用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片及其應用的製作方法

2023-05-27 01:13:51

專利名稱：用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因分析檢測產品，具體地說是涉及一種基因檢測晶片及其配套的試劑，更具體地說是用於檢測與惡性腫瘤治療藥物反應性密切相關的一系列基因突變的基因檢測晶片和配套的試劑及其應用。

背景技術：
惡性腫瘤作為困擾人類身心健康的重大疾病，已成為全球性的公共衛生問題據世界衛生組織2007年度報導，2006年全球因癌症死亡的有630萬人，約佔總死亡人數的12％，是僅次於心血管疾病的第2大死因。從1996年以來全球每年新確診的腫瘤患者均在1030萬以上，到1999年底全球腫瘤患者總數已逾4000萬人。世界衛生組織2001年報導，世界癌症發病率和死亡率比1990年上升了22％，今後20年還將上升大約50％。2005年我國衛生部的統計資料表明我國每年新生腫瘤患者總數約212.7萬人左右，其中，每年有106萬左右的惡性腫瘤新生患者；同時，全國約有268.5萬左右的腫瘤現有患者，其中，惡性腫瘤現有患者約148.5萬左右。
抗腫瘤藥物是當前和今後相當長的時間內用於治療惡性腫瘤及其併發症的重要手段。抗腫瘤藥主要指直接殺滅腫瘤細胞而起作用的藥物，大多數抗腫瘤藥物的作用機制主要是阻止脫氧核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或蛋白質的合成，或直接對這些大分子發生作用，從而抑制腫瘤細胞的分裂增殖，使之死亡，有些藥物也可以通過改變體內激素平衡而抑制腫瘤生長。這些藥物在使用過程中的一個突出問題是藥物反應(包括療效和不良反應)的個體差異，接受藥物治療的患者中有相當一部分病情未得到良好控制，另有相當數量的患者由於不能耐受抗腫瘤藥物的強烈毒副反應而放棄治療，有的甚至死於強烈的毒副反應。因此根據藥物反應的個體差異針對每個癌症患者的具體情況選擇合適種類和劑量的抗腫瘤藥物，在提高藥物有效性的同時最大限度地減少藥物毒副反應的發生，成為未來醫學的發展趨勢。
藥物反應的個體差異是臨床上極其普遍的現象，產生這種差異的原因有許多，包括性別、年齡、體重、疾病狀況在內的多種因素都可以導致不同病人對同一種藥物的反應出現量與質的差別，然而20多年來的遺傳藥理學研究結果表明其中最重要、最根本的因素是遺傳因素，即藥物代謝酶、轉運體和受體(藥物作用靶點)的基因多態性導致了其編碼蛋白的功能改變，進一步使血藥濃度和藥物敏感性顯著不同，一言以蔽之，遺傳變異導致了藥物反應個體差異。
經過長期研究，目前國內外已發現多個基因突變與相應抗腫瘤藥物的反應性(療效和毒副反應)密切相關，其中主要包括下列內容(表1)

以上所述的基因突變均與抗腫瘤藥物在人體內的反應性密切相關，這裡所說的反應性包括了藥物的療效和安全性兩個方面，同種同劑量的藥物作用於擁有不同基因型的患者，有的人恰好有效，有的人根本無效，還有的人會出現藥物的毒副反應，因此利用各種基因檢測技術在治療之前先確定腫瘤以及病人的上述基因突變位點的基因型，根據檢測的結果調整患者的用藥種類與劑量，指導和優化腫瘤的化療方案，可以使藥物發揮最佳的療效，最大限度地防止毒副反應發生，這就是基因導向性的個體化用藥新模式。目前該種用藥模式已被越來越多的科研人員、臨床醫生及患者所接受，2006年在我國舉行的第15屆「國際遺傳藥理學大會」(IUPHAR會議)上，來自27個國家的數百名代表共同探討了基因導向個體化用藥的發展現狀和在各國的推廣情況，預測了全面「個體化用藥」時代的到來。
目前國內外已有實驗室或醫療機構開展了對CYP2D6和TPMT等與抗腫瘤藥物反應性密切相關的基因位點的檢測工作，最常用的檢測方法有聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析(PCR-RFLP法)、序列特異性PCR、手工或自動測序等方法，這些方法不僅操作繁瑣、檢測周期長、無法做到高通量，而且影響檢測結果的因素眾多，不易控制，難以滿足臨床實際檢測的要求，目前只在科研領域進行。
基因晶片(gene chip)，又稱DNA晶片，是近些年在生物高科技領域內出現的最具時代特徵的重大科技進展之一，它將能反映樣本中大量基因信息的基因探針(寡核苷酸探針、cDNA克隆、PCR產物等)有序地固定在固相支持物(如醛基、氨基、巰基、羧基等活性基團修飾的載玻片或矽片、尼龍膜、硝酸纖維素膜)上形成陣列，通過與實際樣本或擴增產物進行雜交反應和對螢光等雜交信號的檢測，只需一次試驗，就可高通量地獲得所有待檢基因的信息。與其他方法相比較，基因晶片的檢測方法有多樣品並行處理能力、分析速度快、所需樣品量少、汙染少、操作簡單、價格低廉等優點。因此利用基因晶片技術檢測與高血壓藥物反應個體差異密切相關的基因突變，是當下最好的選擇，具有重要的現實意義。
目前尚未有對上述抗腫瘤藥物反應相關基因突變位點進行檢測的基因晶片及其技術方案被披露。


