用於檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基的製作方法

2023-05-27 13:41:31 1

專利名稱：用於檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基的製作方法
用於檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基本發明涉及用於軍團菌的反應培養基，還涉及此培養基的用途以及使用這種培養基的方法。軍團菌(Legionella sp)是水生環境(自然生態系統和水分配網)的細菌，能夠在人類中引起感染，有時是致死的感染。在人類中已經證實了軍團菌屬的數個種，但最重要的是嗜肺軍團菌(L. pneumophila)，其是大約90%軍團菌病病例的成因。其他種，諸如約旦軍團菌(L. jordanis)，通常從免疫抑制個體中分離。軍團菌病(或軍團病(legionnaire' s disease))是呼吸疾病，其特徵為嚴重急性肺病，其感染是通過吸入受軍團菌汙染的氣懸體而獲得，例如冷卻塔、空調系統，保健水療(health spas)、淋浴等。在2到10天的潛伏期後，患者表現出流感樣症候群。這之後是高燒、胸膜炎(pleuresy)和嚴重的咳嗽，伴有胃腸問題(腹瀉、嘔吐)或甚至有時是神經學上的問題(譫妄、嗜睡、精神錯亂)。在2005年， 法國報導了超過1500個病例，而歐洲報導了大約5700個病例；在美國，⑶〔(Centers for Disease Control and Prevention)估計每年有8000到18，000個軍團菌病的病例。軍團菌病的診斷非常複雜，因為該疾病是非典型的標準的肺病，其沒有任何特別。平均起來病例的死亡率是20%，在社區病例中較低，但另一方面，在醫院病例中很高。 早期診斷是非常重要的，以便為患者提供合適的治療。可以根據下列方法進行診斷-通過直接免疫螢光法的鑑定。用抗主要嗜肺軍團菌血清組(serogroup)的抗體在樣品上進行，此方法能夠證實可溶性抗原。主要使用的方法是ELISA(酶聯免疫吸附測定)、RIA (放射免疫學測定)或ICM(膜上的免疫色譜法)。這些技術的主要缺點是它們只能檢測某些嗜肺軍團菌血清組的可能存在；-通過間接免疫螢光法對於抗LPS0抗原的抗體的血清學診斷。此方法只能鑑定嗜肺軍團菌血清組1，並且有很多假陽性的風險，這是由於和分枝桿菌(myccAacteria)、 鉤端螺旋體(1印tospira)、衣原體(Chlamydia)、支原體(Mycoplasma)、假單胞菌 (Pseudomonas)、黃桿菌(Flavobacterium)等的交叉反應；-通過培養法的細菌學鑑定。培養軍團菌是很難的。這是因為它們不在血液瓊脂上生長，必須嚴格控制pH(6. 9+/-0. 2)，並且必需滿足細菌的要求。因此，培養通常在添加了 ACES緩衝液、L-半胱氨酸和鐵(後兩種成分是必需生長因子)的BCYE (Buffered Charcoal Yeast Extract)瓊脂，或者GVPC瓊脂上生長。可在37°C溫育48小時後觀察到菌落。軍團菌的鑑定可以在GVPC軍團菌培養基(bioM6rieUX)上進行，其是促進大部分軍團菌種(尤其是嗜肺軍團菌)的分離的特異性和選擇性培養基。依靠經優化的3種抗生素的混合物， 此培養基能夠抑制革蘭氏陽性菌、大部分革蘭氏陰性菌、酵母和黴菌的生長。但是，現有的培養基含有活性碳，以便吸附軍團菌產生的有毒化合物、或培養基中存在的有毒化合物(酵母提取物，瓊脂，等等)、或通過培養基的高壓滅菌(其造成自由基的形成，這對軍團菌也是有毒的)產生的有毒化合物。這些培養基因此是黑色的，這使它們不適合摻入生色或螢光酶底物，而這類底物能夠促進培養基的解讀。