華法林藥物基因vkorc1和cyp2c9突變檢測試劑盒的製作方法
2023-05-27 01:19:41
專利名稱:華法林藥物基因vkorc1和cyp2c9突變檢測試劑盒的製作方法
技術領域:
本發明涉及PCR技術和高溫連接酶(LDR)技術檢測試劑盒,特別涉及到特異性引物的多種PCR和多重LDR技術檢測華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9常規突變的試劑盒。
背景技術:
華法林是一種香豆素類口服抗凝藥,廣泛用於預防和治療靜脈血栓、肺栓塞、慢性心房纖維顫動、心肌梗塞、缺血性休克等多種血栓性疾病和人工心臟瓣膜植入手術,它的抗凝效果超過了目前批准的其它口服類抗凝藥。但是華法林的劑量很難掌握,因為不同病人的所需用量可以相差十倍,而且使用不恰當的劑量會導致出血等嚴重不良反應。在過去二十年中,由於華法林治療指數窄,劑量個體差異大以及有出血危險,使得它位居嚴重藥物不良反應藥物的前十名。美國每年新增華法林使用者二百萬。在中國,每年使用華法林的患者超過四百萬。患者口服華法林通常逐漸增加劑量,同時監測凝血酶原時間國際標準化比率(INR),使之保持在2-3之間。但要達到穩定劑量通常需要幾個月的時間[4』5]。因此華法林劑量過高,患者就會有出血的危險,劑量過低則達不到治療效果。華法林劑量、抗凝穩定性和出血危險性受年齡、性別、體重、疾病、飲食中維生素K攝入等環境因素、以及遺傳變異等因素的影響,其中遺傳變異是主要影響因素。目前,已知與華法林的藥效學和藥動學相關的基因達30餘種,其中維生素K環氧化物還原酶複合體亞單位I基因(VKORCl)的基因多態性和細胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影響華法林用量個體差異最主要的兩個遺傳因素。維生素K環氧化物還原酶(VKOR)是華法林作用的靶蛋白。華法林通過抑制VK0R,使無活性的氧化型(還氧化物型)VK無法還原為有活性的還原型(氫醌型)VK而起到抗凝作用。多個VKORCl的SNP (單核苷酸多態性)位點被發現與華法林用量個體差異相關,其中常見的兩個SNP是第一內含子的1173C > T和3』 UTR的1639G > A。這些SNP位點呈高度連鎖不平衡,經單倍型分析分為A、B兩組單體型,A組(Hl和H2)與華法林低劑量相關,B組(H7、H8和H9)與高劑量相關。CYP2C9是華法林最主要的代謝酶。到目前為止,已發現的CYP2C9的等位基因有30種,其中以*1(野生型)、*2(Argl44CyS)、*3(Ile359Leu)最為常見。攜帶有變異性等位基因的患者,其華法林代謝酶的活性明顯低於野生型,並且,其出血的危險性增加2 3倍。最近已有學者對這兩個基因在華法林個體差異中的貢獻大小進行了研究,這些研究顯示VKORCl和CYP2C9的多態性對華法林用量個體差異的貢獻比例分別6-37%和5_22%。近年來,一些針對特定人群,結合遺傳因素和非遺傳因素的華法林穩定劑量預測算法相繼出現。但這些算法在廣泛應用於臨床之前,必須進行前瞻性的隨機病例*對照研究,以評價其安全性和劑量預測的可靠性。在2007年8月,美國FDA更新了華法林藥物說明,建議R144C突變體(CYP2C9*2)和I359L突變體(CYP2C9*3)和VK0RC1*1639G > A攜帶者降低華法林起始用量。但是並沒有提供一個使 用遺傳因素預測華法林個體治療劑量的特殊方法。近年來針對華法林的基於藥物基因組學的前瞻性研究僅見於歐美國家白種人的報導,由於存在人種間的差異,有必要對其他種族人群特別是中國人進行研究。
中國每年服用華法林的患者超過400萬,而VKORCl和CYP2C9基因與華法林劑量具有很好的相關性,通過VKORCl和CYP2C9基因指導臨床用藥將為國家節約數十億元的治療費用。本研究就VKORCl和CYP2C9基因在中國蘇北人群中的變異情況,來預測它們跟華法林劑量的關係,更科學地指導臨床華法林的用藥劑量,為華法林的個體化用藥指明方向。華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變的檢測方法通常是直接測序,但該方法步驟繁瑣,試驗周期長,對操作人員技術水平要求高,因此難以在臨床大面積推廣。更為重要的是測序技術本身靈敏度不高,只能檢測15%以上的突變。而腫瘤組織是一個異質性的組織,VKORCl和CYP2C9突變又是一種雜合性突變,即EGFR基因DNA雙鏈中有一條發生突變,而這種突變在檢測樣本中的比例小於15 %,測序方法根本就無法檢出。高溫連接酶(LDR)技術是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別。高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的鹼基錯配,則連接反應就不能進行。