發明內容
本發明的目的在於針對目前惡性腫瘤化療藥物使用過程中普遍存在由於藥物反應個體差異所導致的藥物有效性低、毒副反應嚴重的現象，提供一種用於檢測與這些藥物的反應性密切相關的基因突變的基因晶片，本發明的另一目的在於提供一種可方便、快捷、系統地檢測上述基因突變，確定藥物反應性的檢測試劑。本發明的檢測結果可以輔助臨床醫生制定個體化的惡性腫瘤化療方案。
根據本發明的一方面，本發明提供的基因晶片包括固相支持物和有序固定在固相支持物上的寡核苷酸探針。
所述的固相支持物可採用基因晶片領域常用的各種材料，如但不限於經活性基團修飾的玻片或矽片、未修飾的玻片、塑料片、各種纖維膜、尼龍膜等，用於修飾的活性基團如但不限於醛基、氨基、巰基、羧基等，本發明優選醛基化修飾的玻片。
所述固定於固相支持物上的寡核苷酸探針可與抗腫瘤藥物治療反應相關基因片段特異性雜交，從而確定基因突變的類型；所述基因探針和PCR引物均是針對下列任意兩個或多個基因突變位點設計GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
優選的方案是所述基因探針和PCR引物均是針對下列突變位點或位點組合設計的GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)和EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)的組合；EGFR L858R和EGFR L861Q的組合；EGFR缺失突變(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的組合。
更優選的方案是所述基因探針和PCR引物均是針對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q這11個突變位點的組合設計。
本發明所述的寡核苷酸探針序列如表3所示。
表3



表3中，每一突變位點針對未發生突變(野生型)和發生突變(突變型)兩種情況各設計了正反兩條用於合成探針的序列，正向探針序列對應於目標寡核苷酸片段的正義鏈，反向探針序列對應於目標寡核苷酸片段的反義鏈，在實際使用時可選擇上述序列中的任意連續14～25個鹼基作為檢測探針的序列，如果序列中包含基因突變位點(用方框標註)，則選擇的連續14～25個鹼基中必須包含該突變位點。針對每個待檢測的基因突變，實驗人員需根據表3的序列合成至少一條野生型探針和一條突變型探針，正向或反向均可。上述某一個或某幾個或全部的突變位點的檢測探針組成探針組，經合成後固定於固相支持物上。
在上述設計的各探針序列的基礎上，本領域技術人員可通過本領域熟知的方法進行探針合成，並對探針3′端或5′端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來增加雜交容量；以及對其3′端或5′端進行化學基團修飾(比如氨基化修飾)，使探針能通過化學鍵結合在相應的片基上(如醛基化片基)；優選對探針的3′端進行氨基修飾，其相較5′端修飾的探針具有更好的雜交效果。
在上述設計的探針序列的基礎上，為了獲得各個位點準確的雜交信號，必需針對每個位點合成的探針來分別設計相應的陰性質控探針以及陽性質控探針，來控制雜交過程中非特異雜交對信號值的幹擾以及雜交過程的評估，本發明涉及的惡性腫瘤藥物治療相關基因(見表4)的陰性質控探針和陽性質控探針序列如下 表4


表4中，針對每一突變位點設計了正反兩條用於合成陰性質控探針的序列，正向序列對應於目標寡核苷酸片段的正義鏈，反向序列對應於目標寡核苷酸片段的反義鏈，在實際使用時可選擇上述序列中的任意連續14～25個鹼基作為檢測探針的序列，如果序列中包含基因突變位點(用方框標註)，則選擇的連續14～25個鹼基中必須包含該突變位點。
根據表4序列合成的陰性質控探針應當與根據表3序列合成的檢測探針在序列和方向的選擇上保持一致。例如當根據表3序列設計合成UGT1A1*6的野生型檢測探針為5』-gtacatcagagac

gagcatt-3』(正向探針)，突變型檢測探針為5』-gtacatcagagac

gagcatt-3』(正向探針)時，根據表4序列設計合成UGT1A1*6的陰性質控探針為5』-gtacatcagagac

gagcatt-3』(正向探針)；當根據表3序列設計合成UGT1A1*6的野生型檢測探針為5』-gtacatcagagac

gagcatt-3』(正向探針)，突變型檢測探針為5』-gtgtaaaatgctc

gtct-3』(反向探針)時，根據表4序列設計合成的UGT1A1*6的陰性質控探針為兩條，分別為5』-gtacatcagagac

gagcatt-3』(正向探針)和5』-gtgtaaaatgctc

gtct-3』(反向探針)。本發明優選根據表3和表4的序列設計同向的野生型檢測探針、突變型檢測探針和陰性質控探針。
本發明的各基因檢測位點共用一條陽性質控探針，該陽性質控探針根據表4中SEQ IDNO.71設計。
在上述設計的各探針序列的基礎上，本領域技術人員可通過本領域熟知的方法進行探針合成，並對探針3′端或5′端增加間隔臂(如聚胸腺苷酸、聚四乙二醇等)，來增加雜交容量；以及對其3′端或5′端進行化學基團修飾(比如氨基化修飾)，使探針能的通過化學鍵結合在相應的片基上(如醛基化片基)；優選對探針的3′端進行氨基修飾，其相較5′端修飾的探針具有更好的雜交效果。
本發明所涉及的野生型檢測探針、突變型檢測探針、陰性質控探針、陽性質控探針的用途及其設計方法和修飾方法均是本領域一般技術人員所熟知的，詳細技術細節可參閱《基因晶片技術》(李瑤編，化學工業出版社，2004年5月出版)。
根據本發明的另一方面，用於檢測樣本中上述基因突變發生情況的檢測試劑至少包括用於擴增樣本中這些基因的PCR引物以及上述本發明的基因晶片。本發明的PCR引物根據抗腫瘤藥物治療相關基因的序列特點設計，通過PCR反應可擴增一種或幾種突變基因。在本發明中，設計了如下序列用於合成這些PCR引物(表5)。
表5