本發明目的是通過提供新的用於軍團菌屬細菌的反應培養基以解決現有技術中的問題。出人意料的，本發明人證明矽質化合物在反應培養基中的使用允許快速和方便的檢測軍團菌。在介紹本發明之前，給出下列定義以便更好的理解本發明。它們決不是為了進行限制。術語反應培養基旨在表示包含代謝的表汰和/或微生物(諸如軍團菌)的生長必需的所有成分的培養基。反應培養基可以是固體、半固體或液體。術語「固體培養基」旨在表示，例如膠凝的(gelled)培養基。瓊脂是微生物學中用於培養微生物的常規膠凝劑，但有可能使用結冷膠(gelrite)、明膠、瓊脂糖或其他天然或人工的膠凝劑。本發明的反應培養基必須允許軍團菌的生長。反應培養基可以包括組合在一起的一種或多種成分，諸如胺基酸、碳水化合物、核苷酸、礦物質、維生素等。培養基還可以包含著色劑。為了說明著色劑，可以提及的包括伊文思藍、中性紅、 遮光劑如二氧化鈦、硝基苯胺、孔雀綠、亮綠、一種或多種代謝指示劑、一種或更多種代謝調節劑，等等。反應培養基可以是培養培養基、顯示培養基(revealing medium)或培養和顯示培養基。就顯示培養基來說，在接種前培養微生物，就培養和顯示培養基來說，顯示培養基也構成培養培養基。本領域技術人員還可以使用雙板(biplate)，使得可以方便地比較兩種培養基 (包括各種底物或各種選擇性混合物)，其上將已存有相同的生物樣品。術語詵擇件混合物旨在表示允許詵擇件培養特定微牛物的化合物的混合物。在本發明的背景下，選擇性混合物可允許軍團菌的選擇性培養。這類培養基特別包括下列化合物甘氨酸、硫酸多粘菌素B、萬古黴素或頭孢羥唑，放線菌酮或茴香黴素或遊黴素，單獨或組合的。選擇性培養基還允許一些軍團菌種(例如嗜肺軍團菌)的選擇性培養。在這種情況下，選擇性混合物特別包括下列化合物甘氨酸，硫酸多粘菌素B，萬古黴素或頭孢孟多、 放線菌酮、茴香黴素、納他黴素，溴甲酚紫、溴百裡酚藍，單獨或組合的。術語矽質化合物旨在表示仵何包含元素矽的化合物。按照非限制性的方式，可以提及的有天然或合成的沸石、粘土、優選伊利石、蒙脫石及優選海泡石，或其它非極性二氧化矽。術語非極件二氧化矽旨在表示一種或多種二氧化矽顆粒，其上接枝有非極件的化學功能團，最常見的是具有至少2個碳原子的烷基鏈。優選它們具有4到M個碳原子，更優選18個碳原子(十八烷基)、8個碳原子(辛基)或4個碳原子(丁基)。優選此非極性二氧化矽是十八烷基二氧化矽或辛基二氧化矽。術語^Ml[旨在表示可以被酶代謝的分子以產生允許直接或者間接檢測微生物的產物。它可以是天然或合成的底物。底物的代謝將引起反應培養基或生物體細胞的物理化學特性的變化。此變化可通過物理化學法檢測，尤其是光學法，通過操作員的眼睛或藉助於儀器、光譜測定法、電法、磁法等。優選其是光學性質中的變化，諸如吸收、螢光或發光的改變。術語螢光或牛餼酶底物旨在表示一種分子,其代謝產牛具有不同於該底物的螢光或顏色的產物。在本發明的背景下，酶底物優選選自氧化還原酶底物和水解酶底物。優選此底物是硝基還原酶、氧化還原酶、乙醯乙醯基輔酶A還原酶、脫氫酶、超氧化物歧化酶、氧化酶、肽酶、核酸酶或酯酶底物。對於生色底物特別可提及的是那些基於茜素的，α -葡糖苷酶底物，以及最特別是茜素-α-糖苷。對於螢光底物，可以提及的是那些基於香豆素的，那些在專利EP 0641351 ( 「 Enzymatic analysis using substrates that yield fluorescent precipitates"，Haugland et al.)或專利申請FR 07/55371中描述的，還原酶底物，以及特別是硝基還原酶底物，和更優選的在專利申請FR 07/55373或專利EP 1 124 986中描述的那些。對於氧化還原酶酶活性的底物，更特別可提及的是還原酶底物和優選的硝基還原酶底物。