hsa-miR-150的用途的製作方法

2023-05-27 17:27:01 1

專利名稱：hsa-miR-150的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種與胃癌分化相關的hsa-miR-150的用途。
背景技術：
胃癌是世界上高發的惡性腫瘤之一，在1990-1992年的中國惡性腫瘤死亡抽樣 調查顯示，胃癌的死亡率接近25. 2/10萬人(男性32. 8/10萬人，女性17. 0/10萬人)，佔 1990-1992年死亡的腫瘤病人的23. 2%，居各類惡性腫瘤之首。雖然近年來胃癌的死亡率 有明顯下降，但是依然很高，多數胃癌患者是發現了臨床症狀如腹部不適、隱痛、泛酸、曖氣 或消瘦、黑便等症狀後進行胃鏡和活檢確診，一經確診，多為晚期，錯過了治療的最佳時期。胃癌的篩查手段包括影像學檢查、胃鏡加活檢、血清學檢測如胃蛋白酶元、CEA、 CA系列抗原等。目前最有效的手段就是胃鏡加活檢，胃鏡檢查和病理學診斷均基於形態學 的判斷，對於操作人員的經驗技術有較高的要求，這種非客觀、非標準化的檢測存在較大的 誤診/漏診率，而且對有不典型增生、胃癌進展期惡性程度變化等組織學特徵進行的區分， 目前尚難以有明確的界限。小RNA(microRNA或miRNA)於1993年首次在秀麗線蟲中發現，隨後在2001年正 式命名為microRNA，是一類約18_25nt的內源性非編碼RNA (noncoding RNA)，miRNA結合 mRNA的非編碼區的3』端，在轉錄後水平調節基因的表達，緊密結合會降解靶標mRNA，結合 不夠緊密則阻止mRNA的翻譯從而抑制靶基因表達。miRNA對增殖、分化、凋亡以及內環境的 穩態均有重要意義，miRNA具有高度的保守性、時序性和組織特異性。miRNA在許多腫瘤中均有差異表達，許多腫瘤有其特異性的miRNA表達譜。 hsa-miR-150在成熟B細胞和T細胞特異性表達，c-Myb是hsa-miR-150的保守性靶標， hsa-miR-150調控c-Myb的表達且在一定範圍內有劑量依賴效應，與c_Myb的表達水平負相 關，兩者之間的交互反應不僅對B細胞成熟分化、而且對胚胎發育和腫瘤發生均有重要意 義。hsa-miR-150在B細胞慢性淋巴細胞白血病中高表達。目前尚無關於hsa-miR-150與胃癌分化相關的研究報導。

發明內容
本發明要解決缺乏客觀準確地診斷腫瘤惡性程度的方法的技術問題，提供一種與 胃癌分化相關的hsa-miR-150的用途，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標誌物。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一個方面，提供了一種hsa-miR-150的用途，用於製備輔助診斷腫瘤 惡性程度的產品。優選的，所述輔助診斷腫瘤惡性程度的產品包括用實時定量PCR、或miRNA晶片 診斷腫瘤惡性程度的產品。所述用實時定量PCR診斷腫瘤惡性程度的產品至少包括特異性擴增hsa-miR-150的引物。所述用miRNA晶片診斷腫瘤惡性程度的產品包括與hsa-miR-150特異性結合的 探針。在本發明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。所述 探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可 以。在本發明的另一方面，還提供了一種用於輔助診斷腫瘤惡性程度的試劑盒，所述 試劑盒包含特異性針對hsa-miR-150的引物或探針。利用本發明的試劑盒，可以檢測腫瘤病人hsa-miR-150的表達情況，如果 hsa-miR-150的表達量顯著升高，表明腫瘤分化低，惡性高，治療效果差，如果hsa-miR-150 的表達量正常，表明腫瘤分化好，惡性低，治療效果佳。分化在腫瘤病理學中常指腫瘤細胞 與其起源程序的成熟細胞(相應的正常細胞)的相似程度。在形態、功能、代謝、行為等方 面，腫瘤細胞越相似於相應的正常細胞，則為高分化，否則就是低分化，腫瘤細胞的分化程 度是腫瘤良惡性鑑別中的主要依據。一般地，分化高的腫瘤具有良性行為，分化低的腫瘤多 有惡性表現。在本發明的另一方面，還提供了一種hsa-miR-150的用途，用於製備誘導腫瘤分 化的藥物。優選的，所述誘導腫瘤分化的藥物包括抗hsa-miR-150的反義寡核苷酸。在本發明的另一方面，還提供了一種hsa-miR-150的用途，用於篩選誘導腫瘤分 化的藥物。上述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗 狀細胞癌、或白血病腫瘤，優選為胃癌。上述hsa-miR-150 為 SEQ ID NO 1 所示的 miRNA 序列。本發明與胃癌分化相關的hsa-miR-150，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標誌物， 也可作為預測腫瘤病人生存率的標誌物，同時還可作為胃癌或其他腫瘤的藥物治療靶標， 為設計和篩選誘導腫瘤分化的藥物提供新的靶點。