表5中針對每個待檢測的基因突變設計了F和R兩條序列，在實際使用時，可選擇F序列和R序列上的任意連續17～25個鹼基作為該基因突變位點的F引物(前引物)和R引物(後引物)的序列。在上述設計的各引物序列的基礎上，本領域技術人員可通過本領域熟知的方法進行引物合成。為便於進行結果檢測，可以在上述引物合成時進行適當的標記，所述標記基團包括地高辛分子(DIG)、生物素分子(Bio)、螢光素及其衍生物分子(FITC等)、其他螢光分子(如Cy3、Cy5等)、鹼性磷酸酶(AP)、辣根過氧化物酶(HRP)等，這些標記及其標記方法以及各標記物的檢測方法都已是本領域眾所周知的常規技術。本發明優選利用不對稱PCR技術進行基因擴增，其目的是採用不等量的一對引物產生大量的單鏈DNA，所有探針(包括檢測探針和陰性質控探針)均是針對該單鏈DNA設計合成，同時對非限制性引物(高濃度引物)進行標記，本發明優選對對非限制性引物(高濃度引物)進行5′端的Cy5標記，使得合成的單鏈PCR產物的5′端帶有螢光標記，以便在後繼的掃描過程中讀取結果。
本發明的探針和引物可以針對一個基因突變進行檢測，也可以組合使用檢測多個基因突變。例如以SEQ ID NO.9-16所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQ ID NO.76-79所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於檢測與抗癌藥依立替康的反應性密切相關的UGT1A1*6和UGT1A1*28兩種基因突變，確定患者對依立替康的個體反應性；以SEQ ID NO.25-48所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQ ID NO.84-89所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於檢測與吉非替尼和埃羅替尼的藥物反應性密切相關的EGFR缺失突變、EGFR L858R和EGFR L861Q三種基因突變，確定患者對吉非替尼和埃羅替尼的個體反應性；較為優選的實施方案為，以SEQ ID NO.1-48所示的序列作為探針序列製備基因晶片，以SEQ ID NO.72-89所示的序列作為擴增樣本的引物序列，這樣組成的檢測試劑，可用於檢測與多種抗腫瘤藥物反應性密切相關的基因突變，確定患者對大部分常用化療藥物的個體反應性。
本發明的基因晶片可以根據點樣區域的數目分為1人份、2人份和多人份不等，本發明根據實際應用的需要優選2人份的設計方案，即在基片上設置2個點樣區域，分別點上所需的探針，一次可檢測2份生物樣品。
根據本發明的另一方面，提供一種用於系統檢測樣本中抗腫瘤藥物治療相關基因突變的試劑盒，其至少包括本發明的上述檢測試劑，本發明的試劑盒還可進一步包含下述試劑中的一種或幾種樣本處理類試劑；(2)PCR擴增類試劑(3)雜交類試劑(4)顯色類試劑。
上述樣本處理類試劑、PCR擴增類試劑、雜交類試劑、顯色類試劑均可使用本領域技術人員所熟知的在這些操作過程中需使用的各種具體試劑，這些試劑必要時可以包括在試劑盒中，也可以將其配方列明在試劑盒的說明書中由使用者按照說明書中的提示自行配製。
本發明的試劑盒還可包括相應的陰性對照和/或陽性對照樣本。
在本發明試劑盒的操作方法為1.將標記後的待測產物與固定在晶片上的探針進行雜交，其雜交原理與普通核酸雜交相同。雜交條件與探針和標記後的待測PCR產物的長度、GC含量、鹽濃度、甲醯胺等有關，我們通過嚴謹的實驗設計逐一確定最適合的各組分條件。優選的是在本發明的試劑盒體系中43℃孵育2小時後可獲得具有良好特異性和靈敏度的雜交結果。2.利用不同的洗脫條件，例如溫度、鹽濃度等最大限度地去除非特異性雜交。3.對樣本檢測結果進行評估通過樣本中惡性腫瘤藥物治療相關基因的突變發生情況評估樣本提供者對抗腫瘤藥物的反應性。詳細操作過程見實施例。
本發明的優點是 1.本發明全面、系統、高通量地檢測已知的與抗腫瘤藥物反應個體差異密切相關的基因突變，並可針對不同藥物制定出相應的調整方案。
2.準確、靈敏、特異性地對上述基因突變進行檢測。
3.操作簡便快捷，對樣品的需要量少，人力投入少，大大降低人為誤差，可避免不同實驗人員操作帶來的結果差異。
5.與PCR-RFLP和測序法相比較，本發明汙染輕、成本較低。
6.可同時檢測多份生物樣本，多個基因突變。



圖1惡性腫瘤藥物治療相關基因檢測晶片平面圖； 圖2晶片A(野生型探針I+突變型探針I)掃描圖； 圖3晶片B(野生型探針II+突變型探針II)掃描圖； 圖4晶片C(野生型探針III+突變型探針III)掃描圖； 圖5惡性腫瘤藥物治療相關基因檢測晶片掃描圖； 圖6惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變晶片檢測系統的製備流程圖。

