抑制酪氨酸酶表達的雙鏈rna寡核苷酸的製作方法

2023-05-27 17:30:26

專利名稱：抑制酪氨酸酶表達的雙鏈rna寡核苷酸的製作方法
技術領域：
本發明涉及新的用於降低酪氨酸酶表達的雙鏈RNA寡核苷酸，其在化妝和/或藥學目的上的用途，以及它與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒的締合。
背景技術：
酪氨酸酶(單苯酚二羥基苯丙氨酸氧氧化還原酶EC 1.14.18.1)是參與皮膚色素形成機制的必需酶。它具體催化以下反應依靠其羥化酶活性催化酪氨酸轉變成多巴(二羥基苯丙氨酸)並且依靠其氧化酶活性將多巴轉化成多巴醌(dopaquinone)。酪氨酸酶只有在某些生物因子的作用下處於成熟狀態時才起作用。
該酶在治療如黑色素瘤(Riley等，J.Immunother.2001，21，212-220)或者Vogt-Koyanagi-Harada病(Read等，Curr.Opin.Ophthalmol.，2000，11，437-442)的疾病中也是有利的。
皮膚色素形成的形成機制，也就是黑色素的形成，是特別複雜的，且示意性地包括下面的主要步驟酪氨酸→多巴→多巴醌→多巴色素→黑色素因此，人類皮膚的色素形成是由樹突細胞、黑色素細胞合成黑色素而導致的。後者含有被稱為黑素體的細胞器，其是黑色素生物合成的部位。黑素體在沿著樹突遷移後，從黑素細胞轉移到角質形成細胞。然後在表皮分化過程中，角質形成細胞被轉運到皮膚表面(Gilchrest BA，Park HY，Eller MS，Yaar M，Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation.Photochem Photobiol 1996；631-10；Hearing VJ，Tsukamodo K，Enzymaticcontrol of pigmentation in mammals.FASEB J 1991；52902-2909)。在黑素原生成酶中，酪氨酸酶是催化黑色素合成前兩個步驟的關鍵酶。酪氨酸酶的純合突變導致I型眼皮膚白化病，所述I型眼皮膚白化病特徵是黑色素合成的完全喪失(Toyofuku K，Wada I，Spritz RA，Hearing VJ，The molecular basisof oculocutaneous albinism type 1(OCA1)sorting failure and degradation ofmutant tyrosinases results in a lack of pigmentation.Biochem J.2001；355259-269)。
由於著色過度紊亂是由黑色素生產的增加導致的，所以人們發現開發新的治療方法很重要，其原理是基於抑制酪氨酸酶的活性。
大多數已知的亮膚(skin-lightening)化合物是酚類/兒茶酚類。這些化合物抑制酪氨酸酶，但是這些化合物的絕大多數對黑色素細胞具有細胞毒性，這會導致皮膚的永久性褪色。
因此，看起來既高效又表現出好的耐受性的新的酪氨酸酶抑制化合物應用於人類是有利的。
最近，雙鏈RNA dsRNA寡核苷酸，且更具體是siRNA寡核苷酸(12至40個核苷酸的)的應用，使得在如皮膚護理或頭髮護理的化妝領域，以及皮膚病學領域和藥學領域獲得特別的活性成為可能。
然而，已知siRNA在體內應用存在各種困難。
除了在局部應用這些siRNA時，為使其到達靶細胞的這些siRNA的穿透問題之外，特別是由於穿過角質層的困難，經驗已顯示施用siRNA，如很多出版物報導的會觸發乾擾素應答(Sledz CA等，Activation of theinterferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol.2003；9834-9.KatalinKarikó等，Small Interfering RNAs Mediate Sequence-Independent GeneSuppression and Induce Immune Activation by Signaling through Toll-Like Receptor31.J.Immunol.2004；1726545-6549.Judge AD等，Sequence-dependentstimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA.NatBiotechnol.2005；23457-62)，而且還會誘導或抑制非siRNA靶向的基因的表達(Jackson等，Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol.2003；21635-7)，這兩種現象都是非常不合需要的。