下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。圖1是本發明實施例1胃癌組織樣本中提取的總RNA的2100峰圖；圖2是本發明實施例1的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達的miRNA芯 片結果圖；圖3是本發明實施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達的實時定量 PCR曲線圖；圖4是本發明實施例2的hsa-miR-150在胃癌和癌旁組織中差異表達的晶片與定 量PCR結果比較圖。
具體實施例方式下列實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M.奧斯伯，R.E.金斯頓，J.G.塞德曼等主編，馬學軍，舒躍龍的譯.北京 科學出版社，2004)中所述的方法進行。實施例1 miRNA晶片實驗檢測胃癌組織中差異表達的miRNA1.臨床樣品的準備胃癌手術切除標本，留取26對胃癌及其癌旁正常組織，-80°C凍存，液氮運輸。臨 床病理信息顯示，該26個胃癌組織中，包含低分化、中分化及中低分化的胃癌組織。胃癌的 診斷標準參照全國胃癌病理協作組擬定的胃黏膜活檢病理診斷的統一標準。2.總RNA的提取、質量檢測和純化(1)冰凍切片26對胃癌及其癌旁正常組織經過HE染色檢查後，8 u m連續切5 6片，經重新病 檢確定細胞質量後-80°C保存於1. 5ml離心管中。(2)總RNA的提取利用mirVana miRNA提取試劑盒(Ambion)抽提總RNA，具體步驟詳見mirVana miRNA提取試劑盒說明。(3)總RNA的質量檢測用Agilent 2100 bioanalyzer分析提取的RNA，得2100峰圖(見圖1)，清晰的峰 形和最低的背景螢光顯示完整、未降解的RNA。3. miRNA 晶片實驗(1)實驗過程miRNA晶片採用Agilent Human miRNA 1. 0晶片，該晶片可同時檢測470個人類和 64個病毒miRNA的表達。總RNA利用miRNA標記試劑和雜交試劑盒(Agilent Technologies)進行標記，標 記後的miRNA在55°C，20RPM進行晶片雜交(Agilent Technologies, G4470A)，掃描之前分 別用GE清洗緩衝液1和GE清洗緩衝液2室溫各洗5min，然後用Agilent晶片掃描儀掃描 晶片。將掃描得到的圖像利用圖像分析採集軟體8. 1 (Feature Extraction Software 8.1， AgilentTechnologies)分析得到原始數據。(2)數據預處理和差異篩選miRNA晶片所得到的原始數據經過均一化、背景質量檢測得到miRNA表達值，利用 MeV 4. 5的SAM模塊結合臨床資料的轉移分型進行分析。(3)結果應用SAM軟體篩選在26對胃癌和癌旁組織中差異表達的miRNA(FDR = 0)，找到了 hsa-miR-150(圖 2)，其序列為 UCUCCCAACCCUUGUACCA⑶G(SEQ ID NO :1)。在圖 2 中，MD 表 示中分化，M-PD表示中低分化，PD表示低分化，上方是樣本編號，下面是表達圖譜，紅色表 示miRNA上調(相對於癌旁)，綠色表示下調，黑色表示未變化。實施例2實時定量PCR檢測hsa-miR-150表達的改變(1)內參設定及引物設計、合成內參選用U6-2，miRNA的定量PCR引物由特異性引物和通用引物構成，其 中通用引物由qiagen miScript SYBR Green PCR試劑盒自帶；特異性引物序列為 TCTCCCAACCCTTGTACCAG(SEQ ID NO 2)，由本公司自己合成。
(2) RNA提取和逆轉錄cDNA合成RNA的提取、質量檢測和純化步驟同實施例1所述。逆轉錄採用miScript逆轉錄試劑盒(Qiagen)，在PCR管中加入5XRT緩衝液、逆轉錄酶混合液、模板RNA、無Rnase酶水，輕輕混勻，置於冰上。逆轉錄PCR反應程序為37°C 60分鐘；再95°C 5分鐘。產物_20°C保存。(3)實時定量PCR反應採用ABI 7300 定量 PCR 儀，試劑採用 miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen)，逆轉錄產物1 10稀釋。實時定量PCR反應體系2X SYBR Green混合液 10ul，10XmiScript 通用引物 2ul，10X 成熟 miRNA 的引物(miScript Primer Assay)，無 Rnase酶水，稀釋cDNA。