具體實施例方式 實施例1惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變晶片檢測系統的製備 1.製備用的主要原輔材料及儀器設備(如表5所示) 表5 2.製備流程 見附圖6。
3.詳細製備過程 3.1.基片處理基片採用玻璃介質，表面處理方式採用醛基化修飾。具體步驟為 1、空白超平片的選擇選用76mm×25mm×1mm超平片，其長寬誤差不超過0.2mm，厚度誤差不超過0.1mm，無破損、表面無劃痕； 2、超平片預處理將超平片浸於新配的重鉻酸鉀洗液中，放置7天後，用去離子水清洗，晾乾； 3、超平片氨基化配製氨基矽烷的乙醇溶液，濃度分別為2％，將玻片浸入上述溶液中分別作用15分鐘，取出用去離子水洗淨，晾乾； 4、超平片醛基化將上述氨基化處理的超平片分別浸入5％的戊二醛PBS(0.2mol/lM，pH8.0)溶液中，分別作用30分鐘，PBS溶液清洗晾乾； 3.2.探針製備探針序列設計如SEQ ID 1～48所示，按照本領域技術人員熟知的方法合成。
(1)在DNA合成儀上合成所需序列的寡核苷酸(包括5』端的10～15個鹼基的polyT)； (2)在DNA序列合成儀上，將寡核苷酸poly(T)分子臂引入活潑的脂族氨基臂。
(3)以HPLC純化5』端氨基修飾的寡核苷酸，離心乾燥後，溶於100mmol/LNa2CO3/NaHCO3溶液(PH9.0)，濃度為2mmol/L。
3.3.基因晶片的製備 按圖所示的惡性腫瘤個體化用藥相關基因檢測晶片平面結構圖，在一塊玻璃介質的基片上劃分為兩個基因探針點樣區域，每個點樣區域的面積為7mm*7mm，在每個點樣區域內的陣列式分布的基因探針第1行為位點GSTP1*B的野生型和突變型探針，第2行為位點GSTP1*B的陰性質控探針和陽性質控探針；第3行為位點MTHFR 677C＞T的野生型和突變型探針，第4行為位點MTHFR 677C＞T的陰性質控探針和陽性質控探針；第5行為位點UGT1A1*6的野生型和突變型探針，第6行為位點UGT1A1*6的陰性質控探針和陽性質控探針；第7行為位點UGT1A1*28的野生型和突變型探針，第8行為位點UGT1A1*28的陰性質控探針和陽性質控探針；第9行為位點CAD*3的野生型和突變型探針，第10行為位點CAD*3的陰性質控探針和陽性質控探針；第11行為位點TPMT*3C的野生型和突變型探針，第12行為位點TPMT*3C的陰性質控探針和陽性質控探針；第13行為針對EGFR缺失突變的野生型和Del_L747-P753ins S突變型探針，第14行為針對EGFR缺失突變的Del_L747-T751 ins S突變型和Del_E746-A750 ins S突變型探針，第15行為針對EGFR缺失突變的陰性質控探針和陽性質控探針；第16行為位點EGFR L858R的野生型和突變型探針，第17行為位點EGFR L858R的陰性質控探針和陽性質控探針；第18行為位點EGFR L861Q的野生型和突變型探針，第19行為位點EGFR L861Q的陰性質控探針和陽性質控探針。
各檢測位點的探針(包括野生型探針和突變型探針)序列及參照探針(包括陽性參照探針和陰性參照探針)序列如下


3.4.點樣與點樣後處理 (1)探針溶液各取2μl，用點樣儀按上述格式列印到處理過的基片上； (2)室溫乾燥放置18小時； (3)室溫乾燥後立即使用或貯存於4℃備用。
3.5.惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變晶片檢測系統的組成 檢測系統主要由寡核苷酸晶片、雜交液、洗滌母液、各檢測基因位點的PCR反應液(包括引物、dNTP、buffer等)、生物酶和陽性參照DNA標本等組分構成，寡核苷酸晶片4℃冷藏保存，其他組分於-20℃冷凍保存，其中PCR反應液需避光。各檢測基因位點PCR反應液中的引物根據SEQ ID NO.72-89所示的序列設計。
實施例2用實施例1中的晶片檢測系統對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變、EGFR L858R、EGFR L861Q九種惡性腫瘤藥物治療相關基因突變進行檢測。
1.具體試劑和所用儀器 晶片檢測系統的組成(表6)

PCR反應液1～9為實施例1中分別按照SEQ ID NO.72～73、SEQ ID NO.74～75、SEQID NO.76～77、SEQ ID NO.78～79、SEQ ID NO.80～81、SEQ ID NO.82～83、SEQ IDNO.84～85、SEQ ID NO.86～87、SEQ ID NO.88～89序列設計的PCR引物。
其他儀器及試劑
PCR儀、電泳儀、雜交儀、雷射共聚焦晶片掃描儀(具有635nm波長的通道)、紫外分光光度計、Promega DNA抽提試劑盒。
2.具體檢測過程如下 臨床樣本的處理
採集待檢測個體的外周靜脈血2ml，使用Promega DNA抽提試劑盒抽提DNA，也可用自配的DNA抽提試劑進行抽提，兩種方法均為本領域技術人員所公知。DNA濃度應大於200ng/ul，用紫外分光光度計檢測A260/A280比值，此比值應介於1.60～1.80之間。
PCR擴增
在0.2mL的Eppendorf管中加入PCR反應液18.8μl，模板DNA 0.8μl，及酶10.2μl，酶20.2ul，構成20.0μl反應體系(利用PCR反應液1～9共配成A、B、C、D、E、F、G、H、I共9管反應體系)。PCR擴增程序為 37℃600秒 95℃240秒
70℃120秒 注意上述成分充分混勻，最後加入Taq酶並混勻，但不可劇烈振蕩；放置PCR管於PCR儀上。
用PCR方法擴增染色體基因特定片段的方法已經是本領域的公知技術，其中的關鍵在於引物設計，利用本發明公布的引物序列，本領域的技術人員可根據經驗或有關文獻確定反應體系和擴增程序，獨立完成該操作步驟。
雜交
取經43℃預熱的雜交液7.5μl，加(A)(B)(C)(D)(E)(F)(G)(H)(I)PCR產物各3μl，然後加入陽參1μl，混勻，吸取20μl混合液，轉移到晶片的點樣區域；將晶片放入雜交艙，密封雜交艙，然後放進43℃水浴保溫2小時。
本發明擴增產物與基因晶片之間的雜交按照本領域的經典方法進行，本領域一般技術人員依照經驗可以確定有關緩衝液、樣品濃度、預雜交溫度、雜交溫度以及時間等的最適條件。
洗片
打開雜交艙，取出晶片，用洗滌液1漂洗30秒，再置於去離子水中於室溫洗滌30秒，取出，在離心機上瞬時離心30秒，甩去晶片上殘留液體。
掃描分析
(1)將乾燥後的晶片立即用GenePix4100A掃描儀掃描，PMT設置為600，雷射波長為635nm； (2)掃描圖像用掃描儀自帶的圖像分析軟體GenePix 6.0對掃描結果進行定量分析，並保存分析結果； (3)利用與晶片檢測系統配套的結果分析軟體進行結果分析與整理。
(4)列印檢測報告單。
3.對檢測結果的分析過程如下 通過晶片掃描儀得到的掃描圖譜為一矩陣圖譜，自第1行至第19行，由上至下即檢測GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變、EGFR L858R、EGFR L861Q位點的基因型。探針分布情況如下表(表8)所示 對標本進行檢測，當某一位點只有野生型探針出現信號時該位點為野生型，只有突變型探針出現信號時該位點為突變型，當同時出現信號時為雜合子。
根據檢測出的基因型，參照表1的內容提出用藥調整意見。
實施例3不同鹼基數的探針雜交效果比較 在本發明中，對於SEQ ID NO.1-48中所示序列的探針實際使用時可以選擇連續14-25個鹼基序列來合成探針，以下實驗旨在證明上述鹼基數的差異並不影響結果的靈敏度和特異性。
針對GSTP1*B合成以下不同長度的突變及正常探針 野生型探針I(SEQ ID NO.1第13～26位鹼基序列，共14個鹼基) 5』-gggaga