專利申請US 2004/0215006描述了有抗酪氨酸酶活性的雙鏈的和反義單鏈的RNA寡核苷酸；所用的實施例只涉及反義單鏈RNA寡核苷酸。具體地，它沒有證明與這些反義RNA同源的siRNA是否有效。
一些作者已強調，如siRNA的雙鏈RNA寡核苷酸和反義單鏈RNA寡核苷酸具有不同的靶，且反義RNA的活性不能外推到相同序列的siRNA(Xu等，Effective small interfering RNAs and phosphorothioate antisense DNAshave different preferences for target sites in the luciferase mRNAs.BBRC 2003306712-717)。
此外，在該文獻US 2004/0215006中，提出的siRNA的濃度是50-200nM。如上所指出的，Jackson等已經描述了未被在濃度為100nM時使用的siRNA靶向的基因的強的正調節和負調節。
類似地，在WO 2005/060536中，描述了特異性抑制酪氨酸酶的siRNA，其所提出的濃度範圍非常寬，且可能導致組合物中包含了非常大量的siRNA，由此會觀察到非siRNA靶向的基因的正調節和負調節。
在化妝或治療用途的範圍內，這種非靶向基因的調節是不能接受的，特別是由於它不可預見的特性。
本申請人已開發了特異性抑制酪氨酸酶表達的新的siRNA，從所述siRNA中選擇展示一定活性的siRNA，從而所述siRNA可在小於或等於1nM的劑量下使用。
除了解決涉及誘導非特異基因的問題之外，本申請人已證實了這些siRNAs序列不會誘導幹擾素應答。
為此，按照Invitrogen公司銷售的「BLOCK-iTTMRNAi Stress ResponseControl Kit(Human)for monitoring interferon-mediated stress response to double-stranded RNA in human cells」的手冊中描述的方案，測量了已知受幹擾素誘導的OAS-1和IFIT-1(幹擾素誘導的三十四肽(tetratricopeptide)重複結構域)基因的表達(Stefan F.Wieland等，Searching for Interferon-Induced Genesthat inhibit Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mouse Hepatocytes，J.ofVirology 2003，771227-1236)。
此外，這些酪氨酸酶特異性siRNA與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合，使得可能非常顯著地提高所述siRNA向如皮膚的三維模型的靶細胞的穿透。一旦穿透，酪氨酸酶特異性siRNA就變得有活性。
穿透可通過與siRNA附著的螢光標記進行評價，且其活性可通過定量PCR對靶信使進行定量或通過測定對應於靶信使的蛋白而進行評價。
本發明的陽離子型顆粒可以是表面活性劑膠束、嵌段或非嵌段聚合物膠束、陽離子脂質體和非離子表面活性劑微囊(niosome)、陽離子油質體、陽離子毫微乳劑(nanoemulsion)、以及陽離子有機或無機顆粒和毫微膠囊(nanocapsule)。
發明概述這樣，本發明的第一個主題涉及一種選自寡核苷酸序列SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48，任選地經過修飾的雙鏈RNA寡核苷酸(也稱作dsRNA或siRNA)。
