關。(D.N.羅賓和M.D.波爾，「蛋白酶對蛋白-溶液界面水解反應的催化作用」，收錄於《(聚合物溶液、混合體和界面》，由I.諾達和D.N.羅賓編著，艾爾斯韋爾，464頁(1992))。令人驚異的是，當力圖將研究中的原理應用於突變體蛋白酶以便得到更好的清潔效果時，我們並沒有發現吸附較多的酶有更好的清潔效果。實際上，我們吃驚地確認事實是相反的酶對底物的更低的吸附性導致對底物的更多的水解(即更好的清潔效果)。
但是我們不願被理論所束縛，當用一種變異體與其它的比較時，我們相信改善的效果來源於如下的事實吸附性較低的酶也結合得更不緊密，因此該酶在將被清除不可溶蛋白質的底物表面上有更大的移動性。在可比的酶溶液濃度上，這種增加移動性的優點足以超過任何通過向表面釋放更高濃度的酶所帶來的好處。
這裡描述的突變是為了改變(即降低)酶對表面結合的汙物的吸附性而設計的。在BPN』中，一定的胺基酸構成了酶分子的外環。出於討論的目的，這些環將被稱為第一、第二、第三、第四和第五環狀區。具體地說，位點59-66構成第一環狀區；位點95-107構成第二環狀區；位點126-133構成第三環狀區；位點154-167構成第四環狀區；位點187-191構成第五環狀區；位點199-220構成第六環狀區(位點編號類似於野生型枯草溶菌素BPN』胺基酸序列(SEQ ID NO1)中的位置)。
我們相信這些環狀區在酶分子對表面結合多肽的吸附性中起了極其重要的作用，並且在一個或多個這些環狀區上的特異性突變將對吸附性具有顯著的影響。但是我們不願被理論所束縛，相信至少有兩個原因使環狀區對BPN』分子的吸附性是非常重要的第一，包含環狀區的胺基酸可以與分子所暴露的任何表面緊密接觸；第二，環狀區與BPN』分子的活性部位和結合區的相似性，使它們在酶對表面結合底物(多肽/蛋白質汙物)的催化性吸附方面有一定作用。
如此處所使用的，「變異體」表示一種酶，它具有與野生型不同的胺基酸序列。
如此處所使用的，「突變BPN』基因」表示編碼BPN』變異體的基因。
如此處所使用的，「野生型枯草溶菌素BPN」指被SEQ ID NO1所描述的枯草溶菌素酶。枯草溶菌素BPN』的胺基酸序列被J.A.韋爾斯、E.費拉裡、D.J.亨那、D.A.艾斯泰爾和E.Y.陳在《(核酸研究)》第II卷，7911-7925(1983)中進一步描述，在此引入作為參考。
如此處所使用的，術語「野生型胺基酸序列」包含SEQ ID NO1，同樣也包含在除59-66，95-107，126-133，154-167，187-191和199-220任一個之外的任何位點的胺基酸序列被修飾的SEQ ID NO1。
如此處所使用的，「更加親水的胺基酸」指參考下表中的親水性，與所提到的胺基酸相比具有更高的親水性的任何胺基酸。下面的親水性表(表1)按照親水性增加量的降序排列胺基酸(見T.P.霍普.和K.R.伍茲.，「從胺基酸序列預測蛋白質抗原決定簇」，美國國家科學院院刊，第78卷，3824-3828頁，1981，在此引入作為參考)。
表1

表1還表明了哪種胺基酸帶有電荷(這一特性是基於大約8-9的pH值)。帶有正電荷的胺基酸是精氨酸和賴氨酸，帶有負電荷的胺基酸是穀氨酸和天門冬氨酸，其它的胺基酸是中性的。在本發明的優選實施方案中，取代胺基酸是中性的或者是帶負電荷的，更優選的是帶有負電荷的(即穀氨酸或天門冬氨酸)。
因此，舉例來說，「用中性的或帶有負電荷的，與穀氨醯胺親水性相同或更強的胺基酸取代穀氨醯胺」是指穀氨醯胺將被天門冬醯胺(它與穀氨醯胺有相同的親水性)，或絲氨酸、穀氨酸、天門冬氨酸(它們比穀氨醯胺親水性更強)取代；其中的每一種胺基酸都是中性的或帶有負電荷的，並且與穀氨醯胺相比具有更高的親水性值。類似的，「用中性的或帶有負電荷的，與脯氨酸相比親水性更強的胺基酸取代脯氨酸」是指脯氨酸將被穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、穀氨酸或天門冬氨酸取代。
在本發明的一個實施方案中，BPN』變異體具有一個野生型胺基酸序列的修飾的胺基酸序列，其中修飾的胺基酸序列包含一個位於第一、第二、第三、第四或第五環狀區中一個或多個位置的取代；通過該取代，BPN』變異體與野生型枯草溶菌素BPN』相比，對於不可溶底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。
在本發明的另一個實施方案中，BPN』變異體還包含一個或多個位於第六環狀區的取代。
在本發明優選的實施方案中，位於一個或多個環狀區的一個或多個位點的取代胺基酸參照表1，是中性的或帶有負電荷的，並且與野生型胺基酸序列主體位點的胺基酸相比，親水性相同或更強，優選的是親水性更強的。A.位於第一環狀區的取代當取代發生在第一環狀區時，該取代發生在位點59、60、61、62、63、65或66中的一個或多個位點。
當取代發生在位點59時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點60時，取代胺基酸是穀氨酸。
當取代發生在位點61時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點62時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點63時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點65時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點66時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸。B.位於第二環狀區的取代當取代發生在第二環狀區時，該取代發生在位點95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中的一個或多個位點。
當取代發生在位點95時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
當取代發生在位點96時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
當取代發生在位點97時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點98時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
當取代發生在位點99時，取代胺基酸是穀氨酸。
當取代發生在位點100時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點101時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點102時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點103時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點104時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
當取代發生在位點105時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點106時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或纈氨酸。
當取代發生在位點107時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。C.位於第三環狀區的取代當取代發生在第三環狀區時，該取代發生在位點126、127、128、129、130、131、132或133中的一個或多個位點。
當取代發生在位點126時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。
當取代發生在位點127時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點128時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點129時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點130時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點131時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點132時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點133時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。D.位於第四環狀區的取代當取代發生在第四環狀區時，該取代發生在位點154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167中的一個或多個位點。
當取代發生在位點154時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點155時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點156時，取代胺基酸是天門冬氨酸。
當取代發生在位點157時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點158時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點159時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點160時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點161時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點162時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點163時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點164時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點165時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
當取代發生在位點166時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸。
當取代發生在位點167時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸。E.位於第五環狀區的取代當取代發生在第五環狀區時，該取代發生在位點187、188、189、190或191中的一個或多個位點。
當取代發生在位點187時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
當取代發生在位點188時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點189時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或纈氨酸。
當取代發生在位點190時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點191時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。F.位於第六環狀區的取代當取代發生在第六環狀區時，該取代發生在位點199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一個或多個位點。
當取代發生在位點199時，取代199位的胺基酸是半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點200時，取代200位的胺基酸是組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點201時，取代201位的胺基酸是甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點202時，取代202位的胺基酸是脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點203時，取代203位的胺基酸是甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點204時，取代204位的胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點205時，取代205位的胺基酸是亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點206時，取代206位的胺基酸是脯氨酸、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點207時，取代207位的胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點208時，取代208位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點209時，取代209位的胺基酸是異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點210時，取代210位的胺基酸是丙氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點211時，取代211位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點212時，取代212位的胺基酸是穀氨醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點213時，取代213位的胺基酸是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點214時，取代214位的胺基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點215時，取代215位的胺基酸是蘇氨酸、脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點216時，取代216位的胺基酸是組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點217時，取代217位的胺基酸是亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點218時，取代218位的胺基酸是穀氨醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點219時，取代219位的胺基酸是脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
當取代發生在位點220時，取代220位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。G.酶變異體的製備實施例1變異的BPN』基因包含野生型枯草溶菌素BPN』基因的噬菌體質粒(pSS-5)(C.米欽森和J.A韋爾斯，(1989)，「枯草溶菌素BPN』中二硫鍵的蛋白質工程」，《生物化學》，第28卷，4807-4815頁)被轉化至大腸桿菌ung株CJ236內，並且使用VCSM13助手噬菌體生成一個單鏈的包含尿嘧啶的DNA模板(T.A.庫克爾，J.D.羅勃茲和R.A.扎庫，「不用表型選擇的快速、有效的位點特異性突變」，《(酶學方法》第154卷，367-382頁，(1987)；被P.D.約肯伯格、F.惠特尼、J.蓋思索德和J.邁可克來所修改，「使用包含尿嘧啶的DNA和噬菌體質粒載體的位點特異性的體外突變」，收錄於《特異性突變-一種實施方案》，由M.J.邁克佛森編著，第27-48頁，(1991)；二者均在此引入作為參考)。使用採萊和史密斯的單鏈引物位點特異性的基因突變修飾的方法(M.J.採萊、和M.史密斯，「使用M13衍生載體的寡聚核苷酸特異性突變在DNA任何片段中產生點突變的有效的和通用的過程」，收錄於《核酸研究》第10卷，第6487-6500頁，(1982)，在此引入作為參考)生成所有的突變體(基本上如上文中約肯伯格等人所介紹，1991)。寡聚核苷酸的使用應用生物系統公司380B DNA合成儀生成。基因突變反應產物被轉化至大腸桿菌株MM294內(美洲型培養收集物大腸桿菌33625)。所有的突變體都通過DNA測序確認，並且分離出的DNA被轉化至枯草桿菌表達株BG2036中(M.Y.揚、E.費拉裡和D.J.亨那，(1984)，「枯草桿菌核蛋白酶基因的克隆以及使用克隆的基因在體外產生缺陷型突變」，收錄於《微生物學雜誌》第160卷，15-21頁)。對某些突變體，尿嘧啶模板是使用框架終止密碼子突變的修飾過的pSS-5來產生，該突變位於胺基酸217位。寡聚核苷酸被設計為在217位恢復正常的閱讀框架，並且還編碼位於59、60、61、62、63、64、65、66；95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107；126、127、128、129、130、131、132、133；154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167；187、188、189、191、191；199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219和220位的隨機取代(在這些密碼子上，用來編碼三個鹼基的所有四種核苷酸的等克分子量的和/或不相等的混合物)。改正框架終止子並能夠生成功能性酶的突變被它們消化酪蛋白的能力所鑑別。隨機取代由DNA測序所確定。實施例2發酵包含枯草溶菌素有益突變的枯草桿菌細胞(BE2036)在1升的LB-葡萄糖培養基培養基中生長至中對數期，然後接種至總體積為10升的BiostatED發酵器中(B.布勞恩生物技術公司，艾倫鎮，賓夕法尼亞)。發酵介質包含酵母提取物、澱粉、消泡劑、緩衝液和痕量礦物質(見《發酵一種實施方案》，B.邁克尼爾和L.M.哈韋編著，1990)。在發酵過程中，培養基的pH值恆定保持在7.0。加入氯黴素用於對突變質粒的抗生素篩選。細胞在37℃生長過夜至A600達到約60，然後收穫。實施例3純化發酵培養基經過如下的步驟來獲取純化的酶。培養基通過離心清除枯草桿菌細胞，用一個100K的隔斷膜除去細小的微粒而獲澄清。之後在一個10K的隔斷膜上離心，然後用0.025M的MES緩衝液(2-(N-嗎啉)乙烷磺酸)進行流動透析以降低離子強度並將pH值調至5.5。將酶加於陽離子交換層析柱或者親和吸附層析柱進行進一步純化，用氯化鈉或丙烯乙二醇梯度液從層析柱上將酶洗脫(見R.K.司寇普思，《蛋白質純化原理和實踐》，斯普林格-弗拉格，紐約(1984)，此處作為文獻引用)。
pNA檢測法(E.G.德爾瑪、C.拉格曼、J.W.布魯德裡克和M.C.喬卡斯，《分析生物化學》第99卷，316-320頁，(1979)，此處作為文獻引用)被用來測定在梯度洗脫過程中所收集的分部中的活性酶的濃度。該方法測量的是當酶水解可溶性合成底物——琥珀醯-丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-p-肖基苯胺(sAAPF-pNA)時硝基苯胺釋放的速率。水解反應所產生的黃顏色的速率用分光光度計在410nm測量，它於活性酶的濃度成比例。另外，在280nm的吸收度測量用於測定總蛋白濃度。活性酶/總蛋白比率給出了酶的純度，並且用於鑑別將被合併作為貯存液的分部。