gtatttg-3』 突變型探針I(SEQ IDNO.3第13～26位鹼基序列，共14個鹼基) 5』-gggaga

gtatttg-3』 野生型探針II(SEQ ID NO.1第12～30位鹼基序列，共19個鹼基) 5』-tgagggaga

gtatttgca-3』 突變型探針II(SEQ IDNO.3第12～30位鹼基序列，共19個鹼基) 5』-tgagggaga

gtatttgca-3』 野生型探針III(SEQ ID NO.1第10～32位鹼基序列，共23個鹼基) 5』-gat gagggaga

gtatttgcagc-3』 突變型探針III(SEQ ID NO.3第10～32位鹼基序列，共23個鹼基) 5』-gatgagggaga

gtatttgcagc-3』 以上述序列合成的探針按照實施例1的方法製備晶片A、B和C，按照實施例1的方法擴增CYP2C9*3野生型和突變型質粒，分別與晶片A、B和C雜交，結果顯示見圖2、3、4。
由上圖可見，不同長度的探針均取得了較好的雜交結果，由此證明不同鹼基數的探針均具有良好的靈敏度和特異性。
以上對本發明的描述並不限制本發明，本領域的技術人員可以根據本發明做出各種改變和調整，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求的範圍。實施例4陰性質控探針和陽性質控探針設計方案 在本發明中，對於SEQ ID NO.49-71中所示序列的探針實際使用時可以選擇連續14-25個鹼基序列來合成各個位點的陰性質控探針，選用SEQ ID NO.81作為陽性質控探針。以下實驗旨在證明選用上述序列作為陰性質控探針和陽性質控探針可以確實起到控制雜交過程的作用。
針對GSTP1*B設計野生、突變以及陰性質控探針，序列如下
將上述4個序列點制在同一晶片上，分別擴增GSTP1*B野生和突變的質粒，將產物以及與陽性質控探針互補的陽性參照和晶片進行雜交，雜交掃描圖如圖5所示。
從雜交掃描圖中我們可以看出，無論使用野生質粒或者突變質粒擴增產物，陰性質控探針都沒有雜交信號，而陽性質控探針信號穩定而且特異的信號，說明本發明中的陰性質控探針以及陽性質控探針可以確實起到控制雜交過程的作用。
以上對本發明的描述並不限制本發明，本領域的技術人員可以根據本發明做出各種改變和調整，只要不脫離本發明的精神，均應屬於本發明所附權利要求的範圍。
序列表
中南大學
一種基於等位基因特異性擴增的雙探針基因突變檢測方法及其專用晶片和試劑盒
151
PatentIn version 3.5
1
30
DNA
人工序列
1
atgctgtggt gcacgaggtc cagagataca30
2
30
DNA
人工序列
2
atggggcagg ctggtgggga gaaggtcaag30
3
30
DNA
人工序列
3
ctaaagtcca ggaagagatt gaacgtgtca30
4
30
DNA
人工序列
4
ctgcatgcag gggctccggt ttctgccaac30
5
30
DNA
人工序列
5
gtgaaggaag ccctgattga tcttggagag30
6
30
DNA
人工序列
6
agtgggaaat ggcctcttcc agaaaactcg30
7
30
DNA
人工序列
7
tgaaaacatc aggattgtaa gcaccccctg30
8
30
DNA
人工序列
8
gaagcaaaaa acttggcctt acctggatct30
9
30
DNA
人工序列
9
ggaatctggg tcatacatgt ggatatatgt30
10
30
DNA
人工序列
10
ctattccacg aagcatatta cccatgaacg30
11
30
DNA
人工序列
11
agtgatgagt ggtgttcgca ggtgtgtgcc30
12
30
DNA
人工序列
12
tttgtgataa cagccaccga ggggactcca30
13
30
DNA
人工序列
13
cccttcattt gcagacctgt tccgcacgcc30
14
30
DNA
人工序列
14
tcaggatgaa ggtgcgcttc ctcaggcgca 30
15
30
DNA
人工序列
15
accgcgtggg ccgcatctac cccatggcca30
16
30
DNA
人工序列
16
gcaggctgcc cccgccaaca aatttgacac30
17
30
DNA
人工序列
17
ctcactggag gtggttgcag ttcacagttg30
18
30
DNA
人工序列
18
atagagcaag aagaagaagt tgggcagaga30
19
30
DNA
人工序列
19
agatgggcag actgggccct gcacctcccg30
20
30
DNA
人工序列
20
ccgggtaggc ctgcaaatgc tagcagccct30
21
30
DNA
人工序列
21
ccatggttga cacagagatg ccattctggc30
22
30
DNA
人工序列
22
atccacggag ctgatcccaa agttggtggc30
23
30
DNA
人工序列
24
gctgttctac tgctattagc tctgcccggt30
23
30
DNA
人工序列
24
ggcccttgag tcgtggtttc ctggtcatgc30
25
30
DNA
人工序列
25
cctcctacac tgatataaac tatatgaagg30
26
30
DNA
人工序列
26
tgtgtctagg ccttagttaa taatgaatga30
27
30
DNA
人工序列
27
tgctgacacg cctggcagag gaccctgccg30
28
30
DNA
人工序列
28
cctccgctgg cgggcacggt acctgggctt 30
29
30
DNA
人工序列
29
gagctgccca ggaatatcca ggcaagaatg 30
30
30
DNA
人工序列
30
agaggcctga gtaattatca gaatatggta 30
31
11
DNA
人工序列
31
gcgggcggcg c 11
32
41
DNA
人工序列
32
gctggtgggg agaaggtcaa tgtatctctg gacctcgtgc a41
33
41
DNA
人工序列
33
tgcacgaggt ccagagatac cttgaccttc tccccaccag c41
34
41
DNA
人工序列
34
ggggctccgg tttctgccaa tgacacgttc aatctcttcc t41
35
41
DNA
人工序列
35
aggaagagat tgaacgtgtc gttggcagaa accggagccc c41