利用dsRNA，且更具體是siRNA(短幹擾RNA)，使得通過降解編碼靶蛋白的mRNA而獲得特異性抑制該蛋白合成的活性成為可能。靶mRNA的降解通過RISC複合體(RNA誘導的沉默複合體)的活化而實現，所述RISC複合體通過dsRNA的反義鏈與mRNA的結合而發揮其作用(參見Tuschl T.Chem.Biochem.2001；2239-245；Nykanen A al，Cell 2001107309-321；Dorsett Y.和Tuschl T.Nat Rev Drug Discov.2004；3318-329；Downward J.BMJ.2004；3281245-1248；Shanker P等，JAMA 2005；2931367-1373)。
實現的分子結構包括由12-40個核苷酸，優選23-27個核苷酸組成的雙鏈RNA片段。
這些雙鏈RNA寡核苷酸可優選地由同源的有義鏈以及與人酪氨酸酶mRNA(GenBank登記號NM 000372)序列互補的反義鏈組成。該雙鏈RNA寡核苷酸具有平頭末端或者有2-6個核苷酸的不配對末端。
雙鏈RNA寡核苷酸可通過多種手動的或自動的、體內的或體外的方法合成。
體外合成方法可以是化學方法或者酶法，例如利用RNA聚合酶(例如通過，T3、T7或者SP6)，其會對選定的DNA(或者cDNA)序列模型進行轉錄。
下列文獻中描述了許多種體內合成雙鏈RNA的方法；它們可在各種細菌細胞類型，或者高等生物細胞類型中進行(Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual，第二版(1989)，DNA cloning，第I卷和第II卷，D.N.Glover(1985版)，Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gaits(1984版)，Nucleic Acid Hybridation，B.D.Hames和S.J.Higgins(1984版)，Transcription and Translation B.D.Hames和S.J.Higgins(1984版)，Animal CellCulture，R.I.Freshney(1986版)，Immobilized Cells and Enzymes，IRL Press(1986)，B.Pertal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)，GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells，J.H.Miller和M.P.Calos，Cold SpringHarbor Laboratory(1987版)，Methods in Enzymology，154卷，Wu和Grossman，以及155卷，Wu，Mayer和Walker(1987)，ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular Biology，Academic Press，London，Scopes(1987)，Protein PurificationPrinciple and Practice，第二版，Springer-Verlag，N.-Y.以及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷，C.D.Weir和CC.Blackwell(1986))。還可參考專利申請WO 01/36646、WO01/75164以及US 2003/0088087中描述的合成方法。
優選地，本發明的雙鏈RNA寡核苷酸通過在2』-位置添加-O-甲基基團進行修飾。
雙鏈RNA寡核苷酸可進行各種修飾，所述修飾具體是如文獻US2004/014956中所述的修飾。
有利地，修飾會導致雙鏈RNA寡核苷酸更為穩定，而且更優選地，導致雙鏈RNA寡核苷酸不會引起幹擾素應答，這種性質對於體內應用是必需的。這些雙鏈RNA寡核苷酸還可對有義鏈進行修飾，從而使得其不能被整合入RISC，並從而不會引起副作用。
優選地，將使用SEQ ID NOS.1、2、4、13、16、35、37、40和42的雙鏈RNA寡核苷酸，按照下文實施例2的方案所測量的，其在0.016nM時具有的酪氨酸酶mRNA降解效率大於50％。