為了避免在貯存過程中酶的自我分解，在從層析柱上收穫的合併分部中加入等重量的丙烯乙二醇。純化步驟一旦結束，就用SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳)檢測酶貯液的純度，並且通過使用II-T型酪氨酸抑制劑的活性位點滴定法測定絕對酶濃度，該抑制劑是從西格瑪化學公司購買的火雞蛋清(聖路易斯，密蘇裡州)。測量出的轉換因子將表明在酶分子不同位點的哪一種變化導致的酶變異體比野生型的酶對可溶性底物pNA具有更高的活性。
在使用前的準備中，酶貯液要經過Sephadex-G25(法瑪西亞公司，匹茲堡，新澤西州)分子大小分離柱洗脫以去除丙烯乙二醇並轉換緩衝液。酶貯液中的MES緩衝液被轉換成0.1M的包含0.01M CaCl2的Tris緩衝液(三(羥甲基氨基甲烷)，並且pH值用HCl調至8.6。所有的實驗都是在恆溫25℃時，pH值8.6的Tris緩衝液中進行的。H.酶變異體的特性實施例4模型表面製備從CPG公司(法菲爾德，新澤西州)購買的氨丙基控制的多孔玻璃(CPG)被用於共價結合從比切姆公司(託倫斯，加裡福尼亞)購買的sAAPF-pNA底物。反應進行於二甲亞碸中，(1-乙基-3-[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺鹽酸鹽)(EDC)作為偶聯試劑。完成之後(用pNA檢測法監控)，除去多餘的溶劑，CPGsAAPF-pNA用二甲亞碸(DMSO)和雙蒸水清洗。隨後用N2淨化的烘箱在70℃左右乾燥。反應方案和固定底物的製備如P.F.布魯德III和D.S.羅奇，「枯草溶菌素BPN』固定化底物上的活性」，拉格繆，第8卷，1325-1329頁，(1992)描述所進行，此處作為文獻引用。
CPG表面將擁有62,000+7,000個pNA分子/μm2。與收到的CPG公司報告的CPG的表面區域的值50.0m2/g相比，保持不變。這表明加入sAAPF-pNA的過程沒有損壞多孔結構(平均直徑為486A)。實施例5表面水解檢測法通過使用CPGsAAPF-pNA，對酶變異體的吸附和結合CPG的多肽的水解可以在一個簡單的實驗中測量。取少量的酶變異體加入除氣的含有CPGsAAPF-pNA的燒瓶中。燒瓶放於腕狀動作搖床上振搖90分鐘，在此期間，搖床於不同的時間間隔停止(例如，在吸附水解的早期階段-如前20分鐘，每2分鐘-在接近實驗結束的階段每10分鐘)。CPGsAAPF-pNA可以下沉，在澄清液中取樣。實驗步驟和吸附及水解的計算方法如上述Brodeet al.，1992描述所進行。
在本實驗的過程中，監控所有的酶抗自我分解的穩定性，並且不應顯示有可覺察的自我分解損失。因此，酶的吸附可以通過測量溶液的消耗來檢測。最初的酶變異體的濃度與在每個獨立的時間點測量的濃度之差給出酶變異體被吸附的量。pNA從表面被水解的量通過讀取樣品在410nm的吸收度的整數部分來測量。pNA的總量是通過計算將取樣的量與殘留在燒瓶中的量相加得出。該值通過減去沒有酶時pNA被Tris緩衝液水解的量來修正。基本水解量佔總水解量的比例隨酶的效率的不同而在7-29％的範圍內變化。實施例6可溶性底物的動力學分析可溶性底物sAAPF-pNA的水解的速率通過在DU-70分光光度計上測量410nm處光吸收度隨時間的增加值來檢測。每次動力學測定，當底物濃度從90-700μM sAAPF-pNA變化時，酶濃度保持不變，在6-10納摩爾之間。在900秒的時間內，每秒取一個吸收度數據點，並且這些數據被轉換成一個LOTUSTM表單(LOTUS開發公司，劍橋，麻薩諸塞州)。動力學常數的分析是通過執行標準的蘭唯沃·布克分析法進行的，該法將實驗初始部分(通常是第一分鐘)的數據擬合成線性復原曲線而得出v0值。用v0和s0數據按標準倒數法繪圖得出KM和kcat值。I.BPN』變異體舉例本發明的對表面結合的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力的枯草溶菌素BPN』變異體示例於如下的表2-25。在描述特定突變時，野生型的原始胺基酸列在第一，位點號列在第二，取代胺基酸在第三。
表2第一環狀區——單突變變異體Gln59AsnGln59AspGln59GluGln59SerAsp60GluAsn61AspAsn61GlnAsn61GluAsn61SerAsn62AspAsn62GlnAsn62GluAsn62SerSer63AspSer63GluGly65AsnGly65AspGly65GlnGly65GluGly65ProGly65SerThr66AsnThr66AspThr66GlnThr66GluThr66GlyThr66ProThr66Ser
表3第一環狀區——雙突變變異體Gln59Ser + Asn62GluAsp60Glu + Asn61SerAsn61Glu + Asn62SerGln59Ser + Gly65GlnAsn61Gln + Gly65AsnAsn61Ser + Asn62AspGln59Glu + Asn61GlnAsp60Glu + Gly65GlnGln59Asp + Gly65ProAsn61Asp + Gly65AsnGln59Ser + Asn62AspGln59Asn + Gly65GlnAsn62Asp + Thr66GlyGln59Asn + Asn62GluAsn61Ser + Ser63GluGln59Ser + Asp60GluAsp60Glu + Thr66GlnAsn61Glu + Thr66GlyAsp60Glu + Asn62GlnAsn62Gln + Gly65ProAsn61Ser + Thr66SerAsp60Glu + Gly65ProSer63Glu + Gly65ProAsp60Glu + Thr66SerGln59Ser + Asn61GluAsn62Asp + Gly65GlnAsn61Gln + Ser63AspGln59Asp + Gly65AsnSer63Asp + Thr66ProSer63Glu + Thr66AsnAsn62Glu + Thr66AsnAsn61Asp + Gly65SerGly65Pro + Thr66SerGln59Ser + Asn62SerAsp60Glu + Gly65SerSer63Asp + Gly65SerAsn61Gln + Ser63GluAsn61Asp + Asn62SerGln59Glu + Gly65ProGln59Ser + Asn61AspGln59Asp + Asn62SerGln59Asn + Gly65SerSer63Glu + Thr66SerAsn61Ser + Ser63AspAsn62Ser + Gly65Pro
表4第一環狀區——三突變變異體Gln59Ser + Ser63Asp + Gly65ProAsn62Gln + Gly65Ser + Thr66AspGln59Ser + Asp60Glu + Thr66GlnGln59Asn + Ser63Glu + Thr66ProAsn61Ser + Gly65Asn + Thr66GluSer63Glu + Gly65Ser + Thr66AsnAsn62Asp + Gly65Ser + Thr66GlyGln59Ser + Asn62Asp + Thr66ProGln59Ser + Asp60Glu + Asn61GlnAsn61Gln + Ser63Asp + Gly65SerAsn62Glu + Gly65Asn + Thr66GlnAsp60Glu + Gly65Asn + Thr66SerAsn62Ser + Ser63Asp + Thr66GlnGln59Asp + Asn62Gln + Gly65ProAsn62Ser + Ser63Glu + Thr66GlyAsn61Asp + Asn62Ser + Gly65AsnAsp60Glu + Asn61Gln + Asn62SerAsp60Glu + Asn61Gln + Gly65SerAsp60Glu + Gly65Pro + Thr66AsnGln59Ser + Asn61Glu + Asn62AspAsn61Asp + Asn62Asp + Gly65ProAsn61Glu + Asn62Glu + Thr66GlnGln59Asp + Asp60Glu + Thr66GlnGln59Asp + Asp60Glu + Thr66ProAsn62Asp + Ser63Asp + Gly65AsnAsn62Glu + Ser63Glu + Gly65AsnAsn62Asp + Ser63Glu + Gly65GlnGln59Ser + Asn62Asp + Ser63GluAsn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerAsn61Asp + Asn62Asp + Ser63GluGln59Glu + Asp60Glu + Asn61GluAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63AspAsp60Glu + Asn61Glu + Ser63GluGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Glu表5第一環狀區——四突變變異體Gln59Ser + Asp60Glu + Gly65Gln + Thr66GlnGln59Ser + Asn62Ser + Ser63Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66GlnAsn62Gln + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66GlnAsn61Gln + Asn62Gln + Ser63Asp + Gly65ProGln59Asn + Asp60Glu + Asn61Gln + Gly65AsnGln59Glu + Asn62Ser + Gly65Pro + Thr66Ser
Gln59Asn + Asn61Asp + Asn62Asp + Thr66AsnGln59Asp + Asp60Glu + Asn62Ser + Gly65SerAsn61Gln + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66GlnAsp60Glu + Asn61Asp + Asn62Glu + Gly65SerAsn61Asp + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66SerAsn61Asp + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerGln59Glu + Asp60Glu + Asn61Asp + Gly65SerAsp60Glu + Asn62Asp + Ser63Glu + Thr66ProAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63Glu + Thr66AsnAsp60Glu + Asn62Glu + Ser63Asp + Gly65SerAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Thr66AsnGln59Ser + Asp60Glu + Asn61Asp + Ser63AspAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Gly65ProAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Asp + Thr66GlyAsp60Glu + Asn61Asp + Ser63Glu + Gly65AsnGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Thr66GlyAsp60Glu + Asn62Asp + Gly65Ser + Thr66ProAsp60Glu + Asn61Gln + Asn62Glu + Gly65SerGln59Ser + Asp60Glu + Asn62Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Asn61Ser + Asn62Gln + Ser63GluAsp60Glu + Asn61Ser + Ser63Asp + Thr66ProGln59Ser + Asp60Glu + Asn61Gln + Ser63GluAsp60Glu + Ser63Glu + Gly65Ser + Thr66AsnGln59Asn + Asp60Glu + Ser63Asp + Gly65GlnAsp60Glu + Ser63Glu + Gly65Pro + Thr66Ser表6第二環狀區——單突變變異體Val95AlaVal95AsnVal95AspVal95CysVal95GlnVal95GluVal95GlyVal95HisVal95MetVal95ProVal95SerVal95ThrLeu96AlaLeu96AsnLeu96AspLeu96CysLeu96GlnLeu96GluLeu96GlyLeu96HisLeu96Ile
Leu96MetLeu96ProLeu96SerLeu96ThrLeu96ValGly97AsnGly97AspGly97GlnGly97GluGly97ProGly97SerAla98AsnAla98AspAla98GlnAla98GluAla98GlyAla98HisAla98ProAla98SerAla98ThrAsp99GluGly100AsnGly100AspGly100GlnGly100GluGly100ProGly100SerSer101AspSer101GluGly102AsnGly102AspGly102GlnGly102GluGly102ProGly102SerGln103AsnGln103AspGln103GluGln103SerTyr104AlaTyr104AsnTyr104AspTyr104CysTyr104GlnTyr104GluTyr104GlyTyr104HisTyr104IleTyr104LeuTyr104Met
Tyr104ProTyr104SerTyr104ThrTyr104ValSer105AspSer105GluTrp106AlaTrp106AsnTrp106AspTrp106CysTrp106GlnTrp106GluTrp106GlyTrp106HisTrp106IleTrp106LeuTrp106MetTrp106PheTrp106ProTrp106SerTrp106ThrTrp106TyrTrp106ValIle107AlaIle107AsnIle107AspIle107CysIle107GlnIle107GluIle107GlyIle107HisIle107LeuIle107MetIle107ProIle107SerIle107ThrIle107Val表7第二環狀區——雙突變變異體Val 95Gln + Ser101GluGly 97Ser + Gly100GlnSer105Glu + Trp106GlyAsp 99Glu + Gln103AsnAla 98Gln + Trp106ThrGly 97Asp + Ile107ThrGly100Ser + Gly102GlnLeu 96Ser + Ser101GluAsp 99Glu + Ile107Ala
Leu 96Asn + Asp 99GluGly102Gln + Trp106AspTyr104Leu + Trp106GluTyr104Pro + Ile107AspGly 97Ser + Ser101AspGly100Pro + Ser101GluVal 95Asn + Ala 98AspVal 95Met + Ilel07GlyAsp 99Glu + Trp106CysGly100Asn + Trp106ThrGln103Ser + Trp106ProGly102Asp + Gln103SerGly102Ser + Trp106GlnSer101Asp + Gly102ProLeu 96Cys + Trp106AspAsp 99Glu + Gly102SerGly102Asp + Trp106ValGly 97Ser + Trp106PheGln103Asp + Tyr104ThrAla 98His + Gly100GlnSer105Glu + Trp106LeuLeu 96His + Tyr104ThrGly 97Pro + Ser101GluVal 95Thr + Trp106IleGly100Asp + Tyrl04IleVal 95Pro + Gln103AsnGln103Asn + Trp106IleAla 98His + Gly102ProTrp106Asn + Ile107HisVal 95Gln + Leu 96AspGly 97Asp + Ala 98GlnGly100Ser + Ser101GluVal 95Asp + Tyr104GlyTyr104Ala + Ser105AspGly100Pro + Ser105GluLeu 96Cys + Tyr104LeuVal 95Gly + Gly100SerGly102Gln + Tyr104SerAla 98Gly + Trp106PheGly100Asp + Trp106PheVal 95Glu + Ala 98GlnSer101Glu + Tyr104AsnLeu 96Val + Ser101AspGly102Glu + Gln103AsnGly102Glu + Trp106GlyAla 98Gln + Gly100AspGly100Gln + Gln103SerGly 97Glu + Tyr104LeuSer101Asp + Gly102SerAla 98His + Ser101Asp
Gly 97Asp + Gln103Asn表8第二環狀區——三突變變異體Val 95Gln + Leu 96Thr + Ser101GluAla 98His + Gln103Glu + Trp106CysAla 98Gln + Ser101Glu + Tyr104MerSer101Asp + Gln103Ser + Ile107CysAla 98Pro + Asp 99Glu + Gly102ProVal 95Pro + Gly 97Glu + Gly100GlnSer101Glu + Gly102Pro + Ile107HisLeu 96Pro + Gly100Pro + Gly102AsnGly100Glu + Gly102Asn + Trp106TyrAla 98Asn + Gln103Glu + Ile107SerGly 97Pro + Gly100Asp + Trp106MetGln103Asn + Tyr104Leu + Ser105AspGly 97Pro + Ala 98Gln + Tyr104CysAla 98Gly + Gly100Glu + Gln103SerLeu 96Ile + Gly 97Pro + Ser105AspAla 98Pro + Gly100Pro + Ile107AlaVal 95Pro + Gln103Asp + Ile107MetVal 95Gln + Ser101Glu + Trp106PheLeu 96Val + Ser101Glu + Ile107ProLeu 96Gly + Gly 97Glu + Trp106ThrGly 97Asp + Tyr104Ser + Trp106HisGly 97Ser + Gly100Pro + Tyr104CysGln103Ser + Ser105Asp + Ile107HisAla 98Glu + Tyr104Cys + Trp106PheVal 95Gln + Gly100Pro + Gly102SerVal 95Ala + Gly102Asp + Tyr104SerVal 95Ala + Leu 96Met + Ser105AspGly102Gln + Trp106Leu + Ile107GlyLeu 96Asn + Gly 97Glu + Ile107ProGly100Pro + Gly102Gln + Gln103GluGly 97Asp + Ala 98Asn + Trp106LeuAla 98Gln + Gly100Pro + Trp106HisLeu 96Thr + Gly100Asn + Ser105GluVal 95Ser + Leu 96Asn + Gly 97ProGly100Gln + Ser105Glu + Trp106GlnGly 97Glu + Tyr104Thr + Trp106ValLeu 96Ala + Ala 98Gln + Gly100GluVal 95His + Gly 97Gln + Ser101GluVal 95Pro + Gly102Asn + Gln103GluGln103Asn + Trp106Ile + Ile107AlaGly 97Ser + Ala 98Glu + Tyr104GlnVal 95Glu + Leu 96Ile + Ile107GlnLeu 96Gln + Ala 98Ser + Asp 99GluLeu 96Pro + Ser101Glu + Gly102ProGly 97Asn + Ala 98Pro + Gly100Pro