在已經含有茜素-α-糖苷的培養基中引入第二種酶底物(尤其是第二種α-葡糖苷酶底物)能夠提高軍團菌與培養基中生長的其他屬的區分。術語牛物樣品旨在表示臨床樣品，其源自支氣管、氣管或肺部吸出(aspiration) 的樣本，胸膜液的樣本，支氣管肺泡灌洗的樣本，痰樣本，血液樣本或肺活組織檢查樣本，以及更少見的關節或心包液的樣本；或食品樣品。因此此樣品可以是液體或固體的，按照非限制性的方式，可提及的有，臨床血液、血漿、尿液或糞便樣品，鼻、喉嚨、皮膚、傷口或腦脊液樣本，或來自水(飲用水)的食品樣品。術語環境樣品旨在表示水樣本，桉照非限制件的方式，可提及的有供水網絡、空調系統、冷卻塔、噴霧器、彌霧機(mister)。在這方面，本發明首先涉及用於培養和/或檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基，包括至少一種非極性二氧化矽。優選所述非極性二氧化矽是十八烷基二氧化矽。 優選所述非極性二氧化矽與粘土(優選海泡石)組合。優選十八烷基二氧化矽與海泡石組
I=I O根據本發明一個優選的實施方案，所述反應培養基還包括酶底物。優選所述酶底物是螢光或生色(優選生色)酶底物。優選所述螢光或生色酶底物是氧化還原酶底物或水解酶底物。根據本發明一個優選的實施方案，非極性二氧化矽的濃度為0.01-100g/l，優選l_5g/l。在本發明的培養基包括非極性二氧化矽組合粘土的情況下，粘土的濃度也是 0. 01-100g/l，優選 l-5g/l。根據本發明一個優選的實施方案，反應培養基還包括選擇性混合物，其允許軍團菌屬細菌的選擇性培養。優選此選擇性混合物包括甘氨酸、硫酸多粘菌素B、萬古黴素、放線菌酮、茴香黴素、溴甲酚紫或溴百裡酚藍，單獨或組合的。這類培養基的使用允許軍團菌屬細菌的選擇性檢測。本發明的培養基還可以包括允許特定軍團菌種(諸如嗜肺軍團菌)的選擇性培養的選擇性混合物。這種選擇性混合物優選包括甘氨酸、硫酸多粘菌素B、萬古黴素、喹諾酮或氟喹諾酮、放線菌酮、茴香黴素、溴甲酚紫或溴百裡酚藍，單獨或組合的。選擇性的差異還可以通過改變甘氨酸的濃度(從2. 5g/l到7. 5g/l)而獲得(Glycine-containing selective medium for isolation of Legionellaceae from environmental specimens, Robert M. Wadowski and Robert B. Yee)。本發明還涉及包括至少一種矽質化合物的反應培養基用於培養、檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的用途。優選所述矽質化合物是非極性二氧化矽和/或粘土。優選所述非極性二氧化矽是十八烷基二氧化矽。優選所述粘土是海泡石。根據本發明一個優選的實施方案，所使用的反應培養基中的矽質化合物的濃度為 0. 01-100g/l，優選l_5g/l。在所使用的反應培養基包括矽質化合物組合的情況下，每種化合物的濃度為0. 01-100g/l，優選l-5g/l。最後，本發明涉及用於檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的方法，其特徵在於其包括下列步驟a)將可能包含軍團菌屬細菌的樣品與如上所述的反應培養基接觸；b)溫育，和c)檢測軍團菌屬細菌的存在。溫育優選在30 V -50 V之間的溫度進行，且更優選在36 V -42 °C之間。軍團菌優選藉助於α-葡糖苷酶或氧化還原酶活性(其使得可以獲得有顏色的或螢光的菌落)的方法進行檢測。其他屬的菌落(如果它們不被抑制)是無色的或與軍團菌的顏色是不同的或者與軍團菌的顏色或螢光是相同的。溫育時間允許軍團菌屬細菌生長以便允許它們的檢測。不是限制性的，48_72h的溫育是合適的，但更短的溫育也是可能的。