本發明的主題還涉及包含至少一種選自寡核苷酸序列SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的雙鏈RNA寡核苷酸的組合物。
在該組合物中，雙鏈RNA寡核苷酸的存在濃度是小於或等於100μM，優選小於或等於10μM，且更優選小於或等於1μM。
本發明的組合物優選適於局部施用於身體表面，也就是皮膚、體被、黏膜以及眼睛。
在本發明的一個優選的實施方案中，雙鏈RNA寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合。
在該實施方案中，雙鏈RNA寡核苷酸會粘附到顆粒的表面，後者用作為載體以使其穿透進入皮膚結構和進入皮膚、黏膜或眼睛的靶細胞而用於化妝、皮膚病學和/或眼的應用。
本發明的陽離子型顆粒是這樣的顆粒，其大小小於或等於1μm，優選小於或等於500nm，更為優選小於或等於300nm，可能採用，例如Brookhaven公司的雷射顆粒分級器的BI90plus型測量所述大小，且ζ電勢為10-80mV，所述電勢可用Coultronics公司的ζ儀DELSA 440型進行測量。
陽離子型顆粒可選自表面活性劑膠束，具體是非離子兩親型表面活性劑和陽離子表面活性劑膠束，嵌段聚合物膠束，具體是陽離子兩親型嵌段聚合物膠束、非離子兩親型嵌段聚合物和陽離子兩親型嵌段聚合物膠束和非離子兩親型嵌段聚合物和陽離子表面活性劑膠束，非離子和陽離子表面活性劑脂質體，非離子表面活性劑微囊，油質體，毫微乳劑顆粒，毫微膠囊，有機顆粒或無機顆粒。
發明詳述下面且以未窮盡的方式列舉根據本發明可用的陽離子型顆粒。
表面活性劑膠束我們回想一下，膠束是當兩親型分子溶於水中或油中，在超過某一特定的稱為臨界的CMC濃度時自發形成的聚集體。
可用於本發明範圍內的膠束由至少一種陽離子表面活性劑組成。該陽離子表面活性劑可與一種或多種非離子兩親型表面活性劑締合。
本領域技術人員可以從McCutcheons的「emulsifiers and detergents」1998版以及其後的版本中方便地選擇非離子和陽離子的表面活性劑。
作為非限制性的例子，下面列出了本發明範圍內可用的陽離子表面活性劑。
非限制地，可用的非離子表面活性劑是PEO、甘油和聚甘油、氧乙烯化或未氧乙烯化的山梨聚糖、蔗糖、氧乙烯化或未氧乙烯化的葡萄糖、麥芽糖、PPO-PEQ的烷基和聚烷基(C6至C30，飽和的或未飽和的，分支的或未分支的)酯或醚。
就非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑的混合物來說，其各自的重量比將為99/1至1/99。
形成膠束的表面活性劑的量將取決於後者的CMC。然而，在本發明中，膠束表面活性劑的濃度以其重量計算相對於組合物總重量為0.1-10％，且優選為0.2-5％。
嵌段聚合物膠束兩親型嵌段聚合物膠束可按照文獻WO 04/035013中描述的方法進行製備。
用於製備與根據本發明的dsRNAs締合的膠束的嵌段共聚物具體是兩親型嵌段聚合物，其優選為非離子的，二嵌段或三嵌段，且其與水接觸能形成膠束。它們具體是二嵌段(A-B)或三嵌段(A-B-A)的類型，A對應於非離子親水聚合物嵌段而B對應於疏水聚合物嵌段。該聚合物的分子量可為1000至100000，而A/B的比率可為1/100至50/1。
在本發明中，可用到三種類型的膠束-陽離子兩親型嵌段聚合物膠束；-非離子兩親型嵌段聚合物與陽離子兩親型嵌段聚合物締合的混合膠束；和-非離子兩親型嵌段聚合物與陽離子表面活性劑締合的膠束。
非離子親水聚合物嵌段可選自聚環氧乙烷(PEO)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
疏水聚合物嵌段可選自聚苯乙烯、聚(叔丁基苯乙烯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(丙烯酸乙酯)、聚(丙烯酸丁酯)、聚(甲基丙烯酸丁酯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚己酸內酯、聚己內醯胺、聚二甲基矽氧烷、聚(C3-C6環氧烷)、聚(天冬氨酸)、聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、聚亮氨酸、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯。