Gly 97Asn + Ala 98Glu + Gly100AsnGly102Pro + Trp106Ala + Ile107ProGly100Ser + Gly102Glu + Trp106CysLeu 96Thr + Gly102Glu + Ile107ValLeu 96Cys + Trp106Leu + Ile107ProLeu 96Thr + Ser105Glu + Trp106TyrLeu 96Ala + Gly100Asp + Ser101AspGly 97Asn + Ser101Glu + Gly102AspVal 95Gln + Ser101Asp + Gly102AspAsp 99Glu + Gly100Asp + Trp106PheTyr104Glu + Ser105Asp + Ile107AspLeu 96Glu + Ser101Glu + Trp106ValTyr104Met + Ser105Asp + Ile107AspGly 97Asp + Gly100Asp + Trp106ProVal 95Ala + Gly 97Asp + Asp 99Glu表9第二環狀區——四突變變異體Leu 96Gln + Gly 97Ser + Ser101Glu + Trp106ValVal 95Ala + Ala 98Gln + Gly100Asn + Gln103AspVal 95Gln + Tyr104Ile + Trp106Gly + Ile107ProVal 95Met + Leu 96Gly + Gly100Pro + Trp106GlyAla 98Gln + Gly100Pro + Tyr104Thr + Trp106HisGly 97Pro + Ala 98His + Gly100Pro + Ile107AspAla 98Pro + Gly100Glu + Trp106Ser + Ile107MetLeu 96Gln + Gly 97Ser + Ser105Asp + Ile107ValAla 98Gly + Ser101Asp + Trpl06Ala + Ile107GlnVal 95Ser + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Gln103SerLeu 96Thr + Gly 97Ser + Asp 99Glu + Tyr104AsnVal 95Thr + Leu 96Gln + Ala 98Pro + Ser105GluVal 95Gly + Gly 97Ser + Tyr104Asn + Trp106GluLeu 96Gln + Gly 97Ser + Tyr104Thr + Ile107GluVal 95Ser + Leu 96Pro + Gly100Gln + Ser101AspLeu 96Met + Gly100Ser + Ser101Asp + Trp106AsnLeu 96Ile + Ala 98Ser + Gly100Pro + Gly102GluVal 95Asn + Ala 98Gly + Gln103Ser + Tyr104ValGly 97Asn + Asp 99Glu + Gly102Asn + Trp106HisGly 97Ser + Gly102Asp + Gln103Asp + Ile107HisVal 95Pro + Gly100Glu + Ser101Glu + Tyr104GlyAla 98Pro + Gly100Asp + Ser101Asp + Ile107CysLeu 96Gly + Ser101Asp + Gly102Asp + Ile107GlyVal 95His + Tyr104Asp + Ser105Asp + Trp106AlaGly102Pro + Ser105Asp + Trp106Asp + Ile107ThrLeu 96Glu + Ala 98Gln + Gly102Asp + Tyr104ProAla 98Thr + Asp 99Glu + Gly100Glu + Ser101GluGly 97Ser + Ala 98Glu + Asp 99Glu + Gly100GluLeu 96Asp + Gly 97Glu + Gly100Glu + Ile107AsnLeu 96Asn + Gly100Asp + Ser101Asp + Gly102GluVal 95Gly + Ser101Glu + Gly102Asp + Gln103Asp
Val 95His + Leu 96Glu + Gly100Gln + Ser101GluLeu 96Glu + Gly100Gln + Ser101Asp + Gly102SerGly 97Asp + Gly100Asp + Gly102Pro + Ile107GlyGly 97Glu + Asp 99Glu + Gly100Pro + Tyr104SerLeu 96Ile + Gly 97Gln + Gln103Glu + Ser105GluGln103Asp + Ser105Asp + Trp106Asn + Ile107HisVal 95Pro + Ala 98Pro + Gln103Glu + Ser105AspVal 95His + Asp 99Glu + Ser101Glu + Gly102ProLeu 96Asn + Asp 99Glu + Gly100Asn + Ser101GluAla 98Asp + Asp 99Glu + Ser101Asp + Ile107ProLeu 96Thr + Gly 97Glu + Gly100Glu + Gly102AspVal 95Glu + Gly102Asp + Tyr104Ser + Ile107GluLeu 96Gly + Gly102Asp + Gln103Asp + Ser105GluGly102Glu + Gln103Glu + Ser105Glu + Trp106CysAsp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Gln103AsnAsp 99Glu + Ser101Glu + Gly102Glu + Trp106GlyGly102Glu + Gln103Asn + Tyr104Asp + Ile107ThrVal 95His + Leu 96Val + Gln103Glu + Ile107GluGly 97Ser + Gly102Ser + Gln103Glu + Ile107GluVal 95Glu + Leu 96Asp + Gln103Asp + Ile107AsnVal 95Thr + Gly102Glu + Trp106Tyr + Ile107AspVal 95Glu + Gly 97Glu + Ala 98Gly + Gly100AspLeu 96Ala + Gly 97Pro + Ala 98Asp + Ser101AspVal 95Asp + Leu 96Asp + Tyr104Glu + Ile107SerVal 95Pro + Gly102Glu + Tyr104Pro + Ser105AspLeu 96Asn + Gly102Asp + Gln103Asn + Ser105GluLeu 96Asn + Gly102Asp + Tyr104Ala + Ser105GluLeu 96Ser + Gly 97Gln + Gly102Glu + Ser105AspLeu 96Thr + Asp 99Glu + Gly102Asp + Ile107Gly表10第三環狀區——單突變變異體Leu126AlaLeu126AsnLeu126AspLeu126CysLeu126GlnLeu126GluLeu126GlyLeu126HisLeu126IleLeu126MetLeu126ProLeu126SerLeu126ThrLeu126ValGly127AsnGly127AspGly127Gln
Gly127GluGly127ProGly127SerGly128AsnGly128AspGly128GlnGly128GluGly128ProGly128SerPro129AsnPro129AspPro129GlnPro129GluPro129GlyPro129SerSerl30AspSer130GluGly131AsnGly131AspGly131GlnGly131GluGly131ProGly131SerSer132AspSer132GluAla133AsnAla133AspAla133GlnAla133GluAla133GlyAla133HisAla133ProAla133SerAla133Thr表11第三環狀區——雙突變變異體Leu126Gln + Ser130GluGly131Gln + Ala133AsnPro129Asp + Gly131GlnGly128Ser + Ser130GluLeu126Pro + Ala133GlyGly127Asp + Ala133GlyLeu126Asp + Pro129GlnGly131Asn + Ala133GlnGly127Pro + Gly131GluGly128Asn + Gly131AspPro129Gln + Ser130GluGly128Pro + Ser130Asp
Gly128Gln + Pro129SerGly128Asn + Pro129GlyLeu126Val + Ser130AspLeu126Val + Pro129SerLeu126Cys + Pro129GluGly127Asp + Ala133ThrGly128Pro + Pro129GluGly127Ser + Gly131AspLeu126His + Pro129AspGly131Pro + Ala133GluGly127Ser + Gly128SerPro129Asn + Gly131GluLeu126Val + Pro129AspPro129Gly + Ala133AspLeu126Val + Ser130GluPro129Glu + Ala133ProPro129Gly + Ser130AspLeu126His + Gly128GluGly128Asn + Ser132GluGly127Pro + Ser132AspGly127Gln + Pro129GlnGly128Pro + Pro129AspGly128Asn + Ser130GluLeu126Cys + Pro129AsnPro129Asn + Ser132GluLeu126Ser + Ser132AspGly128Glu + Gly131SerPro129Asn + Ser130AspLeu126Ser + Ser132GluPro129Gln + Gly131ProGly127Asp + Gly128GlnGly128Gln + Pro129GluGly127Pro + Pro129GlyPro129Gln + Ala133GlnLeu126Val + Gly128AspGly128Ser + Ser132GluLeu126Asn + Pro129GlyLeu126Ile + Ala133GlyGly128Ser + Gly131GlnGly127Ser + Ser130AspLeu126Cys + Ser132AspGly127Pro + Ser130GluLeu126His + Ala133AspGly131Ser + Ala133GluGly131Pro + Ala133GlnGly131Asp + Ala133SerLeu126Asp + Ala133AsnLeu126Glu + Pro129Gln
表12第三環狀區——三突變變異體Leu126His + Pro129Glu + Ala133AsnLeu126Asp + Gly128Ser + Gly131GlnPro129Asn + Gly131Ser + Ser132GluGly128Pro + Pro129Asn + Ser130GluGly128Gln + Ser130Glu + Ala133SerGly131Gln + Ser132Glu + Ala133GlnGly128Asp + Gly131Ser + Ala133AsnGly131Ser + Ser132Asp + Ala133ProPro129Ser + Glyl31Gln + Ala133GluGly128Asn + Ser130Glu + Gly131GlnLeu126Gly + Gly127Gln + Gly131ProLeu126Pro + Gly127Glu + Gly128ProLeu126Ser + Pro129Ser + Ser132AspGly128Ser + Ser132Glu + Ala133AsnLeu126Val + Ser132Glu + Ala133GlnPro129Gly + Ser130Glu + Gly131ProLeu126Thr + Gly127Pro + Ala133AsnLeu126His + Ser130Asp + Ala133ProLeu126Cys + Gly127Ser + Pro129SerLeu126Gly + Ser132Asp + Ala133SerGly128Gln + Pro129Gln + Gly131AsnGly128Asp + Gly131Asn + Ala133HisLeu126Cys + Ser130Glu + Ala133GlyGly127Ser + Ser130Asp + Ala133GlyLeu126His + Pro129Asn + Ser130AspLeu126Asn + Gly131Asp + Ala133GlnLeu126Met + Gly128Asn + Ser132AspLeu126Glu + Gly127Gln + Ala133HisLeu126Met + Ser132Asp + Ala133HisSer130Glu + Gly131Gln + Ala133GlnGly127Pro + Gly128Ser + Ala133SerLeu126Ala + Pro129Gly + Ser132GluGly131Asn + Ser132Asp + Ala133AsnLeu126Val + Gly131Asp + Ala133SerLeu126Ser + Gly127Asn + Ala133GlnPro129Gln + Ser130Glu + Ala133HisLeu126Met + Gly127Ser + Ser130AspLeu126Cys + Pro129Asn + Gly131AspPro129Ser + Ser130Asp + Ala133AsnLeu126Ser + Pro129Gly + Ser132GluGly127Ser + Pro129Gln + Ser132AspGly127Pro + Gly128Asn + Pro129GlnLeu126His + Ser132Asp + Ala133AsnGly128Pro + Pro129Glu + Ala133ThrPro129Ser + Glyl31Glu + Ala133ProLeu126His + Gly128Pro + Pro129Gln
Leu126Met + Gly127Asp + Gly128AspGly128Pro + Gly131Glu + Ser132AspGly131Asp + Ser132Glu + Ala133ProGly128Glu + Pro129Glu + Ala133AsnPro129Ser + Ser132Glu + Ala133GluLeu126Asn + Ser130Glu + Gly131AspPro129Asn + Ser130Glu + Gly131AspLeu126His + Ser130Glu + Gly131GluPro129Glu + Ser130Asp + Gly131AsnGly127Ser + Pro129Asp + Ser130AspSer130Asp + Gly131Asp + Ser132AspGly128Asp + Ser130Glu + Gly131AsnLeu126Met + Gly128Glu + Ser130AspGly128Asp + Pro129Asn + Ser130Glu表13第三環狀區——四突變變異體Leu126Ser + Pro129Asn + Ser130Asp + Ala133HisLeu126Met + Pro129Ser + Ser132Glu + Ala133AsnGly127Ser + Gly131Gln + Ser132Glu + Ala133GlnLeu126Asn + Gly127Pro + Gly128Glu + Pro129GlyLeu126Asn + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133GlyLeu126Gly + Pro129Gly + Ser132Glu + Ala133ProLeu126Gly + Gly127Asp + Pro129Gly + Gly131ProGly127Asn + Pro129Gln + Gly131Asp + Ala133GlyLeu126Pro + Gly127Ser + Gly128Gln + Ser130GluLeu126Ala + Gly127Gln + Pro129Asn + Ser130GluLeu126Asn + Gly127Ser + Ser130Glu + Ala133ThrGly128Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131SerLeu126His + Gly128Ser + Gly131Ser + Ser132AspLeu126Gln + Pro129Ser + Ser130Asp + Ala133HisLeu126Val + Gly128Pro + Pro129Asn + Ala133AspLeu126Val + Pro129Gly + Ser130Glu + Ala133ThrLeu126Thr + Gly127Pro + Ser132Glu + Ala133ThrGly128Asp + Pro129Gly + Gly131Pro + Ala133SerLeu126Asn + Gly128Glu + Pro129Gln + Gly131ProLeu126Pro + Gly127Pro + Pro129Ser + Ser130AspGly127Pro + Gly128Gln + Gly131Glu + Ser132GluLeu126Ile + Gly127Gln + Gly131Asp + Ser132GluLeu126Val + Gly131Asp + Ser132Asp + Ala133ProGly128Asp + Pro129Asp + Gly131Asn + Ala133ProPro129Asn + Gly131Ser + Ser132Asp + Ala133AspLeu126Gln + Gly131Pro + Ser132Asp + Ala133AspGly127Pro + Ser130Glu + Gly131Glu + Ala133HisLeu126Gln + Pro129Gln + Ser130Asp + Gly131GluGly127Ser + Ser130Asp + Gly131Glu + Ala133GlnLeu126Ser + Gly127Pro + Pro129Glu + Ser130GluSer130Glu + Gly131Glu + Ser132Glu + Ala133SerGly127Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132Asp