反應程序為95°C 15分鐘，1個循環；再94°C 15秒，55°C 30秒， 70 °C 34秒，進行40個循環。反應結束，得定量PCR的曲線圖(見圖3)，分析該圖可得本發明的hsa-miR-150在 胃癌和癌旁正常樣本差異表達，在圖3中，橫坐標為循環數，縱坐標為儀器自帶軟體產生的 DeltaRn值(螢光量的log值)。hsa-miR-150在12對胃癌樣本中表達情況的晶片與定量 PCR結果比較見圖4，在圖4中，橫坐標為樣本號；MD表示中分化，M-PD表示中低分化，PD表 示低分化；縱坐標為Log Ratio值，即癌(T)和癌旁(N)比值取Log值；qPCR內參miRNA為 U6。由圖4可知，miRNA晶片實驗和實時定量PCR實驗的結果都表明hsa-miR-150在低分 化的胃癌樣本中表達明顯升高，而在中分化及中低分化的胃癌樣本中表達正常。因此，可通 過實時定量PCR或miRNA晶片診斷胃癌的惡性程度設計hsa-miR-150的PCR引物或探針， 檢測胃癌組織中hsa-miR-150的表達量，如果hsa-miR-150的表達量顯著升高，則說明胃癌 的分化程度低，惡性程度高，治療效果差，如果hsa-miR-150的表達量正常，則說明胃癌分 化正常，惡性低，治療效果好。由於有研究表明hsa-miR-150在B細胞慢性淋巴細胞白血病 中也高表達，因此，也可通過實時定量PCR或miRNA晶片，檢測腫瘤組織中hsa-miR-150的 表達量，從而輔助診斷腫瘤的惡性程度。實施例3誘導腫瘤分化藥物的篩選以SEQ ID NO 1所示序列的hsa-miR-150作為靶點，設計和篩選誘導腫瘤分化的
藥物。具體方法如下。用候選物質處理表達hsa-miR-150的體系，然後檢測該體系中hsa-miR-150的表 達水平。若候選物質可降低hsa-miR-150的表達，則表明該候選物質是能誘導腫瘤分化的 潛在藥物。以上所述實施例僅表達了本發明的實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能 因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說， 在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範 圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
權利要求
一種hsa-miR-150的用途，其特徵在於，用於製備輔助診斷腫瘤惡性程度的產品。
2.根據權利要求1所述的用途，其特徵在於，所述輔助診斷腫瘤惡性程度的產品包括 用實時定量PCR、或miRNA晶片診斷腫瘤惡性程度的產品。
3.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述用實時定量PCR診斷腫瘤惡性程度的 產品至少包括特異性擴增hsa-miR-150的引物。
4.根據權利要求2所述的用途，其特徵在於，所述用miRNA晶片診斷腫瘤惡性程度的產 品包括與hsa-miR-150特異性結合的探針。
5.一種用於輔助診斷腫瘤惡性程度的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包含特異性針 對hsa-miR-150的引物或探針。
6.一種hsa-miR-150的用途，其特徵在於，用於製備誘導腫瘤分化的藥物。
7.根據權利要求6所述的用途，其特徵在於，所述誘導腫瘤分化的藥物包括抗 hsa-miR-150的反義寡核苷酸。
8.一種hsa-miR-150的用途，其特徵在於，用於篩選誘導腫瘤分化的藥物。
9.根據權利要求1、6、或8所述的用途，其特徵在於，所述hsa-miR-150為SEQID NO 1所示的miRNA序列。
10.根據權利要求1、6、或8所述的用途，其特徵在於，所述腫瘤包括胃癌、肝癌、胰腺 癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、睪丸癌、口腔鱗狀細胞癌、或白血病腫瘤。
全文摘要
本發明公開一種hsa-miR-150的用途，用於製備輔助診斷腫瘤惡性程度的產品。本發明還公開了hsa-miR-150在製備或篩選誘導腫瘤分化的藥物中的用途。本發明與胃癌分化相關的hsa-miR-150，可作為輔助診斷腫瘤惡性程度的標誌物，也可作為預測腫瘤病人生存率的標誌物，同時還可作為胃癌或其他腫瘤的藥物治療靶標。
文檔編號C12Q1/68GK101798599SQ20101013902
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月2日 優先權日2010年4月2日
發明者張慶華, 張雯, 楊燕青, 陽聖 申請人:上海生物晶片有限公司