嵌段共聚物優選選自下列嵌段共聚物
-聚環氧丙烷/聚環氧乙烷-聚苯乙烯/聚氧乙烯-聚(甲基丙烯酸甲酯)/聚氧乙烯-聚(甲基丙烯酸丁酯)/聚氧乙烯-聚氧化丁烯/聚氧乙烯-聚己酸內酯/聚氧乙烯-聚乙烯/聚氧乙烯-聚氧乙烯/聚氧化丁烯/聚氧乙烯。
在本發明中，有必要向膠束組合物中添加-陽離子兩親型嵌段聚合物，所述嵌段中的一種是陽離子的且舉例來說可選自-聚(聚甲基丙烯酸三甲基乙銨)；-季銨化的聚(甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)；-聚甲基乙烯基咪唑(polymethyvinylimidazolium)；-聚(乙烯基苯甲基三甲基氯化銨)(poly(vinylbenzyltrimethylammonium chloride))。
非離子兩親型嵌段聚合物與陽離子兩親型嵌段聚合物的締合為使兩者之間的比率為99/1至1/99；和/或-如下面所列的至少一種陽離子表面活性劑。
在這種情況下，非離子兩親型嵌段聚合物與陽離子表面活性劑的各自比率將為50/50至99/1。
在本發明中，與陽離子表面活性劑締合或未締合的膠束嵌段聚合物的濃度，以其重量計算相對於組合物的總重量將為0.1-10％，且優選0.2-5％。
在本明的一個變形中，也可能形成由如上所述的陽離子兩親型嵌段聚合物組成的膠束。
脂質體和非離子表面活性劑微囊能夠形成非離子脂質體的非離子兩親型脂質具體是專利申請EP 0 582503中描述的那些。
具體地，非離子兩親型脂質可由至少一種多元醇和至少一種脂肪酸的酯混合物組成，其中所述多元醇選自含有1-60個環氧乙烷單元的聚乙二醇、山梨聚糖、具有2-60個環氧乙烷單元的山梨聚糖、具有2-30個環氧乙烷單元的甘油、含有2-15個甘油單元的聚甘油、蔗糖、具有2-30個環氧乙烷單元的葡萄糖，所述脂肪酸含有線性或分支的、飽和或不飽和的C5-C17烷基鏈，每個多元醇基團的烷基鏈數目為1-10。
術語「酯混合物」不但包括不同化學族的純酯的混合物，也包括以各種比例含有相同族的多元醇的幾種化學純酯的任何產品。具體地，在其親水部分具有統計學化學式的產品就是這樣，例如化學式CO-(OCH2-CHOH-CH2)n-OH的聚甘油酯，其中n是統計學值，且其可含有n＝1，n＝2，n＝3，n＝4等的各種比例的酯；在其親脂部分含有幾種烷基鏈的酯也是這樣，例如椰油酸酯，其含有C5-C17烷基鏈，或異硬脂酸酯，其中C17烷基鏈是同分異構形式的複雜混合物；由相同多元醇的單-、二-、三-或聚酯的混合物組成的產品也是這樣。需注意的是，只含有能夠形成小泡的單酯和另一種類型雜質的產品不能用於本發明。
商品酯可單獨地用於本發明，因為它們實際上是酯的混合物，它們為例如下述的-「ICI」公司出售的商品名為「SFAN 20，40，60和80」的山梨聚糖(或山梨糖醇酐)和脂肪酸的偏酯；-「NIKKO」公司出售的商品名為「SI 10 R NIKKOL」的異硬脂酸山梨聚糖酯；-「ICI」公司出售的名為「TWEEN 61」的、具有4個環氧乙烷單元的硬脂酸山梨聚糖酯；-「ICI」公司出售的名為「MYR J 45」的、含有8個環氧乙烷單元的硬脂酸聚乙二醇酯；-「NIKKO」公司出售的名為「MYS 4」的化學式為EMI6.1的單硬脂酸聚乙二醇酯，其中化學式n等於4；-「UNICHEMA」公司出售的化學等級或生物技術生產的等級的分子量為400的硬脂酸聚乙二醇酯；-「HOECHST」公司出售的名為「HOSTACERINE DGS」的、具有4個環氧乙烷單元的硬脂酸二甘油酯；
-「NIKKO」公司出售的名為「TETRAGLYN 1S」的硬脂酸四甘油酯；-「SOLVAY」公司出售的異硬脂酸二甘油酯；-「NIHON」公司出售的名為「EMALEX DSG 2」的二硬脂酸二甘油酯；-「CRODA」公司出售的名為「F50、F70、F110和F160CRODESTA」的單-、二-和三硬脂酸棕櫚酸蔗糖酯；-「GRILLO」公司出售的名為「GRILLOTEN PSE 141G」的單硬脂酸棕櫚酸蔗糖酯和二硬脂酸棕櫚酸蔗糖酯的混合物；-「ICI」公司出售的名為「ARLATONE 2121」的硬脂酸蔗糖酯和椰油酸蔗糖酯的混合物；-「AMERCHOL」公司出售的名為「GLUCAM E 20DISTEARATE」的、具有20個環氧乙烷單元的二硬脂酸甲基葡萄糖酯。