Gly128Gln + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132AspGly127Asn + Ser130Glu + Gly131Asp + Ser132AspGly127Ser + Pro129Asp + Ser130Glu + Gly131GluGly127Asn + Pro129Asp + Ser130Asp + Gly131AspGly128Asn + Pro129Glu + Ser130Glu + Gly131AspLeu126Ser + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133ProGly127Asn + Gly128Asp + Ser130Glu + Ala133ProGly128Glu + Ser130Glu + Gly131Pro + Ala133HisLeu126Val + Ser130Asp + Ser132Asp + Ala133AsnPro129Ser + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133GlyLeu126His + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133HisLeu126Ala + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133AsnGly127Pro + Gly128Gln + Ser130Asp + Ser132GluLeu126Ser + Ser130Asp + Gly131Pro + Ser132AspSer130Glu + Gly131Pro + Ser132Glu + Ala133SerGly128Gln + Ser130Asp + Gly131Ser + Ser132GluLeu126Ala + Pro129Asn + Ser130Asp + Ser132GluGly127Gln + Gly128Pro + Pro129Glu + Gly131AspGly128Gln + Pro129Asp + Gly131Glu + Ala133AsnLeu126Asn + Pro129Glu + Gly131Asp + Ala133SerLeu126Met + Pro129Glu + Gly131Glu + Ala133ThrGly127Asp + Gly128Gln + Pro129Asp + Ala133GlnLeu126His + Pro129Gly + Gly131Glu + Ala133GluGly128Glu + Pro129Gly + Gly131Asp + Ala133AsnPro129Gly + Ser130Glu + Ser132Asp + Ala133GluLeu126Gln + Ser130Glu + Ser132Glu + Ala133GluLeu126Gly + Pro129Asp + Ser130Glu + Ser132GluPro129Asp + Ser130Glu + Gly131Ser + Ser132Asp表14第四環狀區——單突變變異體Gly154AsnGly154AspGly154GlnGly154GluGly154ProGly154SerAsn155AspAsn155GlnAsn155GluAsn155SerGlu156AspGly157AsnGly157AspGly157GlnGly157GluGly157ProGly157SerThr158Asn
Thr158AspThr158GlnThr158GluThr158GlyThr158ProThr158SerSer159AspSer159GluGly160AsnGly160AspGly160GlnGly160GluGly160ProGly160SerSer161AspSer161GluSer162AspSer162GluSer163AspSer163GluThr164AsnThr164AspThr164GlnThr164GluThr164GlyThr164ProThr164SerVal165AlaVal165AsnVal165AspVal165CysVal165GlnVal165GluVal165GlyVal165HisVal165MetVal165ProVal165SerVal165ThrGly166AsnG1y166AspGly166GlnGly166GluGly166ProGly166SerTyr167AlaTyr167AsnTyr167AspTyr167CysTyr167Gln
Tyr167GluTyr167GlyTyr167HisTyr167IleTyr167LeuTyr167MetTyr167ProTyr167SerTyr167ThrTyr167Val表15第四環狀區——雙突變變異體Asn155Ser + Glu156AspGly154Ser + Tyr167GlnGly154Glu + Va1165AlaAsn155Glu + Thr164ProGly157Pro + Ser159AspGly154Ser + Ser161AspSer161Glu + Val165ProGly154Gln + Ser161GluAsn155Asp + Thr158ProThr164Asn + Gly166GlnAsn155Glu + Tyr167HisGlu156Asp + Thr158GlyGly154Pro + Gly157GluAsn155Ser + Tyr167AspThr158Pro + Gly166AspThr164Gln + Tyr167GluGly157Gln + Thr158GluThr158Asn + Ser162AspGly154Asn + Tyr167GluGly157Gln + Ser161AspThr164Asp + Tyr167AlaGly160Asp + Val165HisGly154Glu + Gly157SerGlu156Asp + Tyr167IleAsn155Ser + Thr158AspGly157Gln + Thr164ProThr164Ser + Tyr167IleSer159Glu + Tyr167ThrThr164Glu + Val165GlnThr158Gly + Gly160SerSer161Asp + Gly166ProGly154Glu + Gly166SerGly160Asp + Val165AsnSer162Glu + Val165GlnGly157Asn + Ser159GluSer161Asp + Val165Asn
Asn155Asp + Val165ProGlu156Asp + Gly166SerGly154Pro + Ser159AspGly154Ser + Tyr167CysGly160Pro + Thr164AspSer161Glu + Val165GlySer162Glu + Tyr167AsnGly154Asn + Gly166GluSer161Glu + Tyr167AlaGly160Gln + Val165ProGly154Glu + Val165GlyGly160Ser + Ser163AspGly157Glu + Thr158AsnGly160Asp + Val165ProGlyl60Asn + Ser162AspThr164Gln + Gly166GlnAsn155Ser + Thr158GlnSer161Glu + Tyr167GlySer162Asp + Gly166SerGly154Glu + Thr158GlyGly1545er + Thr158SerGly157Asp + Gly160ProSer163Glu + Val165HisGly154Pro + Gly166Asp表16第四環狀區——三突變變異體Gly154Gln + Asn155Ser + Glu156AspGly154Ser + Gly160Asp + Tyr167GlnAsn155Glu + Gly157Ser + Thr164ProGly157Asn + Ser159Asp + Gly160SerGlu156Asp + Gly160Ser + Val165ThrGly160Pro + Ser162Glu + Thr164AsnGly154Ser + Glu156Asp + Thr158GlnGly160Asn + Ser162Glu + Gly166SerGly160Ser + Val165Gly + Gly166GlnThr158Gln + Ser162Asp + Tyr167ValGly157Gln + Ser162Glu + Tyr167LeuSer162Glu + Thr164Gln + Val165CysGly157Ser + Val165Met + Gly166GluGly154Ser + Glu156Asp + Gly166ProThr158Ser + Ser161Asp + Thr164GlyGlu156Asp + Gly157Ser + Gly160AsnGly154Gln + Asn155Asp + Gly166SerSer163Glu + Val165Thr + Tyr167ProGly157Asp + Thr158Gln + Val165SerGly157Asn + Ser159Asp + Gly166SerGly160Gln + Ser163Glu + Val165MetGly154Asn + Asn155Asp + Gly157Pro
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Glu156Asp + Thr158Pro + Thr164Gln + Val165ProAsn155Gln + Glu156Asp + Thr164Gly + Val165ThrThr158Gly + Gly160Ser + Ser163Asp + Tyr167AsnSer159Asp + Gly160Gln + Gly166Ser + Tyr167ProGly154Pro + Thr164Gln + Val165Gly + Gly166AspGly154Asn + Gly160Pro + Ser161Glu + Gly166ProAsn155Ser + Gly157Asn + Thr164Gln + Tyr167AspGly157Asn + Thr158Asn + Ser163Glu + Val165GlnGly160Glu + Ser161Asp + Val165Met + Tyr167ProAsn155Glu + Glu156Asp + Thr158Gln + Gly166ProAsn155Asp + Glu156Asp + Val165Asn + Gly166AsnAsn155Asp + Glu156Asp + Gly160Ser + Thr164AsnGly154Ser + Thr158Gln + Ser162Glu + Ser163GluGly154Asn + Asn155Gln + Ser163Glu + Thr164GluGlu156Asp + Gly157Glu + Gly160Gln + Thr164GlyGlu156Asp + Gly157Glu + Thr1585er + Val165CysGly154Pro + Gly157Pro + Thr158Asp + Ser159AspGly154Ser + Gly157Asn + Thr158Glu + Ser159GluGly157Pro + Gly160Pro + Gly166Asp + Tyr167GluGly154Asn + Ser161Glu + Ser162Glu + Tyr167AsnGly154Asp + Asn155Asp + Thr164Gln + Gly166AsnGly154Gln + Ser159Glu + Gly160Glu + Ser161AspThr158Ser + Ser159Asp + Gly160Asp + Ser161AspAsn155Ser + Glu156Asp + Gly157Asp + Thr158GluGly157Asn + Ser159Asp + Ser161Glu + Ser162GluGly154Asn + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr164GluGly157Gln + Gly160Asp + Ser162Asp + Val165ThrGly160Glu + Ser162Asp + Thr164Asn + Gly166GlnGly154Asp + Asn155Ser + Glu156Asp + Thr164SerGly154Asp + Glu156Asp + Gly157Glu + Thr158GlyGly154Gln + Gly157Pro + Ser159Asp + Ser161AspSer159Glu + Ser161Asp + Gly166Ser + Tyr167HisSer159Asp + Ser161Asp + Gly166Pro + Tyr167SerGlu156Asp + Thr158Glu + Val165Ala + Gly166GlnGlu156Asp + Thr158Asp + Gly166Pro + Tyr167AlaAsn155Gln + Thr158Asp + Thr164Asp + Tyr167ValSer163Glu + Thr164Asp + Val165Met + Gly166GluSer161Asp + Ser163Asp + Val165Thr + Tyr167HisSer161Asp + Ser163Glu + Thr164Gln + Gly166AsnGly157Pro + Ser159Glu + Ser161Asp + Ser163GluGly154Pro + Glu156Asp + Ser163Asp + Thr164GluAsn155Asp + Glu156Asp + Thr158Asp + Thr164AsnGlu156Asp + Ser159Asp + Thr164Asp + Val165AlaThr158Gln + Ser159Asp + Ser163Glu + Va1165CysGly154Gln + Ser159Asp + Ser163Asp + Gly166ProAsn155Ser + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164AspGly154Gln + Gly160Asp + Ser162Glu + Thr164GluGlu156Asp + Gly160Pro + Va1165Pro + Gly166GluGly160Glu + Ser163Asp + Thr164Gly + Tyr167LeuGly160Glu + Ser163Glu + Thr164Pro + Gly166Gln
Asn155Asp + Thr158Pro + Ser163Glu + Thr164AspAsn155Ser + Glu156Asp + Ser163Asp + Gly166Glu表18第五環狀區——單突變變異體Ala187AsnAla187AspAla187GlnAla187GluAla187GlyAla187HisAla187ProAla187SerAla187ThrSer188AspSer188GluPhe189AlaPhe189AsnPhe189AspPhe189CysPhe189GlnPhe189GluPhe189GlyPhe189HisPhe189IlePhe189LeuPhe189MetPhe189ProPhe189SerPhe189ThrPhe189TyrPhe189ValSer190AspSer190GluSer191AspSer191Glu表19第五環狀區——雙突變變異體Ala187Asp + Pne189GlnAla187Ser + Ser188AspSer188Glu + Phe189ProAla187Asp + Phe189HisAla187Asn + Ser191GluAla187Gln + Ser191AspAla187Glu + Phe189ProAla187Pro + Phe189Asp
Ser188Asp + Phe189CysPhe189His + Ser191AspSer188Glu + Phe189AlaAla187His + Ser188AspAla187Asn + Ser188GluSer188Glu + Phe189GlnAla187Asp + Phe189SerSer188Asp + Phe189ValAla187Gln + Ser188GluAla187Ser + Ser188GluAla187Pro + Ser191AspSer188Glu + Phe189ValPhe189Ser + Ser191GluAla187Gly + Ser191GluAla187Asn + Ser191AspAla187Thr + Ser191AspAla187His + Ser188GluSer188Glu + Phe189GlyAla187Ser + Phe189IleSer188Glu + Phe189MetPhe189Asn + Ser191AspAla187Gln + Phe189TyrAla187Gln + Ser191GluAla187Ser + Phe189AlaPhe189Val + Ser191AspSer188Glu + Phe189LeuAla187Pro + Ser188GluPhe189Asn + Ser191GluPhe189Ile + Ser191AspAla187Glu + Phe189MetAla187His + Ser191GluSer188Asp + Phe189TyrAla187Gly + Phe189ValSer188Asp + Phe189GlnAla187Gly + Phe189TyrAla187Gln + Phe189AspPhe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser191AspAla187Thr + Ser188GluAla187Asn + Ser188AspAla187Gly + Ser188AspAla187Gly + Phe189CysPhe189Cys + Ser191GluAla187Asp + Phe189GlySer188Asp + Phe189LeuSer188Asp + Phe189GlyAla187Asn + Phe189AspAla187Pro + Ser191GluPhe189Met + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp
Phe189Ala + Ser191GluPhe189Leu + Ser191Glu表20第五環狀區——三突變變異體Ala187Pro + Phe189Cys + Ser191GluAla187Thr + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189SerAla187Gln + Phe189Asn + Ser191GluAla187Gln + Ser188Asp + Phe189HisAla187Gln + Ser188Glu + Phe189HisAla187Gly + Ser188Asp + Phe189MetAla187Gly + Ser188Asp + Phe189CysAla187Pro + Phe189His + Ser191GluAla187Pro + Phe189Gln + Ser191GluAla187Asn + Ser188Asp + Phe189AsnAla187Gly + Ser188Glu + Phe189SerAla187Gln + Phe189Met + Ser191AspAla187Gly + Ser188Asp + Phe189ProAla187Thr + Phe189His + Ser191AspAla187Asn + Ser188Glu + Phe189CysAla187Gln + Phe189Val + Ser191GluAla187Pro + Phe189Met + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189HisAla187Ser + Phe189Gln + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189ProAla187Gly + Ser188Asp + Phe189GlyAla187His + Phe189Gln + Ser191GluAla187Thr + Ser188Glu + Phe189IleAla187Pro + Phe189Gly + Ser191GluAla187Thr + Phe189Met + Ser191GluAla187Gly + Phe189Thr + Ser191GluAla187Gln + Phe189Leu + Ser191GluAla187Thr + Phe189Thr + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189MetAla187Pro + Phe189Ser + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189ValAla187Glu + Ser188Glu + Phe189SerAla187Asp + Ser188Glu + Phe189MetAla187Asp + Ser188Asp + Phe189GlnAla187Asp + Ser188Glu + Phe189CysAla187Asp + Ser188Glu + Phe189TyrAla187Glu + Ser188Glu + Phe189TyrAla187Asp + Ser188Asp + Phe189GlyAla187Glu + Ser188Glu + Phe189LeuAla187Asp + Ser188Glu + Phe189SerAla187Glu + Ser188Asp + Phe189GlyAla187Asp + Ser188Asp + Phe189ProAla187Asp + Ser188Glu + Phe189HisAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Thr
Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189IleAla187Glu + Ser188Asp + Phe189AsnAla187Ser + Ser188Glu + Phe189GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189GluAla187Gly + Ser188Glu + Phe189AspAla187Pro + Ser188Glu + Phe189AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189GluAla187Glu + Ser188Asp + Phe189AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189GluAla187Gly + Phe189Glu + Ser191AspAla187Gly + Phe189Glu + Ser191GluAla187Thr + Phe189Glu + Ser191GluSer188Glu + Phe189Glu + Ser191GluSer188Glu + Phe189Glu + Ser191Asp表21第五環狀區——四突變變異體Ala187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191AspAla187Pro + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191GluAla187His + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser19lGluAla187His + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191GluAla187Asn + Ser188Glu + Phe189Glu + Ser191GluAla187Pro + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Pro + Ser188Asp + Phe189Asp + Ser191AspAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187His + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191AspAla187Thr + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191AspAla187Asn + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Gln + Ser188Glu + Phe189Asp + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Glu + Ser191GluAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Gly + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Leu + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Gln + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Pro + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Ser + Serl91GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Leu + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189His + Ser191Glu
Ala187Glu + Ser188Asp + Phe189His + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191AspAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191AspAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Asn + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Thr + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ile + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ala + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191GluAla187Glu + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191GluAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191AspAla187Asp + Ser188Asp + Phe189Cys + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Cys + Ser191AspAla187Glu + Ser188Asp + Phe189Ser + Serl9lGluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Asp + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191AspAla187Gly + Ser188Glu + Phe189Thr + Ser191AspAla187His + Ser188Asp + Phe189Met + Ser191GluAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Met + Ser191AspAla187Ser + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191AspAla187Thr + Ser188Asp + Phe189Tyr + Ser191GluAla187Ser + Ser188Glu + Phe189Ala + Ser191AspAla187Asn + Ser188Glu + Phe189Gly + Ser191AspAla187Gln + Ser188Asp + Phe189Asn + Ser191GluAla187Asn + Ser188Asp + Phe189His + Ser191GluAla187Gly + Ser188Asp + Phe189Ser + Ser191GluAla187His + Ser188Asp + Phe189Val + Ser191Asp表22多環雙突變變異體Leu 96Gly + Ser204GluGln 59Ser + Asn 62SerVal 95Gln + Asn218AspTyr104Cys + Lys213GluGly127Gln + Ala216ProSer188Glu + Gly215AsnGly 97Gln + Ile107AlaGln206Asp + Tyr217ThrAsp 60Glu + Gln206AsnThr158Asp + Gln206SerPro210Gln + Gly21SAsnTyr104Glu + Ile107LeuTyr167Pro + Gly211GluIle107Leu + Ala187AspGly 97Glu + Thr164ProThr 66Pro + Val203CysAla133Gly + Tyr217Ser
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Ala133Asp + Ser161Glu + Thr164Asp + Ser204Asp + Asn218SerGln103Glu + Tyr104Cys + Ser161Glu + Thr164Asp + Lys213GluSer 63Glu + Gly160Asp + Tyr167Met + Lys213Asp + Asn218AspSer101Glu + Leu126Glu + Ser188Glu + Lys213Asp + Ala216AsnAsp 60Glu + Leu 96Glu + Gly128Asn + Ser130Glu + Gln206GluGln103Ser + Ser130Asp + Ala133Gly + Gln206Glu + Gly219AspGly102Asn + Ser162Asp + Gln206Asp + Tyr217Gly + Gly219AspThr 66Gln + Asp 99Glu + Gln103Glu + Val203Ser + Tyr217AspAsp 99Glu + Gln103Asp + Gly157Asn + Lys213Asp + Ala216GlnThr 66Asp + Pro129Asp + Ser159Glu + Lys213Asp + Tyr217HisSer 63Asp + Gly 97Asp + Tyr167Ala + Ser188Asp + Ser204GluGly102Pro + Tyr104Ala + Glu156Asp + Tyr167Glu + Ser204GluGln 59Glu + Asn 62Gln + Glnl03Glu + Gly131Glu + Phe189LeuAsp 60Glu + Ser162Glu + Ala200Gln + Val203Glu + Gly211AspAsp 60Glu + Ile107Glu + Gly157Asp + Gly160Glu + Phe189SerSerl01Asp + Gly102Ser + Tyrl04Glu + Phe189Asp + Lys213GluSer101Asp + Serl05Asp + Val203Asp + Ala216His + Tyr217HisSer132Asp + Asn155Glu + Gly211Pro + Lys213Glu + Asn218AspGln103Asp + Gly128Asp + Ser163Asp + Ala187Glu + Tyr217IleLeu 96Ile + Gly128Asp + Ser191Glu + Gly202Asn + Gln206GluThr 66Glu + Gln103Asp + Ser204Glu + Lys213Asp + Gly219SerAla 98Asp + Ser132Asp + Gly166Glu + Pro210Asp + Tyr214GlnSer 63Glu + Pro129Glu + Val203Met + Lys213Glu + Gly219AspGln 59Glu + Gly 97Asp + Gly128Asp + Ser159Glu + Ala216SerSer 63Glu + Gln103Glu + Ile107Ser + Glu156Asp + Lys213AspGly102Asp + Gly157Asn + Ser162Glu + Ser191Glu + Ser204GluSer105Asp + Ser162Asp + Ser191Asp + Pro210Gly + Gly211GluAsp 60Glu + Val 95Glu + Trp106Gly + Pro129Glu + Ser159AspSer101Glu + Trp106Asp + Thr164Glu + Ser204Asp + Pro210SerGln 59Glu + Gly100Gln + Gly157Asp + Gly211Asp + Tyr217GluGly 97Asp + Ser130Asp + Gln206Asp + Lys213Asp + Ala216AsnTyr104Asp + Gly154Asp + Gly160Asn + Ser163Asp + Ser204GluSer132Glu + Gly154Glu + Ser163Glu + Pro210Gly + Asn212AspLeu 96Thr + Ala133Glu + Asn155Glu + Lys213Asp + Ala216AspAsp 60Glu + Asp 99Glu + Leu126Gly + Ser130Asp + Ser162GluII.清潔組合物在本發明的另一個實施方案中，有效量的一種或多種酶變異體被包含於用於清潔各種表面，去除蛋白質類的汙物的組合物中。這樣的清潔組合物包括用於清潔硬表面的清潔劑組合物，不限形式(例如液體或顆粒)；用於清潔織物的清潔劑組合物，不限形式(例如顆粒、液體和條狀固體配方)；洗滌碗碟組合物(不限形式)；口腔清潔組合物，不限形式(例如牙粉、牙膏和口腔洗滌劑配方)；假牙清潔組合物，不限形式(例如液體、片劑)；和接觸透鏡(contact lens)清潔組合物，不限形式(例如液體、片劑)。
除了前述的BPN』變異體，清潔組合物還包括一種或多種與蛋白酶相容的清潔組合物材料。此處使用的名詞「清潔組合物材料」意思是為所需要的特定類型的清潔組合物而選擇的任何液體、固體或氣體材料，以及產品的形式(例如液體、顆粒、條狀固體、噴劑、棒狀固體、糊劑、乳膠劑)，該材料還還與組合物中使用的BPN』變異體相容。清潔組合物材料的特定選擇是在考慮了將被清潔的表面材料，以及為使用過程中清潔狀況而選定的組合物形式(例如，通過清潔劑使用)。此處使用的名詞「相容」意思是清潔組合物材料沒有在如下程度上降低BPN』變異體的蛋白水解活性，即蛋白酶不象在正常的使用情況下使用時那麼有效。下面將舉例說明特定的清潔組合物材料。
此處所使用的名詞「有效量的酶變異體」指在特定的清潔組合物中達到必要的酶活性的必要的酶變異體的數量。該有效量可以被本領域中一種普通的方法很容易地測定，有效量基於許多因素，例如所使用的特殊的酶變異體，清潔應用，特定的清潔組合物，以及是否需要液體或幹組合物(例如顆粒、條狀固體)，以及類似的因素。優選的清潔組合物包含大約0.0001％至大約10％的一種或多種本發明的酶變異體，更優選的是從大約0.001％至大約1％，還要優選的是從大約0.01％至大約0.1％。下面是進一步詳細討論各種清潔組合物的幾個實例，其中可能用到酶變異體。對於所有的部分，除非特別說明，此處使用的百分比和比例都是重量比。
此處所使用的名詞「非織物清潔組合物」包括硬表面清潔組合物、碗碟洗滌組合物、口腔清潔組合物、假牙清潔組合物以及接觸透鏡清潔組合物。A.用於硬表面、碗碟和織物的清潔組合物本發明的酶變異體可以被用於多種多樣的，需要有高泡並清除溶解性良好的底物的清潔劑組合物。於是酶變異體可以與許多常規成分一起使用，來提供全配方的硬表面清潔劑、碗碟洗滌組合物、織物清潔組合物以及其它類似的清潔劑。這樣的組合物可以以液體、顆粒、條狀固體以及其它類似的形式存在。這樣的組合物可以被描述為現代的「濃縮」清潔劑，它包含有重量百分比為30％-60％的表面活性劑。
此處的清潔組合物可以有選擇地、優選地包含各種陰離子、非離子、兩性離子等表面活性劑。這樣的表面活性劑的含量水平通常是組合物的5％至35％。
此處有用的表面活性劑的非限定性的實施例包括常規的C11-C18烷基苯磺酸鹽和伯烷基的以及無規烷基硫酸鹽、分子式為CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3的C10-C18仲(2，3)烷基硫酸鹽，其中的x和(y+1)是不小於大約7的整數，最好不小於9，並且M是水溶陽離子，尤其是鈉，C10-C18烷基烷氧基硫酸鹽(尤其是EO 1-5乙氧基硫酸鹽)，C10-C18烷基烷氧基羧酸鹽(尤其是EO 1-5乙氧基羧酸鹽)、C10-C18烷基多聚糖苷以及它們相應的多聚糖苷硫酸鹽，C12-C18α磺化脂肪酸酯，C12-C18烷基和烷基酚烷氧基化物(尤其是乙氧基化物和混合的乙氧基/丙氧基)，C12-C18甜菜鹼和硫代甜菜鹼(「sultaines」)，C10-C18胺氧化物等。烷基烷氧基硫酸鹽(AES)和烷基烷氧基羧酸鹽(AEC)在此處是優選的。(與上文提及的胺氧化物和/或甜菜鹼或硫代甜菜鹼這樣的表面活性劑結合使用也是優選的，這依賴於配製者的需要。)其它常規的有用的表面活性劑被列於標準文本中。特別有用的表面活性劑包括C10-C18N-甲基葡萄糖醯胺，它公開於美國專利第5,194,639號，Connor等，頒布於1993年3月16日，此處作為文獻引用。