36
41
DNA
人工序列
36
tggcctcttc cagaaaactc ctctccaaga tcaatcaggg c41
37
41
DNA
人工序列
37
gccctgattg atcttggaga cgagttttct ggaagaggcc a41
38
41
DNA
人工序列
38
aacttggcct tacctggatc cagggggtgc ttacaatcct g41
39
41
DNA
人工序列
39
caggattgta agcaccccctagatccaggt aaggccaagt t41
40
41
DNA
人工序列
40
gaagcatatt acccatgaac acatatatcc acatgtatga c41
41
41
DNA
人工序列
41
gtcatacatg tggatatatg cgttcatggg taatatgctt c41
42
41
DNA
人工序列
42
acagccaccg aggggactcc ggcacacacc tgcgaacacc a41
43
41
DNA
人工序列
43
tggtgttcgc aggtgtgtgc tggagtcccc tcggtggctg t41
44
41
DNA
人工序列
44
aggtgcgctt cctcaggcgc ggcgtgcgga acaggtctgc a41
45
41
DNA
人工序列
45
tgcagacctg ttccgcacgc tgcgcctgag gaagcgcacc t41
46
41
DNA
人工序列
46
ccccgccaac aaatttgaca tggccatggg gtagatgcgg c41
47
41
DNA
人工序列
47
gccgcatcta ccccatggcc gtgtcaaatt tgttggcggg g41
48
41
DNA
人工序列
48
gaagaagaag ttgggcagag caactgtgaa ctgcaaccac c41
49
41
DNA
人工序列
49
ggtggttgca gttcacagtt tctctgccca acttcttctt c41
50
41
DNA
人工序列
50
cctgcaaatg ctagcagccc cgggaggtgc agggcccagt c 41
51
41
DNA
人工序列
51
gactgggccc tgcacctccc agggctgcta gcatttgcag g 41
52
41
DNA
人工序列
52
gctgatccca aagttggtgg gccagaatgg catctctgtg t 41
53
41
DNA
人工序列
53
acacagagat gccattctgg gccaccaact ttgggatcag c 41
54
41
DNA
人工序列
54
gtcgtggttt cctggtcatg accgggcaga gctaatagca g 41
55
41
DNA
人工序列
55
ctgctattag ctctgcccgg gcatgaccag gaaaccacga c41
56
41
DNA
人工序列
56
gccttagtta ataatgaatg ccttcatata gtttatatca g41
57
41
DNA
人工序列
57
ctgatataaa ctatatgaag tcattcatta ttaactaagg c41
58
41
DNA
人工序列
58
gcgggcacgg tacctgggct cggcagggtc ctctgccagg c41
59
41
DNA
人工序列
59
gcctggcaga ggaccctgcc aagcccaggt accgtgcccg c41
60
41
DNA
人工序列
60
agtaattatc agaatatggt cattcttgcc tggatattcc t41
61
41
DNA
人工序列
61
aggaatatcc aggcaagaat taccatattc tgataattac t41
62
60
DNA
人工序列
62
ctcacattag gaaacatttc ttgcatagtt ttataaggct ggcataatct taatatcaaa60
63
50
DNA
人工序列
63
tatcagctaa agtccaggaa gagattgaac gtgtgattgg cagaaaccgg 50
64
60
DNA
人工序列
64
cagtgtactg ttcacagaaa ttccaatgaa tctagagata aattatgaat agtgattagt60
65
50
DNA
人工序列
65
ttatcatcaa ttgtcatatt ctttgtctct tcttacagtt ttcgtcttga 50
66
50
DNA
人工序列
66
agacaatttg acttcctctc atcctatttc aataccattt atttctttct 50
67
53
DNA
人工序列
67
gcctgtgtga ctgaataaaa gcatacaaat acaatgaaaa tatgaatcta agt 53
68
50
DNA
人工序列
68
agtaaacaca aaactagtca atgaatcaca aatacgcaag cagtcacata 50
69
50
DNA
人工序列
69
gttaattcga gattaatgta aaagtgatgt gttgatttta tgcatgccaa 50
70
50
DNA
人工序列
70
atcaaaagga ggaatatagg gaatacagtg gggttggagg taaggtgatg 50
71
68
DNA
人工序列
71
gcagcataag aatggactaa tacaccatat tgtcaaagtt tgcaaagtga atataaatta60
cttgtact 68
72
50
DNA
人工序列
72
ccagaaccca gccccagatt cagtgatgtg agatacccct tcctagattt 50
73
50
DNA
人工序列
73
agtctttgag ttgtaccctc ctcgtcccat ttgaaatcct ggtgtcatcg 50
74
50
DNA
人工序列
74
ttgctttatg agctgtgtca ccttgaggaa gttaactaac ctctctgggg 50
75
50
DNA
人工序列
75
gtgaaatcta ggaaggggta tctcacatca ctgaatctgg ggctgggttc 50
76
51
DNA
人工序列
76
tggactgtaa aactttgaat aatgacaccc agcttataga tcaacattag a51
77
50
DNA
人工序列
77