當然，可以使用以上已經是混合物的產品相互之間的混合物，或者這些產品與純的產品的混合物。
陽離子表面活性劑選自下文所列的，且從而它們賦予分散體的pH為5-8；在脂質相中，非離子兩親型脂質的量與陽離子表面活性劑的量的重量比為50/1到50/25，且分散體的脂質相與水相的重量比為1/1000到300/1000。
油質體本發明涉及的油質體在專利申請EP 0 705 593中有描述。它們包括一種水包油類型的乳劑，其由帶有層狀液晶包被的油質小球構成，分散在水相中，其特徵是每個油質小球作為一個單位，包被著單層的或多層的層(經冷凍斷裂(cryofracture)後利用透射電子顯微鏡術可以觀測到1-10個薄片)，所述層由至少一種親脂表面活性劑、至少一種親水的表面活性劑以及至少一種陽離子表面活性劑得到，賦予乳劑的pH為5-8，所述被包被的油質小球的平均直徑小於500納米。
親脂表面活性劑和親水表面活性劑各含有至少一種具有超過約12個碳原子的飽和脂肪鏈。更為優選的是，該脂肪鏈含有16至22個碳原子。
根據本發明的另一個優選的實施方案，親脂表面活性劑的HLB為約2至約5。為大家所熟知的是，術語HLB(親水-親脂平衡)用於指表面活性劑的親水基團的大小和強度與親脂基團的大小和強度之間的平衡。
這樣的親脂表面活性劑的例子是二硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸四甘油酯、十硬脂酸十甘油酯、單硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸六甘油酯、五硬脂酸十甘油酯、單硬脂酸山梨聚糖酯、三硬脂酸山梨聚糖酯、單硬脂酸二甘醇酯、棕櫚酸和硬脂酸的甘油酯、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯2OE(包含2個氧乙烯單元)、單山萮酸甘油酯和二山萮酸甘油酯以及四硬脂酸季戊四醇酯。
親水表面活性劑優選具有約8至約12的HLB。
作為這樣的親水表面活性劑例子，可提及下列化合物聚氧乙烯化的山梨糖醇酐單硬脂酸酯4OE、聚氧乙烯化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯20OE、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯8OE、單硬脂酸六甘油酯、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯10OE、聚氧乙烯化的二硬脂酸酯12OE以及聚氧乙烯化的二硬脂酸甲基葡萄糖酯20OE。
陽離子表面活性劑可選自下文中描述的化合物。
毫微乳劑陽離子型顆粒還可以選自水包油的毫微乳劑，其包含在水相中分散的油相，其油質小球的數均大小小於100nm，特徵是它們包含至少一種兩親型脂質，所述兩親型脂質含有至少一種非離子兩親型脂質和一種陽離子兩親型脂質，油相和兩親型脂質存在的含量使得油相/兩親型脂質的重量比為3到10。
毫微乳劑一般具有透明至淺藍色的外觀。所述毫微乳劑的透明度通過在600nm下處於10-90％的透射係數，或者通過濁度進行測量。本發明的組合物的濁度是60到400NTU，且優選70到300NTU，所述濁度是利用型號為2100P的HACH可攜式濁度儀在約25℃下測量的。
本發明的毫微乳劑的油質小球的數均大小小於100nm，且優選20-80nm，且更優選40-60nm。小球大小的降低使得可能促進活性劑穿透進入皮膚表面層(載體效應)。
根據本發明的毫微乳劑優選在4-45℃的溫度製備，且因此與熱敏活性劑相容。
這些分散體在下列申請中有具體的描述EP 0728 460、EP 0 879 589、EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1018 363、EP 1 025 898以及EP 1 120 102。在所有這些申請中都指明，為了提高顆粒的穩定性，可向非離子表面活性劑(或混合物)中加入離子表面活性劑。