我們基於測序分型技術的LDR試劑盒是針對臨床應用設計,填補了國內外基因分型及DNA多態性檢測在臨床分子診測應用上的空白。與傳統的直接測序法相比,LDR測序分型試劑盒有如下顯著優勢:I)降低成本:測序反應的所有相關試劑完全由ABI或Beckman這樣的大型國外企業掌握,試劑成本非常昂貴,而LDR技術則由於操作簡單,試劑要求也非常簡單,可大幅度降低成本。2)簡化操作:直接測序法一般要經過PCR反應條件優化、PCR產物純化、測序引物設計、測序反應化學類型選擇等步驟,單是PCR產物純化就是一個操作難點,而應用LDR測序分型試劑盒可以免去純化這一繁瑣的步驟,使得檢測操作變得簡單方便,同時也提高了檢測結果的可靠性和準確性;方便了臨床的開展3)提高數據量:DNA序列的測定只是針對某一區段進行的,而這一選定區段內醫生和患者關心的一般只是其中的一個位點,而基於LDR技術的檢測系統可`以同時進行多位點的SNP分型,這一高通量的特點不僅提高了臨床檢測的效率,也是很大程度上為病人節省了本需要多次檢測的相應費用。4)操作簡單流程短,從DNA製備開始,僅需要5個小時,而測序往往要超過8個小時。其中DNA製備0.5小時,PCR需2 3小時,LDR需0.5 I小時,測序時間需0.5小時,方便臨床的開展。
發明內容
本發明的目的是提供一種基於多重PCR和LDR技術的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變檢測試劑盒,可用於臨床華法林藥物基因常見突變檢測。本發明的技術路線為:1,針對華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變位點VKORCl 1173G/T、VKORCl 1639C/T和CYP2C9*3設計能夠與野生型和突變型模板上遊或下遊互補的寡基核苷酸引物,以及分別與VKORCl和CYP2C9突變位點VKORCl 1173G/T、VKORCl 1639C/T和CYP2C9*3突變位點結合的寡基核苷酸探針。2,配製適宜於PCR和LDR的反應體系。PCR反應體系包括Taq酶,UNG酶和dNTP,PCR緩衝液,引物等;LDR反應體系包括連接酶,UNG酶,dNTP,探針和緩衝溶液等。
3,從待測樣本中提取DNA,加到PCR反應體系中,進行多重PCR反應。4,從上述PCR產物中加一定量到LDR反應體系中,進行多重LDR反應。5,將得到的LDR產物進行測序檢測,根據測序圖譜判斷樣本是否存在突變,以及是哪種突變。本發明提供的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變檢測試劑盒包括以下組分:PCR緩衝液,酶1,酶2,LDR反應液,陰性質控品,野生型質控品,VKORCl 1173G/T陽性對照,VKORCl 1639C/T陽性對照,CYP2C9*3陽性對照。其中酶I包括Taq酶,UNG酶和dNTP ;酶2包括連接酶,UNG酶,dNTP等。本發明華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變檢測試劑盒,其特徵在於VKORCl基因和CYP2C9基因檢測位點的引物序列分別是:VKORCl 1173G/T 上遊引物:CCGAGAAAGGTGATTTCCAAVKORCl 1173G/T 下遊引物:AGGGGAGGATAGGGTCAGTGVKORCl 1639C/T 上遊引物:CCTGACACCTAGTGGCTGGTVKORCl 1639C/T 下遊引物:CCTCTGGGAAGTCAAGCAAGCYP2C9*3 上遊引物:GGAAGAGAITGAACGTGTGACYP2C9*3 下遊引物:CTATGAATTTGGGGACTTCG。本發明華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含VKORCl 1173G/T的探針序列為:1173_modifyP-CTTGGACTAGGATGGGAGGTCGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1173_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT1173_GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC本發明華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含VKORCl 1639C/T的探針序列為:1639_modifyP-GGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1639_CTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCG1639_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCA。本發明華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含CYP2C9*3的探針序列為:CYP2C9*3_modifyP*GTATCTCTGGACCTCGTGCACCACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT*FAMCYP2C9*3_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAATCYP2C9*3_CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG 根據本發明的實施方案,陰性質控品是生理鹽水;野生型質控品,VKORCl 1173G/T陽性對照,VKORCl 1639C/T陽性對照,CYP2C9*3陽性對照分別為測序結果檢測分別為野生和突變的質粒D N A。根據本發明的實施方案,其中試劑盒的待檢樣品為多種途徑獲取的帶有相關腫瘤DNA的臨床樣品,包括手術切除組織,石蠟包埋組織切片,穿刺組織,胸水,全血、血漿和血清坐寸O根據本發明的實施方案,試劑盒用於判定檢測有效性的標準是:每次都檢測陰性質控品,野生型質控品和突變型質控品,檢測結果陰性質控品和野生型質控品均為陰性且突變型質控品為陽性時,實驗才有效。本發明所述的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,目前針對臨床華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9突變檢測方案主要有兩種=Taqman探針法和Sanger測序法。Taqman探針法操作簡單快速,實驗靈敏度高,但無法同時檢測多個突變位點。Sanger測序法操作繁瑣,檢測需10小時以上,檢測靈敏度低,無法檢測低滴度樣本(突變比率小於15% )0基於PCR*LDR的VKORCl和CYP2C9突變位點檢測方案能夠突破傳統核酸突變檢測技術的局限:對多個突變位點進行檢測;檢測靈敏度達到1% ;操作方便,基本實現操作自動化,產品的檢測時間縮短為5個小時左右。
具體實施方式
:實施例1I,華法林藥物基因 VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒的組成:PCR緩衝液,酶1,酶2,LDR反應液,陰性質控品,野生型質控品,VKORCl 1173G/T陽性對照,VKORCl 1639C/T陽性對照,CYP2C9*3陽性對照和分隔併集中包裝這些管的試劑盒子。2,核酸提取:取10到30毫克新鮮組織或200微升抗凝血,使用Qiagen或其它公司的DNA提取試劑盒,參照試劑盒說明書提取樣本DNA。3,配製適宜於PCR和LDR的反應體系。PCR反應體系包括Taq酶,UNG酶和dNTP,PCR緩衝液,引物等;LDR反應體系包括連接酶,UNG酶,dNTP,探針和緩衝溶液等。4,多重PCR擴增。擴增管中,加入18ul PCR緩衝液、Iul酶I和Iul樣本DNA,擴增條件為:95°C 15min,35個循環包括94°C 30秒;56°C lmin30秒;72°C 30秒,最後72°C5min。5,多重LDR反應。反應管中,加入8ul LDR緩衝液、Iul酶2和Iul上述PCR產物,反應條件為:94°C 2min, 15個循環包括94°C 30秒;60°C 2min。6,測序儀結果檢測,將得到的LDR產物進行測序檢測,檢測結果用GeneMapper4.0軟體進行分析。7,根據本發明的實施方案,試劑盒用於判定檢測有效性的標準是:每次都檢測陰性質控品,野生型質控品和突變型質控品,檢測結果陰性質控品和野生型質控品均為陰性且突變型質控品為陽性時,實驗結果有效。4個位點為純合子參見附
圖1A,4個位點為雜合子參見附圖1B。實施例2用上述方法對200例臨床樣本進行檢測,其中VKORCl 1639C/T位點檢出121例純合子,79例雜合子;VK0RC1 1173G/T位點檢測出115例純合子,85例雜合子;CYP2C9*3基因檢出純合子155例,雜合子45例。根據上述檢測結果指導臨床華法林的劑量,患者不良反應大幅降低。通過LDR技術檢測華法林用藥相關的VKORCl基因和CYP2C9基因突變位點,可用於華法林藥物劑量的預測和心血管患者臨床個體化用藥方案的指導,對臨床用藥指導有重要意義。
權利要求