清潔劑清潔組合物中有多種多樣的其它的有用成分可以包含於此處的組合物中，包括其它的活性成分、載體、水溶助長劑、加工助劑、染料或色素、液體製劑的溶劑等。如果想要更多的發泡量，泡沫增強劑例如C10-C16鏈烷醯胺(alkolamides)可以加入該組合物中，通常是約1％至約10％的水平。C10-C14單乙醇和二乙醇醯胺代表這類包沫增強劑的一個典型類別。將這樣的泡沫增強劑與高泡添加劑表面活性劑，例如上文提及的胺氧化物、甜菜鹼和硫代甜菜鹼一起使用也是有益的。如果需要，可以加入可溶性鎂鹽，如MgCl2、MgSO4等，通常從約0.1％至約2％的水平，以提供更多的泡沫。
此處的液體清潔劑組合物可以包含水和其它的溶劑作為載體。低分子量的伯或仲醇，例如甲醇、乙醇、丙醇和異丙醇是適合的。一元醇是加溶表面活性劑的優選物，但是多元醇例如那些含有約2至6個碳原子的和約2至6個羥基團的(例如，1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)醇類也可以使用。組合物中可能包含約5％至90％這樣的載體，典型的是約10％至50％。
這裡的清潔劑組合物優選地被配製為是在水溶液洗滌操作過程中使用時，洗滌水的pH值將是從約6.8至約11.0。終產品典型地被配製在此範圍之內。在推薦的使用水平控制pH值的技術包括使用緩衝液、鹼、酸等，並且是本領域的專業人員所熟知的。
當配製本發明的硬表面清潔組合物和織物清潔組合物時，配製者可能希望在約5％至50％重量比水平的使用各種助洗劑。典型的助洗劑包括1-10微米的沸石、多聚羧化物，例如檸檬酸鹽和羥基丁二酸氫鹽、層積矽酸鹽、磷酸鹽等。其它的常規的助洗劑列於標準配方表中。
同樣地，配方師可能希望在這樣的組合物中使用各種常規的添加酶，例如纖維素酶、脂肪酶、澱粉酶和蛋白酶，典型的含量水平是重量比從約0.001％至約1％。各種清潔劑和織物清潔酶是洗衣清潔劑領域所熟知的。
各種漂白物質可以被用於該組合物，例如過碳酸鹽、過硼酸鹽等，典型的含量水平是重量比從約1％至約15％。如果需要，這樣的組合物還可以包含漂白激活劑，例如四乙醯乙二胺、壬醯苯酚磺酸鹽等，它們也是本領域熟知的。使用量的典型範圍是重量比從約1％至10％。
各種汙物清除劑，尤其是陰離子寡酯類，各種螯合劑，尤其是氨基磷酸鹽和乙二胺二琥珀酸鹽、各種粘土汙物清除劑，尤其是乙氧基化的四乙基戊胺，各種分散劑，尤其是聚丙烯酸酯和聚天門冬氨酸酯，各種增白劑，尤其是陰離子增白劑，各種消泡劑，尤其是矽氧化和仲醇，各種織物柔順劑，尤其是綠土，以及類似物都可以被用於該組合物，含量水平範圍從重量比約1％至約35％。標準的配方表和公開的專利包含這些常規物質的多種、詳盡的描述。
酶穩定劑也可以被用於該清潔組合物。這樣的酶穩定劑包括丙二醇(優選的是從約1％至約10％)、甲酸鈉(優選的是從約0.1％至約1％)和甲酸鈣(優選的是從約0.1％至約1％)。1.硬表面清潔組合物這裡所使用的「硬表面清潔組合物」是指用於清潔例如地板、牆壁、衛生間瓷磚等硬表面的液體的和顆粒的清潔劑組合物。本發明的硬表面清潔劑組合物包括有效量的一種或多種本發明的酶變異體，優選的活性酶在該組合物中的含量是重量比從約0.001％至約10％，更優選的是從約0.01％至約5％，還要優選的是從約0.05％至約1％。除包含一種或多種酶變異體之外，這樣的硬表面清潔組合物通常包括表面活性劑和水溶性螯合助洗劑。但是在一些特殊的產品中，例如窗戶噴灑清潔劑，有時並不使用表面活性劑，因為它們可能在玻璃表面產生薄膜狀的/斑點狀的殘跡。
當含有表面活性成分時，它的含量可能只有該組合物的0.1％，但是典型的組合物中含有從約0.25％至約10％的表面活性劑，優選的是從約1％至約5％。
典型的組合物包含從約0.5％至約50％的清潔助洗劑，優選的是從約1％至約10％。
優選的pH值是在8至12的範圍內。如果需要調節，可以使用常規的pH值調節劑，例如氫氧化鈉、碳酸鈉或鹽酸。
組合物中可能包含溶劑。有用的溶劑包括但不限於乙二醇醚，例如二甘醇單己基醚、二甘醇單丁基醚、乙二醇單丁基醚、丙二醇單丁基醚、二丙基乙二醇單丁基醚，和二醇例如2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。當使用時，這樣的溶劑的典型含量從約0.5％至約15％，優選的是從約3％至約11％。
另外，在表面上「全濃度」使用該組合物之後若沒有清洗表面，可以在本發明的組合物中使用例如異丙醇或乙醇的高揮發溶劑，使得組合物從表面的蒸發得更快、更容易。當使用時，揮發溶劑在組合物中的典型含量水平從約2％至約12％。
本發明的硬表面清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例7-12液體硬表面清潔組合物實施例編號成分7 8 9 10 11 12Ser105Glu0.050.500.020.030.100.03Gly127Gln+-- - - 0.200.02Ala216ProNa2DIDA*EDTA**-- 2.902.90 - -檸檬酸鈉 -- - - 2.902.90十二烷基苯磺酸鈉 1.95 - 1.95 - 1.95 -十二烷基硫酸鈉- 2.20 - 2.20 - 2.20十二烷基(乙氧基)硫- 2.20 - 2.20 - 2.20酸鈉十二烷基二甲胺氧 - 0.05 - 0.05 - 0.05化物異丙基苯磺酸鈉 1.30 - 1.30 - 1.30 -己基卡必醇***6.306.306.306.306.306.30水****補充至100％*N-二甘醇-N，N-亞氨基二乙酸二鈉**乙二胺二乙酸鈉***二甘醇單己基醚****所有配劑調至pH7在實施例7-10中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被絲氨酸105穀氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例11-12中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被甘氨酸127穀氨醯胺+丙氨酸216脯氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例13-18用於清潔硬表面和家居除黴的噴灑組合物實施例編號成分131415161718Tyr104Ile+Gly215Pro0.50 0.05 0.60 0.30 0.20 0.30Asp99Glu - - - - 0.30 0.10辛基硫酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00十二烷基硫酸鈉 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00氫氧化鈉 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80矽酸(鈉)鹽 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04香味劑 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35水 補充至100％產物pH調至7。
在實施例17-18中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被酪氨酸104異亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，結果大體上相同。在實施例17-18中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被酪氨酸104異亮氨酸+甘氨酸215脯氨酸所取代，結果大體上相同。2.碗碟洗滌組合物在本發明的另一個實施方案中，碗碟洗滌組合物中包含本發明的一種或多種酶變異體。這裡所使用的「碗碟洗滌組合物」是指用於洗滌碗碟的組合物的所有形式，包括但不限於顆粒和液體形式。本發明的碗碟洗滌組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例19-24
碗碟清潔組合物實施例編號成分 192021222324Glu59Ser+Leu96Gly+S 0.05 0.50 0.02 0.40 0.10 0.03er204GluLys96Gly+Ser204Glu- - - - 0.40 0.0212-14烷基-N-甲基-葡 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90萄糖醯胺十二烷基乙氧基(1)12.00 12.00 12.00 12.00 12.00 12.00硫酸鹽2-甲基十-烷酸 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50十二烷基乙氧基(2)羧 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50酸鹽十二烷醇乙氧酸鹽(4) 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00十二烷基胺氧化物 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00異丙基苯碳酸鈉 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00乙醇 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00Mg++(如氯化鎂)0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20Ca++(如氯化鈣)0.40 0.40 0.40 0.40 0.40 0.40水補充至100％產物pH調至7。
在實施例19-22中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被穀氨醯胺59S絲氨酸+亮氨酸96甘氨酸+絲氨酸204穀氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例23-24中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被穀氨醯胺59S絲氨酸+亮氨酸96甘氨酸+絲氨酸204穀氨酸和賴氨酸96甘氨酸+絲氨酸204穀氨酸所取代，結果大體上相同。3.織物清潔組合物在本發明的另一個實施方案中，織物清潔組合物包含一種或多種本發明的酶變異體。這裡所使用的「織物清潔組合物」是指用於清洗織物的清潔劑組合物的所有形式，包括但不限於顆粒、液體和條狀形式。優選的織物清潔組合物是液體形式的。a.顆粒狀織物清潔組合物本發明的顆粒狀的織物清潔組合物包含有效量的一種或多種本發明的酶變異體，優選的活性酶在該組合物中的含量是重量比從約0.001％至約10％，更優選的是從約0.005％至約5％，還要優選的是從約0.01％至約1％。除包含一種或多種酶變異體之外，該顆粒狀的織物清潔組合物通常包括至少一種表面活性劑、一種或多種助洗劑，並且在某些情況下，包含漂白劑。
本發明的顆粒狀的織物清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例25-28顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 25 26 27 28Ser101Asp 0.10 0.20 0.03 0.05Thr66Glu - - 0.02 0.05十三鏈烷基苯磺酸 22.00 22.0022.0022.00磷酸鹽(如三聚磷酸鈉) 23.00 23.0023.0023.00碳酸鈉 23.00 23.0023.0023.00矽酸鈉 14.00 14.0014.0014.00沸石 8.20 8.20 8.20 8.20螯合劑(二亞乙基三胺五乙0.40 0.40 0.40 0.40酸)硫酸鈉 5.50 5.50 5.50 5.50水 補充至100％
在實施例25-26中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體被絲氨酸101天門冬氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例27-28中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被絲氨酸101天門冬氨酸和蘇氨酸66穀氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例29-32顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 29303132Val95Asp+Leu126Ser+Asn155Gln 0.10 0.20 0.03 0.05Gly65Ser+Gly102Asn+Val203Glu--0.02 0.05十二烷基苯磺酸12.00 12.00 12.00 12.00沸石A(1-10μm)26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸4.00 4.00 4.00 4.0012-14仲(2，3)烷基硫酸鹽，鈉鹽 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00光學增亮劑0.10 0.10 0.10 0.10硫酸鈉17.00 17.00 17.00 17.00水和微量物質 補充至100％在實施例29-30中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體被纈氨酸95天門冬氨酸+亮氨酸126絲氨酸+天門冬醯胺155穀氨醯胺所取代，結果大體上相同。
在實施例31-32中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被纈氨酸95天門冬氨酸+亮氨酸126絲氨酸+天門冬醯胺155穀氨醯胺和甘氨酸65絲氨酸+甘氨酸102天門冬醯胺+纈氨酸203穀氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例33-36顆粒狀織物清潔劑實施例編號成分 33 34 35 36Ser63Glu0.100.200.030.05Leu96Asn+Lys213Asp - - 0.020.05十三鏈烷基苯磺酸 22.00 22.00 22.00 22.00磷酸鹽(如三聚磷酸鈉)23.00 23.00 23.00 23.00碳酸鈉 23.00 23.00 23.00 23.00檸檬酸鈉14.00 14.00 14.00 14.00沸石8.208.208.208.20螯合劑(二亞乙基三胺五乙 0.400.400.400.40酸)硫酸鈉 5.505.505.505.50水補充至100％在實施例33-34中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體被絲氨酸63穀氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例35-36中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被絲氨酸63穀氨酸和亮氨酸96天門冬醯胺+賴氨酸213天門冬氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例37-40顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分373839 40Asn62Ser+Ser163Asp+Phe189Ser+ 0.10 0.20 0.03 0.05Ala216GluGly97Ser+Trp106Ile+Tyr217Leu- -0.02 0.05十二烷基苯磺酸 12.00 12.00 12.00 12.00沸石(1-10μm) 26.00 26.00 26.00 26.002-丁基辛酸 4.00 4.00 4.00 4.0012-14仲烷基(2，3)硫酸鹽，鈉鹽 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 5.00 5.00 5.00 5.00光學增亮劑 0.10 0.10 0.10 0.10硫酸鈉 17.00 17.00 17.00 17.00水和微量物質 補充至100％在實施例37-38中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體被天門冬醯胺62絲氨酸+絲氨酸163天門冬氨酸+苯丙氨酸189絲氨酸+丙氨酸216穀氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例39-40中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被天門冬醯胺62絲氨酸+絲氨酸163天門冬氨酸+苯丙氨酸189絲氨酸+丙氨酸216穀氨酸和甘氨酸97絲氨酸+色氨酸106異亮氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例41-42顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 41 42鏈烷基苯磺酸鹽11.410.70動物脂烷基硫酸鹽1.802.4014-15烷基硫酸鹽 3.003.107倍乙氧基化14-15烷醇 4.004.0011倍羥乙基化動物脂肪醇1.801.80分散劑0.070.1液體聚矽氧烷 0.800.80檸檬酸三鈉14.00 15.00檸檬酸3.002.50沸石 32.50 32.10馬來酸丙烯酸共聚物 5.005.00二亞乙基三胺五亞甲基磷酸 1.000.20Ala98Asp+Ala187Ser0.300.30脂肪酶0.360.40澱粉酶0.300.30矽酸鈉2.002.50硫酸鈉3.505.20聚乙烯吡咯烷酮0.300.50過硼酸鹽 0.51苯磺酸鹽 0.10.2過氧化物酶0.10.1
微量物質 加至100 加至100實施例43-44顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 43 4412鏈烷基苯磺酸鈉6.5 8.0硫酸鈉 15.018.0沸石A 26.022.0次氮基三乙酸鈉 5.0 5.0聚乙烯吡咯烷酮 0.5 0.7四乙醯乙二胺3.0 3.0硼酸4.0 -過硼酸 0.5 1酚磺酸 0.1 0.2Gln59ser+Asn62Ser+Leu96Gly+Ser204Gln0.4 0.4填充劑(例如矽酸鹽、碳酸鹽、香味劑、水)加至100加至100
實施例45緊密型顆粒狀織物清潔組合物成分重量％烷基硫酸 8.0烷基乙氧基硫酸 2.03位和7倍乙氧基化25和45烷醇的混合物 6.0聚羥基脂肪醯胺 2.5沸石 17.0層狀矽酸/檸檬酸鹽 16.0碳酸鹽 7.0馬來酸丙烯酸共聚物 5.0去汙聚合物 0.4羧甲基纖維素 0.4聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物 0.1乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮共聚體 0.1聚乙二醇2000 0.2Val95Gln+Tyr104Glu+Gly127Gln+Lys213Glu+0.5Ala216Asp脂肪酶 0.2纖維素酶 0.2四乙醯乙二胺 6.0過碳酸鹽 22.0乙二胺二琥珀酸 0.3消泡劑 3.54，4』-雙(2-嗎啉代-4-苯胺基-均三嗪-6-基氨基) 0.25茋-2，2』-二磺酸二鈉4，4』-雙(2-sulfostyril)二苯基二鈉0.05水、香味劑和微量物質 加至100實施例46顆粒狀織物清潔組合物成分 重量％鏈烷基苯磺酸鹽 7.616-18烷基硫酸鹽 1.37倍乙氧基化14-15烷醇 4.0椰子烷基二甲基羥乙基氯化銨 1.4分散劑 0.07液體聚矽氧烷 0.8檸檬酸三鈉 5.0沸石4A 15.0馬來酸丙烯酸共聚物 4.0二亞乙基三胺五亞甲基磷酸 0.4過硼酸鹽 15.0四乙醯乙二胺 5.0蒙脫石粘土 10.0聚(氧乙烯)(分子量300,000)0.3Ser63Glu+Thr104Asn+Gln206Ser+Tyr217Thr 0.4脂酶 0.2澱粉酶 0.3纖維素酶 0.2矽酸鈉 3.0