ttgctctagg gcattctaaa cccagtgatt catgctcttt ctccatctgc50
78
50
DNA
人工序列
78
tgattgattg gtatggtctg tctggagtgt catgttggcc ttatctgtga50
79
50
DNA
人工序列
79
cctattcctt agtagccaga gttacagtta agttccatat actataagag50
80
50
DNA
人工序列
80
tgcttctgga aactgatgct ggcataggcg cttaaatcct cacttgagcg50
81
50
DNA
人工序列
81
atgcaggtgg atgactctgt ggtggcccag aacatgcacg agaccatcct50
82
50
DNA
人工序列
82
gtcatacttg taatctgcaa ccactggatc tgttcttgtg aatggaatgt50
83
50
DNA
人工序列
83
tatcacaaaa cagcctagac agcactaata aggtggttat gttcttttct50
84
50
DNA
人工序列
84
ctgtgatgaa agaggccaga aacattctta cctggatctc ctttctcacc50
85
50
DNA
人工序列
85
tgggaaaatt agaggagtgt catctgtgca atcactgaat tcataatctt50
86
50
DNA
人工序列
86
gaatcagaat atgaatgtac tgggaatagg gatgagggtg aagatgggaa50
87
50
DNA
人工序列
87
agagattaga caggggagga ggggcagcta aagatggctc aggcaaacaa50
88
50
DNA
人工序列
88
gttctgcacg atgaggatca ggatggccag tgggcactcc tcagtcacca50
89
50
DNA
人工序列
89
gaagtgaagt gggacccagg tggaggtaag gaagagtctg gtggggagtt50
90
50
DNA
人工序列
90
tgggatgggc tgatgggttg aatgtggggt atgaaagaaa agagcaatcg50
91
50
DNA
人工序列
91
catttgatga ttgttttgtt aatggcttgc aggtcagatt ttcatctttt50
92
18
DNA
人工序列
92
aggtcaatgt atctctgg 18
93
18
DNA
人工序列
93
gagatacctt gaccttct 18
94
17
DNA
人工序列
94
ctgccaatga cacgttc 17
95
17
DNA
人工序列
95
acgtgtcgtt ggcagaa 17
96
21
DNA
人工序列
96
cagaaaactc ctctccaaga t21
97
21
DNA
人工序列
97
atcttggaga cgagttttct g21
98
21
DNA
人工序列
98
ttacctggat ccagggggtg c21
99
13
DNA
人工序列
99
caccccctag atc 13
100
13
DNA
人工序列
100
ccatgaacac ata 13
101
14
DNA
人工序列
101
tatatgcgtt catg 14
102
14
DNA
人工序列
102
gactccggca caca 14
103
16
DNA
人工序列
103
aggtgtgtgc tggagt16
104
16
DNA
人工序列
104
caggcgcggc gtgcgg16
105
16
DNA
人工序列
105
cgcacgctgc gcctga16
106
16
DNA
人工序列
106
atttgacatg gccatg16
107
16
DNA
人工序列
107
ccatggccgt gtcaaa16
108
15
DNA
人工序列
108
tgggcagagc aactg 15
109
15
DNA
人工序列
109
ttcacagttt ctctg 15
110
13
DNA
人工序列
110
gcagccccgg gag 13
111
13
DNA
人工序列
111
acctcccagg gct 13
112
15
DNA
人工序列
112
tggtgggcca gaatg15
113
15
DNA
人工序列
113
ttctgggcca ccaac15
114
15
DNA
人工序列
114
tggtcatgac cgggc15
115
15
DNA
人工序列
115
ctgcccgggc atgac 15
116
16
DNA
人工序列
116
taatgaatgc cttcat 16
117
16
DNA
人工序列
117
tatatgaagt cattca 16
118
14
DNA
人工序列
118
ctgggctcgg cagg 14
119
14
DNA
人工序列
119
ccctgccaag ccca 14
120
17
DNA
人工序列
120
aatatggtca ttcttgc17
121
17
DNA
人工序列
121
gcaagaatta ccatatt17
122
20
DNA
人工序列
122
gcacgaggtc cagagattca 20
123
24
DNA
人工序列
123
caggctggtg gggagaaggt ctag24
124
23
DNA
人工序列
124
ccaggaagag attgaacgtg cca 23
125
23
DNA
人工序列
125
caggggctcc ggtttctgcc tac 23
126
22
DNA
人工序列
126
agccctgatt gatcttggac ag 22
127
22
DNA
人工序列
127
atggcctctt ccagaaaaca cg 22
128
21
DNA
人工序列
128
caggattgta agcaccccat g 21
129
20
DNA
人工序列
129
acttggcctt acctggacct 20
130
24
DNA
人工序列
130
tgggtcatac atgtggatat aagt24
131
23
DNA
人工序列
131
acgaagcata ttacccatga tcg 23
132
21
DNA
人工序列
132
tggtgttcgc aggtgtgtac c 21
133
24
DNA
人工序列
133
ataacagcca ccgaggggac ttca24
134
24
DNA
人工序列
134
atttgcagac ctgttccgca cacc24
135
24
DNA
人工序列
135