當使用此培養基時，優選藉助於氧化還原酶活性(其使得可以獲得有顏色的或螢光的菌落)來檢測軍團菌。其他細菌被抑制，或是無色的，或與軍團菌的顏色或螢光是不同的，或與軍團菌的顏色或螢光是相同的。給出下面的實施例是為了解釋，沒有限制的性質。它們使得可以更清楚的理解本發明。實施例1在5種不同的培養基上測試軍團菌屬的各種菌株。在溫育7 和後判讀各個皿。1.培養基和微生物使用具有下列組成的培養基(以g/Ι組成)_-酵母提取物10g/l-α-酮戊二酸lg/l-ACES/K0H :4/1. 65g/l-甘氨酸3g/l-鹽酸半胱氨酸0.4g/l-焦磷酸鐵0.25g/l-穀胱甘肽5g/l-瓊脂17g/l。向這種培養基中添加5g/l的非極性二氧化矽(十八烷基二氧化矽，培養基1)、5g/ 1的極性二氧化矽(矽膠，培養基2~)、5g/l高極性二氧化矽(3-氨丙基二氧化矽，培養基3) 或5g/l的非極性二氧化矽(辛基二氧化矽，培養基4)。BCYE 培養基(Feeley et al，J Clin Microbiol. 1979 10 :437-41)是作為生長對照的培養基。2.測試將所述培養基分配到培養皿中。通過三象限劃線(three quadrant streaking) 接種軍團菌各菌株。將皿在有(X)2存在的條件下在37°C溫育96h。在溫育72和96h後進行判讀。3.結果結果記錄在下表中
權利要求
1.一種用於培養、檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基，包括至少一種矽質化合物，其特徵在於所述矽質化合物是非極性二氧化矽。
2.權利要求1的反應培養基，其特徵在於非極性二氧化矽的濃度為0.01-100g/l，優選 l_5g/l。
3.權利要求1和2中任一項的反應培養基，還包括螢光的或生色的酶底物。
4.權利要求3的反應培養基，其中所述螢光的或生色的酶底物是氧化還原酶底物或水解酶底物。
5.權利要求1到4中任一項的反應培養基，還包括允許選擇性培養軍團菌屬細菌的選擇性混合物。
6.包括至少一種矽質化合物的反應培養基用於培養、檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的用途。
7.權利要求6的反應培養基的用途，其中所述矽質化合物是非極性的二氧化矽和/或粘土。
8.權利要求6或7的反應培養基的用途，其中矽質化合物的濃度為0.01-100g/l，優選 l_5g/l。
9.權利要求6到8中任一項的反應培養基的用途，所述反應培養基還包括螢光的或生色的酶底物。
10.權利要求8中的反應培養基的用途，其中所述螢光的或生色的酶底物是氧化還原酶底物或水解酶底物。
11.權利要求6到10中任一項的反應培養基的用途，所述反應培養基還包括允許選擇性培養軍團菌屬細菌的選擇性混合物。
12.一種用於檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的方法，包括下列步驟a.將可能包含軍團菌屬細菌的樣品與權利要求1到5中任一項的反應培養基接觸；b.溫育，和c.檢測軍團菌屬細菌的存在。
全文摘要
本發明涉及用於培養和/或檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的反應培養基，其包括至少一種矽化合物，其特徵在於所述矽化合物是非極性二氧化矽。本發明還涉及包括至少一種矽化合物的反應培養基用於培養、檢測和/或鑑定軍團菌屬細菌的用途。
文檔編號C12Q1/04GK102186986SQ200980140979
公開日2011年9月14日 申請日期2009年10月14日 優先權日2008年10月17日
發明者M·塞利耶, S·奧倫加, D·羅比雄, V·索沃內 申請人:生物梅裡埃公司