碳酸鈉 10.0羧甲基纖維素 0.2增亮劑 0.2水、香味劑和微量物質 加至100實施例47顆粒狀織物清潔組合物成分重量％鏈烷基苯磺酸 6.92動物脂肪烷基硫酸鹽2.057倍乙氧基化14-15烷醇 4.43倍乙氧基化12-15烷基乙氧基硫酸鹽 0.16沸石 20.2檸檬酸鹽 5.5碳酸鹽15.4矽酸鹽3.0馬來酸丙烯酸共聚物4.0羧甲基纖維素酶0.31去汙共聚物0.30Asn62Ser+Trp106Gly+Ser132Asp+Ala187Ser0.2+Phe189Ser脂酶 0.36纖維素酶 0.13過硼酸鹽四水合物 11.64過硼酸鹽單水合物 8.7
四乙醯乙二胺5.0二亞乙基三胺五甲基磷酸 0.38硫酸鎂 0.40增亮劑 0.19增亮劑、聚矽氧烷、消泡劑0.85微量物質 加至100b.液體織物清潔組合物本發明的液體織物清潔組合物包含有效量的一種或多種本發明的酶變異體，優選的活性酶在該組合物中的含量是重量比從約0.005％至約5％，更優選的是從約0.01％至約1％。該液體織物清潔組合物通常還包括一種陰離子表面活性劑、一種脂肪酸、一種水溶性清潔助洗劑和水。
本發明的液體織物清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例48-52液體織物清潔組合物實施例編號成分 4849505152Ser161Glu+Gly219Asn0.05 0.03 0.30 0.03 0.10Asn62Ser+Ile107Ala -- - 0.01 0.20+Glu206Asp+Tyr217Thr12-14烷基硫酸鹽，鈉20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00十烷醇乙氧酸鹽(3)13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 補充至100％在實施例48-50中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被絲氨酸161穀氨酸+甘氨酸219天門冬醯胺所取代，結果大體上相同。
在實施例51-52中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被絲氨酸161穀氨酸+甘氨酸219天門冬醯胺和天門冬醯胺62絲氨酸+異亮氨酸107丙氨酸+穀氨酸206天門冬氨酸+酪氨酸217蘇氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例53-57液體織物清潔組合物實施例編號成分 5354555657Ser101Asp+Ile107Ala 0.05 0.03 0.30 0.03 0.10+Gly202SerVal95Thr+Thr208Gly - - - 0.01 0.2012-14烷基硫酸鹽，鈉 20.00 20.00 20.00 20.00 20.002-丁基辛酸5.00 5.00 5.00 5.00 5.00檸檬酸鈉 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00十烷醇乙氧酸鹽(3) 13.00 13.00 13.00 13.00 13.00單乙醇胺 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50水/丙二醇/乙醇(100∶1∶1) 補充至100％在實施例53-55中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被絲氨酸101天門冬氨酸+異亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202絲氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例56-57中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被絲氨酸101天門冬氨酸+異亮氨酸107丙氨酸+甘氨酸202絲氨酸和纈氨酸95蘇氨酸+蘇氨酸208甘氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例58-59顆粒狀織物清潔組合物實施例編號成分 585912-14碳鏈烯基琥珀酸 3.0 8.0檸檬酸單水合物 10.0 15.012-15烷基硫酸鈉 8.0 8.02倍乙氧基化12-15烷醇硫酸鈉 -3.07倍乙氧基化12-15烷醇 -8.05倍乙氧基化12-15烷醇 8.0 -二亞乙基三胺五(亞甲基磷酸) 0.2 -油酸1.8 -乙醇4.0 4.0丙二醇 2.0 2.0Asp60Glu+Gln206Asn 0.2 0.2聚乙烯吡咯烷酮 1.0 2.0消泡劑 0.15 0.15氫氧化鈉調至pH7.5過硼酸鹽0.5 1酚磺酸鹽0.1 1過氧化物酶 0.4 0.1水和微量物質 加至100
在實施例58和59中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被天門冬氨酸60穀氨酸+穀氨醯胺206天門冬醯胺所取代，結果大體上相同。
實施例60-62液體織物清潔組合物實施例編號成分 606162檸檬酸 7.10 3.00 3.00脂肪酸 2.00 -2.00乙醇1.93 3.20 3.20硼酸2.22 3.50 3.50單乙醇胺0.71 1.09 1.091，2丙二醇 7.89 8.00 8.00異丙基苯磺酸鈉 1.80 3.00 3.00甲酸鈉 0.08 0.08 0.08氫氧化鈉6.70 3.80 3.80矽消泡劑1.16 1.18 1.18Asn61Glu0.0145 - -Gly97Glu+Thr164Pro- 0.0145 -Asn62Glu+Thr158Ser+Gly215Ser -- 0.0145脂酶0.200 0.200 0.200纖維素酶 - 7.50 7.50去汙共聚物 0.29 0.15 0.15消泡劑 0.06 0.085 0.085增亮劑360.095 - -增亮劑3 - 0.05 0.05
12烷基苯磺酸 9.86 - -12-15烷基聚乙氧基(2，5)硫酸鹽 13.80 18.00 18.0012烷基葡萄糖醯胺 - 5.005.0012-13烷基聚乙氧基化物(9) 2.002.002.00水、香味劑和微量物質補充至100％c.條狀織物清潔組合物用於手工洗滌髒織物的本發明的條狀織物清潔組合物包含有效量的一種或多種本發明的酶變異體，在組合物中的優選的含量是重量比從約0.01％至約1％。
本發明的條狀織物清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例63-66條狀織物清潔組合物實施例編號成分 6364 65 66Gly97Glu+Thr164Pro 0.3-0.1 0.02Ala98Ser+Gly154Asn - -0.4 0.0312-16烷基硫酸鈉 20.020.020.020.012-14碳N-甲基葡萄糖醯胺 5.0 5.0 5.0 5.0011-13烷基苯磺酸鈉 10.010.010.010.0碳酸鈉 25.025.025.025.0焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00三聚磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00沸石A(0.1-10μ) 5.0 5.0 5.0 5.00羧甲基纖維素 0.2 0.2 0.2 0.20聚丙烯酸酯(分子量1400) 0.20.20.20.20椰子單乙醇胺5.05.05.05.00增亮劑、香味劑0.20.20.20.20硫酸鈣 1.01.01.01.00硫酸鎂 1.01.01.01.00水 4.04.04.04.00填充物* 補充至100％*可選自如碳酸鈣、滑石粉、粘土、矽酸鹽等。
在實施例63-64中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被甘氨酸97穀氨酸+蘇氨酸164脯氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例65-66中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被甘氨酸97穀氨酸蘇氨酸164脯氨酸和丙氨酸98絲氨酸+甘氨酸154天門冬醯胺所取代，結果大體上相同。
實施例67-70條狀織物清潔組合物實施例編號成分 67686970Val203Glu 0.3-0.1 0.02Gly100Glu+Ile107Ser -0.3 0.4 0.0312-16烷基硫酸鈉 20.0 20.0 20.0 20.0012-14碳-N-甲基葡萄糖醯胺 5.0 5.0 5.0 5.0011-13烷基苯磺酸鹽，鈉 10.0 10.0 10.0 10.00碳酸鈉25.0 25.0 25.0 25.00焦磷酸鈉 7.0 7.0 7.0 7.00
三聚磷酸鈉 7.07.07.07.00沸石A(0.1-10μ) 5.05.05.05.00羧甲基纖維素 0.20.20.20.20聚丙烯酸酯(分子量1400) 0.20.20.20.20椰子單乙醇胺 5.05.05.05.00增亮劑、香味劑 0.20.20.20.20硫酸鈣 1.01.01.01.00硫酸鎂 1.01.01.01.00水 4.04.04.04.00填充物*補充至100％*可選自如碳酸鈣、滑石粉、粘土、矽酸鹽等。
在實施例67中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被纈氨酸203穀氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例68中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被甘氨酸100穀氨酸+異亮氨酸107絲氨酸所取代，結果大體上相同。
在實施例69-70中，列舉於表2-25之中的任何BPN』變異體的組合，被纈氨酸203穀氨酸和甘氨酸100穀氨酸+異亮氨酸107絲氨酸所取代，結果大體上相同。B.其它清潔組合物除了以上所討論的硬表面清潔組合物、碗碟清潔組合物和織物清潔組合物以外，當需要水解不溶性底物時，一種或多種本發明的變異體可以加入許多其它清潔組合物。這樣的清潔組合物包括但不限於口腔清潔組合物、假牙清潔組合物，和接觸透鏡清潔組合物。1.口腔清潔組合物在本發明的另一個實施方案中，組合物中包含藥物學可接受量的一種或多種本發明的酶變異體，所述組合物可以用來除去牙齒或假牙上的蛋白質類汙物。這裡所使用的「口腔清潔組合物」是指牙粉、牙膏、牙膠、牙粉、口腔清洗劑、口腔噴劑、口腔膠、口香糖、糖錠、袋裝劑、片劑、生物膠、預防膏、牙科治療液等。口腔清潔組合物包含一種或多種本發明的酶變異體，在組合物中的優選的含量是重量比從約0.001％至約20％，更優選的是從約0.001％至約10％，還要優選的是從約0.01％至約5％，以及藥物學可接受的載體。這裡所使用的「藥物學可接受」的意思是術語中描述的藥品、藥劑或無活性的成分適用於接觸人類和低級動物的組織，並且沒有過度的毒性、不相容性、不穩定性、刺激、過敏反應等，具有合理的利益/風險比。典型地，口腔清潔組合物中口腔清潔成分中的藥用口腔清潔載體成分的重量比通常是從約50％至約99.99％，優選的是從約65％至約99.99％，更優選的是從約65％至約99％。
可以包含於本發明的口腔清潔組合物的藥用載體成分和可選的成分對於本領域的專業人員是熟知的。口腔清潔組合物中有用的許多不同的組合物類型、載體成分和可選成分公開於美國專利5,096,700，西貝爾，頒布於1992年3月17日；美國專利5,028,414，桑帕庫馬，頒布於1991年7月2日；和美國專利5,028,415，貝尼笛格、布希和桑伯格，頒布於1991年7月2日；所有這些在此處作為文獻引用。
本發明的口腔清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例71-74牙粉組合物實施例編號成分71 72 73 74Gln59Asp+Ala98Glu+Gly102Asp 2.000 3.500 1.500 2.000+Ser105Glu+Leu109Thr山梨醇(70％水溶液) 35.000 35.000 35.000 35.000PEG-6*1.000 1.000 1.000 1.000
矽石牙科擦粉**20.000 20.000 20.000 20.000氧化鈉0.243 0.243 0.243 0.243二氧化鈦 0.500 0.500 0.500 0.500糖精鈉0.286 0.286 0.286 0.286烷基硫酸鈉(27.9％水溶液) 4.000 4.000 4.000 4.000香味劑1.040 1.040 1.040 1.040羧乙烯聚合物***0.300 0.300 0.300 0.300角叉膠****0.800 0.800 0.800 0.800水 補充至100％*PEG-6＝分子量為600的聚二醇**冷凝的矽石鑑別為Zeodent119，由J.M.胡伯提供。
***Carbopol由B.F.古德裡希化學公司提供。
****Iota角叉膠由何庫斯化學公司提供。
在實施例71-74中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被穀氨醯胺79天門冬氨酸+丙氨酸98穀氨酸+甘氨酸102天門冬氨酸+絲氨酸105穀氨酸+亮氨酸209蘇氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例75-78口腔清潔組合物實施例編號成分75767778Leu96Thr+Gly128Asp3.00 7.5 1.00 5.00+Ala133Glu+Asn155Glu+Lys213Asp+Ala216AspSDA 40醇 8.00 8.00 8.00 8.00
香味劑0.08 0.08 0.08 0.08乳化劑0.08 0.08 0.08 0.08氟化鈉0.05 0.05 0.05 0.05甘油 10.00 10.00 10.00 10.00甜味劑0.02 0.02 0.02 0.02安息香酸 0.05 0.05 0.05 0.05氫氧化鈉 0.20 0.20 0.20 0.20染料0.04 0.04 0.04 0.04水 補充至100％在實施例75-78中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被亮氨酸96蘇氨酸+甘氨酸128天門冬氨酸+丙氨酸133穀氨酸+天門冬醯胺155穀氨酸+賴氨酸213天門冬氨酸+丙氨酸216天門冬氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例79-82錠劑組合物實施例編號成分 79 8081 82Ser132Asp+Tyr217Leu 0.01 0.03 0.10 0.02山梨醇17.5017.5017.5017.50甘露醇17.5017.5017.5017.50澱粉 13.6013.6013.6013.60甜味劑1.20 1.20 1.20 1.20香味劑11.7011.7011.7011.70色素 0.10 0.10 0.10 0.10玉米漿 補充至100％
在實施例79-82中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被絲氨酸132天門冬氨酸+酪氨酸217亮氨酸所取代，結果大體上相同。
實施例83-86口香糖組合物實施例編號成分83848586Thr66Pro+Gln103Asn 0.030.02 0.10 0.05+Lys213Asp山梨醇晶體 38.44 38.00 38.00 38.00Paloja-T口香糖基質*20.00 20.00 20.00 20.00山梨醇(70％水溶液) 22.00 22.00 22.00 22.00甘露醇 10.00 10.00 10.00 10.00甘油7.567.56 7.56 7.56香味劑 1.001.00 1.00 1.00*由L.A.德裡夫斯公司提供。
在實施例83-86中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被蘇氨酸66脯氨酸+穀氨醯胺103天門冬醯胺+賴氨酸213天門冬氨酸所取代，結果大體上相同。2.假牙清潔組合物在本發明的另一個實施方案中，用於在口腔外清潔假牙的假牙清潔組合物包含一種或多種本發明的酶變異體。該假牙清潔組合物包含有效量的一種或多種酶變異體，在組合物中含量為重量比從約0.0001％至約50％，優選的含量是佔組合物的重量比從約0.001％至約35％，更優選的是從約0.01％至約35％，以及假牙清潔載體。各種假牙清潔組合物的配方對本領域是熟知的，例如發泡片等(例見美國專利5,055,305，揚，此處作為文獻引用)，並且是適合於與一種或多種酶變異體共同使用以從假牙上清除蛋白質類的汙物。
本發明的假牙清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例87-90雙層起泡牙科清潔片實施例編號成分87888990酸性層Gln59Glu+Ser63Glu+Val95Met 1.01.5 0.01 0.05+Gly97Pro+Tyr217Ala酒石酸 24.0 24.0 24.00 24.00碳酸鈉 4.04.0 4.00 4.00磺酸 10.0 10.0 10.00 10.00PEG20,0004.04.0 4.00 4.00雙碳酸鈉 24.5 24.5 24.50 24.50過硫酸鉀 15.0 15.0 15.00 15.00焦磷酸鈉酸式鹽 7.07.0 7.00 7.00焦化矽石 2.02.0 2.00 2.00TAED*7.07.0 7.00 7.00蓖麻鹼磺基琥珀酸 2.02.0 2.00 2.00香味劑 7.07.0 7.00 7.00鹼性層過硼酸鈉單水合物 32.0 32.0 32.00 32.00二碳酸鈉 19.0 19.0 19.00 19.00EDTA 3.03.0 3.00 3.00
三聚磷酸鈉 12.0 12.0 12.00 12.00PEG 20,000 2.0 2.0 2.00 2.00過硫酸鉀26.0 26.0 26.00 26.00碳酸鈉2.0 2.0 2.00 2.00焦化矽石 2.0 2.0 2.00 2.00染料/香味劑 2.0 2.0 2.00 2.00*四乙醯乙二胺在實施例87-90中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被穀氨醯胺59穀氨酸+絲氨酸63穀氨酸+纈氨酸95甲硫氨酸+甘氨酸97脯氨酸+酪氨酸217丙氨酸所取代，結果大體上相同。3.接觸透鏡清潔組合物在本發明的另一個實施方案中，接觸透鏡清潔組合物包含一種或多種本發明的酶變異體。該接觸透鏡清潔組合物包含有效量的在組合物中含量為重量比從約0.01％至約50％的一種或多種酶變異體，優選的含量是佔組合物的重量比從約0.01％至約20％，更優選的是從約1％至約5％，以及接觸透鏡清潔載體。各種接觸透鏡清潔組合物的配方對本領域是熟知的，例如片劑、液體等(例見美國專利4,863,627，戴韋思、米肯和力絲，頒布於1989年9月5日；美國專利Re.32,672，胡斯、拉木和其拉，重頒布於1988年5月24日；美國專利4,609,493，沙福，頒布於1986年9月2日；美國專利4,690,793，歐幹比裡和史密斯，頒布於1987年9月1日；美國專利4,614,549，歐幹比裡、裡德海墨和史密斯，頒布於1986年9月30日；以及美國專利4,285,738，奧卡塔，頒布於1981年8月25日；其中每篇都在此處作為文獻引用)，並且是適合於與一種或多種酶變異體共同使用以從接觸透鏡上清除蛋白質類的汙物。
本發明的接觸透鏡清潔組合物的實施方案用下列實施例說明。