tgaaggtgcg cttcctcagg ctca24
136
24
DNA
人工序列
136
tgggccgcat ctaccccatg gaca24
137
24
DNA
人工序列
137
tgcccccgcc aacaaatttg atac 24
138
25
DNA
人工序列
138
tggaggtggt tgcagttcac agatg25
139
22
DNA
人工序列
139
agaagaagaa gttgggcagt ga 22
140
22
DNA
人工序列
140
agactgggcc ctgcacctct cg 22
141
21
DNA
人工序列
141
taggcctgca aatgctagca gcact25
142
21
DNA
人工序列
142
ttgacacaga gatgccattc tcgc 24
143
26
DNA
人工序列
143
acggagctga tcccaaagtt ggttgc 26
144
25
DNA
人工序列
144
tctactgcta ttagctctgc ccagt 25
145
25
DNA
人工序列
145
ttgagtcgtg gtttcctggt cacgc 25
146
22
DNA
人工序列
146
actgatataa actatatgat gg 22
147
24
DNA
人工序列
147
taggccttag ttaataatga ttga24
148
23
DNA
人工序列
148
acgcctggca gaggaccctg acg 23
149
23
DNA
人工序列
149
tggcgggcac ggtacctggg ttt 23
150
26
DNA
人工序列
150
tgcccaggaa tatccaggca agactg26
151
23
DNA
人工序列
151
tgagtaatta tcagaatatg tta 2權利要求
1.一種用於檢測惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變的基因晶片，包括固相支持物、有序固定在固相支持物上的基因探針和用於擴增樣本中突變基因片段的PCR引物，基因探針包括檢測不同基因位點突變的野生型檢測探針、突變型檢測探針、陰性質控探針及陽性質控探針，其特徵在於其中所述基因探針和PCR引物均是針對下列任意兩個或多個基因突變位點設計GSTP1*B、MTHFR677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(DelL747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(DelE746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q。
2.根據權利要求1所述的用於檢測惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變的基因晶片，其特徵在於所述基因探針和PCR引物均是針對下列突變位點或位點組合設計的GSTP1*B；MTHFR 677C＞T；CAD*3；TPMT*3C；UGT1A1*6和UGT1A1*28的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)和EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)的組合；EGFR L858R和EGFR L861Q的組合；EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R和EGFR L861Q的組合。
3.根據權利要求1所述的用於檢測惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變的基因晶片，其特徵在於所述基因探針和PCR引物均是針對GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(Del L747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFR L861Q這11個突變位點的組合設計。
4.根據權利要求1、2或3所述的用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片，其特徵在於所述檢測不同突變位點的寡核苷酸探針序列，包括正向野生型探針、正向突變型探針、反向野生型探針、反向突變型探針，由序列SEQ ID NO.1-48中的任意連續14～25個鹼基組成，序列中包含基因突變位點時，選擇的連續14～25個鹼基中必須包含該突變位點。
5.根據權利要求1、2或3所述的用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片，其特徵在於所述檢測不同突變位點的陰性參照探針序列，包括正向陰性參照探針和反向陰性參照探針，由序列SEQ ID NO.49-70中的任意連續14～25個鹼基組成，序列中包含基因突變位點時，選擇的連續14～25個鹼基中必須包含該突變位點。
6.根據權利要求1、2或3所述的用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片，其特徵在於，所述固定於固相支持物上的陽性質控探針序列為SEQID NO.71。
7.根據權利要求1、2或3所述的用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片，其特徵在於，所述用於擴增樣本中突變基因片段的PCR引物序列由序列SEQ ID NO.72-89中的任意連續17～25個鹼基組成。
8.權利要求1至7之一所述的用於惡性腫瘤個體化用藥相關基因突變檢測的基因晶片，可應用於檢測GSTP1*B、MTHFR 677C＞T、UGT1A1*6、UGT1A1*28、CAD*3、TPMT*3C、EGFR缺失突變(Del L747-P753insS)、EGFR缺失突變(DelL747-T751insS)、EGFR缺失突變(Del E746-A750insS)、EGFR L858R、EGFRL861Q這11個基因突變。
全文摘要
本發明涉及基因分析檢測產品，具體地說是涉及一種基因檢測晶片及其配套的試劑，更具體地說是用於檢測與惡性腫瘤治療藥物反應性密切相關的一系列基因突變的基因檢測晶片和配套的試劑及其應用。本發明通過選擇合適的突變位點以及設計合適的引物和探針，全面、系統、高通量地檢測已知的與抗腫瘤藥物反應個體差異密切相關的基因突變，並可針對不同藥物制定出相應的調整方案。
文檔編號C12Q1/68GK101619350SQ200910042599
公開日2010年1月6日 申請日期2009年1月23日 優先權日2009年1月23日
發明者周宏灝 申請人:周宏灝