1.一種採用特異性引物探針高溫連接酶技術(LDR技術)的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,該試劑盒包括:PCR緩衝液,酶1,酶2,LDR反應液,陰性質控品,野生型質控品,VKORCl 1173G/T陽性對照,VKORCl 1639C/T陽性對照,CYP2C9-3陽性對照和分隔併集中包裝這些管的試劑盒子。其中VKORCl基因和CYP2C9基因檢測位點的引物序列分別是: VKORCl 1173G/T 上遊引物:CCGAGAAAGGTGAITTCCAA VKORCl 1173G/T 下遊引物:AGGGGAGGATAGGGTCAGTG VKORCl 1639C/T 上遊引物:CCTGACACCTAGTGGCTGGT VKORCl 1639C/T 下遊引物:CCTCTGGGAAGTCAAGCAAG CYP2C9-3 上遊引物:GGAAGAGAITGAACGTGTGA CYP2C9-3 下遊引物:CTATGAAITTGGGGACTTCG。
2.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含VKORCl 1173G/T的探針序列為:1173_modifyP-CTTGGACTAGGATGGGAGGTCGGGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1173_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACT1173_GTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCCCGGTGCCAGGAGATCATCGACC。
3.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含VKORCl 1639C/T的探針序列為:1639_modifyP-GGTGCGGTGGCTCACGCCTATAATCTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM1639_CTTTTTTTTTTTTTT`TTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCG1639_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGACCTGAAAAACAACCATTGGCCA。
4.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於LDR反應液中包含CYP2C9-3的探針序列為:CYP2C9-3_modifyP-GTATCTCTGGACCTCGTGCACCACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMCYP2C9-3_ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAATCYP2C9-3_CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGGCTGGTGGGGAGAAGGTCAAG。
5.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於酶I中還包括Taq酶,UNG酶和dNTP。
6.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於酶2中還包括連接酶,UNG酶和dNTP。
7.根據權利要求1的華法林藥物基因VKORCl和CYP2C9檢測試劑盒,其特徵在於陰性質控品是生理鹽水;野生型質控品,VKORCl 1173G/T陽性對照,VKORCl 1639C/T陽性對照,CYP2C9-3陽性對照分別為測序結果檢測為突變的質粒D N A。
全文摘要
本發明提供一種特異性多重PCR技術和多重LDR技術檢測華法林兩種藥物基因VKORC1和CYP2C9檢測突變的試劑盒,特別涉及心血管患者組織以及患者血液中VKORC1和CYP2C9基因突變的診斷。本試劑盒針對分子靶向藥物療效相關的特定突變位點,設計特定的引物序列和探針序列,在進行多重PCR後,通過野生型探針和突變型探針與目的片段連接後在測序儀上進行片段分析,根據結果的峰圖判讀結果。本發明可對VKORC1和CYP2C9基因3個特定突變位點進行檢測,可以用於華法林藥物劑量的預測和心血管患者臨床個體化用藥方案的指導。
文檔編號C12Q1/68GK103184271SQ201110448310
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月27日 優先權日2011年12月27日
發明者江培學, 楊志軍, 陳偉華, 範雯琦, 吳大治, 夏懿 申請人:上海復星醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥(集團)股份有限公司