實施例91-94酶促接觸透鏡清潔組合物實施例編號成分91929394Serl91Glu+Gly219Ser 0.01 0.5 0.1 2.0葡萄糖50.00 50.0 50.0 50.0非離子表面活性劑(聚氧 2.00 2.0 2.0 2.0乙烯-聚氧丙烯共聚物)陰離子表面活性劑(聚氧 1.00 1.0 1.0 1.0乙烯-烷苯基醚硫醚鈉)氯化鈉1.00 1.0 1.0 1.0硼砂 0.30 0.3 0.3 0.3水補充至100％在實施例91-94中，列舉於表2-25之中的BPN』變異體被絲氨酸191穀氨酸+甘氨酸219絲氨酸所取代，結果大體上相同。
在描述過本發明的具體實施方案之後，對於本領域的專業人員來說顯而易見的是，各種針對本發明的改變和修改可以在本發明的主旨和範圍的情況下完成。在後面的權利要求中，所有這樣的修改將包含在本發明的範圍內。
序列表(1)一般資料(i)申請人菲力浦F.布魯德等(ii)發明名稱具有更低的吸附性和更高的水解能力的BPN』變異體，其中一個或多個環狀區被取代(iii)序列數1
(iv)聯繫地址(A)收件人PROCTERGAMBLE公司(B)街道邁阿密河東路11810號(C)城市羅絲(D)州俄亥俄(E)國家美國(F)郵編45061(v)計算機可讀格式(A)介質類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統PC-DOS/MS-DOS(D)軟體專利發布#1.0，#1.25版(vi)現有申請數據(A)申請號(B)申請日期(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名布藍穆·J科絲坦潔(B)註冊號34,804(C)代理人參考號5597(ix)通訊信息(A)電話513-627-2858(B)傳真513-627-0260(2)第一號序列信息(i)序列特徵(A)長度275個胺基酸
(B)類型胺基酸(C)拓撲類型線性(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQ ID NO1丙氨酸 穀氨醯胺 絲氨酸 纈氨酸 脯氨酸 酪氨酸 甘氨酸1 5纈氨酸 絲氨酸 穀氨醯胺 異亮氨酸 賴氨酸 丙氨酸 脯氨酸10丙氨酸 亮氨酸 組氨酸 絲氨酸 穀氨醯胺 甘氨酸 酪氨酸1520蘇氨酸 甘氨酸 絲氨酸 天門冬醯胺 纈氨酸 賴氨酸 纈氨酸25丙氨酸 纈氨酸 異亮氨酸 天門冬醯胺 絲氨酸 甘氨酸 異亮氨酸30 35天門冬醯胺 絲氨酸 絲氨酸 組氨酸 脯氨酸 天門冬醯胺 亮氨酸40賴氨酸 纈氨酸 丙氨酸 甘氨酸 甘氨酸 丙氨酸 絲氨酸45甲硫氨酸 纈氨酸 脯氨酸 絲氨酸 穀氨酸 蘇氨酸 天門冬醯胺50 55脯氨酸 色氨酸 穀氨醯胺 天門冬氨酸 天門冬醯胺 天門冬醯胺 絲氨酸60組氨酸 甘氨酸 蘇氨酸 組氨酸 纈氨酸 丙氨酸 甘氨酸65 70蘇氨酸 纈氨酸 丙氨酸 丙氨酸 亮氨酸 天門冬醯胺 天門冬醯胺75絲氨酸 異亮氨酸 甘氨酸 纈氨酸 亮氨酸 甘氨酸 纈氨酸80丙氨酸 脯氨酸 絲氨酸 丙氨酸 絲氨酸 亮氨酸 酪氨酸85 90丙氨酸 纈氨酸 賴氨酸 纈氨酸 亮氨酸 甘氨酸 丙氨酸95天門冬醯胺 甘氨酸 絲氨酸 甘氨酸 穀氨醯胺 酪氨酸 絲氨酸100 105色氨酸 異亮氨酸 異亮氨酸 天門冬醯胺 甘氨酸 異亮氨酸 穀氨酸110色氨酸 丙氨酸 異亮氨酸 丙氨酸 天門冬醯胺 天門冬醯胺 甲硫氨酸115天門冬氨酸 纈氨酸 異亮氨酸 天門冬醯胺 甲硫氨酸 絲氨酸 亮氨酸120 125甘氨酸 甘氨酸 脯氨酸 絲氨酸 甘氨酸 絲氨酸 丙氨酸130丙氨酸 亮氨酸 賴氨酸 丙氨酸 丙氨酸 纈氨酸 天門冬氨酸135 140賴氨酸 丙氨酸 纈氨酸 丙氨酸 絲氨酸 甘氨酸 纈氨酸145纈氨酸 纈氨酸 纈氨酸 丙氨酸 丙氨酸 丙氨酸 甘氨酸150天門冬醯胺 穀氨酸 甘氨酸 蘇氨酸 絲氨酸 甘氨酸 絲氨酸155 160絲氨酸 絲氨酸 蘇氨酸 纈氨酸 甘氨酸 酪氨酸 脯氨酸165甘氨酸 賴氨酸 酪氨酸 脯氨酸 絲氨酸 纈氨酸 異亮氨酸170 175丙氨酸 纈氨酸 甘氨酸 丙氨酸 纈氨酸 天門冬醯胺 絲氨酸180絲氨酸 天門冬醯胺 穀氨醯胺 精氨酸 丙氨酸 絲氨酸 色氨酸185絲氨酸 絲氨酸 纈氨酸 甘氨酸 脯氨酸 穀氨酸 亮氨酸190 195天門冬醯胺 纈氨酸 甲硫氨酸 丙氨酸 脯氨酸 甘氨酸纈氨酸200絲氨酸 異亮氨酸 穀氨醯胺 絲氨酸 蘇氨酸 亮氨酸 脯氨酸205 210甘氨酸 天門冬醯胺 賴氨酸 酪氨酸 甘氨酸 丙氨酸 酪氨酸215天門冬醯胺 甘氨酸 蘇氨酸 絲氨酸 甲硫氨酸丙氨酸絲氨酸220脯氨酸 組氨酸 纈氨酸 丙氨酸 甘氨酸 丙氨酸 丙氨酸225 230丙氨酸 亮氨酸 異亮氨酸 亮氨酸 絲氨酸 賴氨酸 組氨酸235脯氨酸 天門冬醯胺 色氨酸 蘇氨酸 天門冬醯胺 蘇氨酸 穀氨醯胺240245纈氨酸 精氨酸 絲氨酸 絲氨酸 亮氨酸 穀氨酸 天門冬醯胺250蘇氨酸 蘇氨酸 蘇氨酸 賴氨酸 亮氨酸 甘氨酸 天門冬醯胺255絲氨酸 色氨酸 酪氨酸 酪氨酸 甘氨酸 賴氨酸 甘氨酸260 265亮氨酸 異亮氨酸 天門冬醯胺 纈氨酸 穀氨醯胺 丙氨酸 丙氨酸270丙氨酸 穀氨醯胺27權利要求
1.一種具有野生型胺基酸序列的經修飾的胺基酸序列的BPN』變異體，該野生型胺基酸序列包含第一環狀區、第二環狀區、第三環狀區、第四環狀區和第五環狀區；其特徵為修飾胺基酸序列在一個或多個環狀區的一個或多個位點有取代；其中A.當取代發生在第一環狀區時，該取代發生在位點59、60、61、62、63、65或66中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點59時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨酸或絲氨酸；b.當取代發生在位點60時，取代胺基酸是穀氨酸；c.當取代發生在位點61時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸；d.當取代發生在位點62時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸；e.當取代發生在位點63時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；f.當取代發生在位點65時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；並且g.當取代發生在位點66時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；B.當取代發生在第二環狀區時，該取代發生在位點95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106或107中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點95時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；b.當取代發生在位點96時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；c.當取代發生在位點97時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；d.當取代發生在位點98時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；e.當取代發生在位點99時，取代胺基酸是穀氨酸；f.當取代發生在位點100時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；g.當取代發生在位點101時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；h.當取代發生在位點102時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；i.當取代發生在位點103時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨酸或絲氨酸；j.當取代發生在位點104時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；k.當取代發生在位點105時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；l.當取代發生在位點106時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或纈氨酸；並且m.當取代發生在位點107時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；C.當取代發生在第三環狀區時，該取代發生在位點126、127、128、129、130、131、132或133中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點126時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；b.當取代發生在位點127時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；c.當取代發生在位點128時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸；d.當取代發生在位點129時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸；e.當取代發生在位點130時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；f.當取代發生在位點131時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸或絲氨酸；g.當取代發生在位點132時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；並且h.當取代發生在位點133時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；D.當取代發生在第四環狀區時，該取代發生在位點154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166或167中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點154時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；b.當取代發生在位點155時，取代胺基酸是天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸或絲氨酸；c.當取代發生在位點156時，取代胺基酸是天門冬氨酸；d.當取代發生在位點157時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；e.當取代發生在位點158時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；f.當取代發生在位點159時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；g.當取代發生在位點160時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；h.當取代發生在位點161時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；i.當取代發生在位點162時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；j.當取代發生在位點163時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；k.當取代發生在位點164時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、脯氨酸或絲氨酸；l.當取代發生在位點165時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；m.當取代發生在位點166時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、脯氨酸或絲氨酸；並且n.當取代發生在位點167時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；E.當取代發生在第五環狀區時，該取代發生在位點187、188、189、190或191中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點187時，取代胺基酸是天門冬醯胺、天門冬氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸或蘇氨酸；b.當取代發生在位點188時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；c.當取代發生在位點189時，取代胺基酸是丙氨酸、天門冬醯胺、天門冬氨酸、半胱氨酸、穀氨醯胺、穀氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸或纈氨酸；d.當取代發生在位點190時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；並且e.當取代發生在位點191時，取代胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；通過這些取代，與野生型枯草溶菌素BPN＇相比，BPN』變異體對不可溶底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。
2.如權利要求1中的BPN』變異體，其中一個或多個取代發生在第一環狀區。
3.如權利要求1中的BPN』變異體，其中一個或多個取代發生在第二環狀區。
4.如權利要求1中的BPN』變異體，其中一個或多個取代發生在第三環狀區。
5.如權利要求1中的BPN』變異體，其中一個或多個取代發生在第四環狀區。
6.如權利要求1中的BPN』變異體，其中一個或多個取代發生在第五環狀區。
7.如權利要求1-6中的任何一種BPN』變異體，其中野生型胺基酸序列還包含一個第六環狀區，其特徵在於修飾的胺基酸序列在第六環狀區也包含一個或多個取代；其中該取代發生在位點199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219或220中的一個或多個位點；其中a.當取代發生在位點199時，取代199位的胺基酸是半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；b.當取代發生在位點200時，取代200位的胺基酸是組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；c.當取代發生在位點201時，取代201位的胺基酸是甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；d.當取代發生在位點202時，取代202位的胺基酸是脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；e.當取代發生在位點203時，取代203位的胺基酸是甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；f.當取代發生在位點204時，取代204位的胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；g.當取代發生在位點205時，取代205位的胺基酸是亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；h.當取代發生在位點206時，取代206位的胺基酸是脯氨酸、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；i.當取代發生在位點207時，取代207位的胺基酸是天門冬氨酸或穀氨酸；j.當取代發生在位點208時，取代208位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；k.當取代發生在位點209時，取代209位的胺基酸是異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；l.當取代發生在位點210時，取代210位的胺基酸是丙氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；m.當取代發生在位點211時，取代211位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；n.當取代發生在位點212時，取代212位的胺基酸是穀氨醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；o.當取代發生在位點213時，取代213位的胺基酸是色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；p.當取代發生在位點214時，取代214位的胺基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；q.當取代發生在位點215時，取代215位的胺基酸是蘇氨酸、脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；r.當取代發生在位點216時，取代216位的胺基酸是組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；s.當取代發生在位點217時，取代217位的胺基酸是亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、組氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；t.當取代發生在位點218時，取代218位的胺基酸是穀氨醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；u.當取代發生在位點219時，取代219位的胺基酸是脯氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸；並且v.當取代發生在位點220時，取代220位的胺基酸是脯氨酸、甘氨酸、穀氨醯胺、天門冬醯胺、絲氨酸、天門冬氨酸或穀氨酸。
8.一種從包含硬表面清潔組合物、碗碟清潔組合物或口腔清潔組合物、假牙清潔組合物、接觸透鏡清潔組合物以及織物清潔組合物的組合物組中篩選出的清潔組合物，其特徵在於該清潔組合物包含權利要求1-7中任何一項要求的BPN』變異體和清潔組合物載體。
9.如權利要求8中的清潔組合物，其中該清潔組合物是硬表面清潔組合物。
10.如權利要求8中的清潔組合物，其中該清潔組合物是織物清潔組合物。
11.編碼權利要求1-7中任何一項權利要求的BPN』變異體的突變BPN』基因。
全文摘要
本發明涉及枯草溶菌素BPN′的變異體，它具有野生型BPN′胺基酸序列的修飾胺基酸序列，該野生型胺基酸序列包括第一環狀區、第二環狀區、第三環狀區、第四環狀區和和第五環狀區；其中修飾的胺基酸序列在一個或多個環狀區中的特定位點，包含與存在於野生型枯草溶菌素BPN′中的不同的胺基酸(即取代)，通過這些胺基酸的作用，BPN′變異體與野生型枯草溶菌素BPN′相比，對不可溶的底物具有更低的吸附性和更高的水解能力。本發明還涉及編碼這樣的枯草溶菌素BPN′變異體的基因。本發明還涉及用於清潔多種表面的包含該枯草溶菌素BPN′的組合物。
文檔編號C12N15/57GK1151761SQ95193941
公開日1997年6月11日 申請日期1995年3月16日 優先權日1994年5月2日
發明者P·F·博羅德三世, B·L·巴內特, D·N·盧賓, C·K·戈什 申請人:普羅格特-甘布爾公司 被以下專利引用 (1),