在本發明的情況中，一種或多種陽離子表面活性劑將專門用作離子表面活性劑。
上述參考文獻中指出的比例予以保留，且以陽離子表面活性劑為例，選擇列表中對所有顆粒通用的。
非離子表面活性劑，優選水溶性的或在水分散性的，含有至少一種疏水的嵌段和至少一種親水的嵌段。
本發明的非離子兩親型脂質優選選自1/矽氧烷表面活性劑，2/在溫度低於或等於45℃時為液體的兩親型脂質，其選自至少一個多元醇或至少一個脂肪酸的酯，其中脂肪酸含有至少一個線性或分支的、飽和或不飽和的，且具體是不飽和的或分支的、C8-C22烷基鏈，所述多元醇選自含有1至60個環氧乙烷單元的聚乙二醇、山梨聚糖、含有2-30個環氧乙烷單元的甘油和含有2-15個甘油單元的聚甘油，3/脂肪酸和糖的酯以及脂肪醇和糖的醚，4/在溫度等於45℃時為固體的表面活性劑，其選自脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨聚糖酯以及氧乙烯化的脂肪酸山梨聚糖酯、乙氧基化的脂肪醚以及乙氧基化的脂肪酸酯，5/環氧乙烷(A)和環氧丙烷(B)的嵌段共聚物，以及這些表面活性劑的混合物。
1/可根據本發明使用的矽氧烷表面活性劑是含有至少一個氧乙烯化的鏈-OCH2CH2-和/或氧丙烯化的鏈-OCH2CH2CH2-的矽氧烷化合物；可提及文獻US-A-5,364,633和US-A-5,411,744中描述的那些。
優選地，根據本發明使用的矽氧烷表面表面活性劑是式(II)的化合物
其中R1、R2和R3彼此獨立地代表C1-C6烷基自由基或者-(CH2)x-(OCH2CH2)y-(OCH2CH2CH2)2-OR4自由基，至少一個自由基R1、R2或R3不是烷基自由基；R4是氫、烷基自由基或者醯基自由基；A是0至200的整數；B是0至50的整數；限定條件是A和B不同時等於零；x是1至6的整數；y是1至30的整數；z是0至5的整數。
根據本發明一個優選的實施方案，在式(X)的化合物中，烷基自由基是甲基自由基，x是2-6的整數，且y是4-30的整數。
作為式(II)的矽氧烷表面活性劑的例子，可以提及式(III)的化合物 其中A是20至105的整數，B是2至10的整數，並且y是10至20的整數。
作為式(II)的矽氧烷表面活性劑的例子，還可以提及式(IV)的化合物H-(OCH2CH2)y-(CH2)3-[(CH3)2SiO]A-(CH2)3-(OCH2CH2)y-OH(IV)其中A』和y是10至20的整數。
作為矽氧烷表面活性劑，可具體使用由Dow Corning公司出售的名為DC 5329、DC 7439-146、DC 2-5695和Q4-3667的產品。化合物DC 5329、DC 7439-146和DC 2-5695是式(XI)的化合物，其中分別地，A是22，B是2並且y是12；A是103，B是10並且y是12；A是27，B是3並且y是12。
化合物Q4-3667是式(IV)的化合物，其中A是15並且y是13。
2/在溫度低於或等於45℃時為液體的兩親型脂質具體地可選自-UNICHEMA公司出售的名為Prisorine 3644的、分子量為400的異硬脂酸聚乙二醇酯(CTFA名PEG-8Isostearate)；-SOLVAY公司出售的異硬脂酸二甘油酯；-SOLVAY公司出售的名為單月桂酸二甘油酯(Diglycerin-monolaurate)的、含有兩個甘油單元的月桂酸聚甘油酯(月桂酸聚甘油-2酯)；-ICI公司出售的名為SPAN 80的油酸山梨聚糖酯；-NIKKO公司出售的名為NIKKOL SI 10R的異硬脂酸山梨聚糖酯；-ULICE公司出售的α-丁基葡糖苷椰油酸酯或者α-丁基葡糖苷癸酸酯。
3/根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的脂肪酸和糖的酯，優選在溫度低於或等於45℃時為固體，並且具體地選自C8-C22脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或者果糖形成的酯或酯的混合物，以及C14-C22脂肪酸與甲基葡萄糖形成的酯或酯的混合物。
形成用於本發明的毫微乳劑的酯的脂肪單元的C8-C22或C14-C22脂肪酸含有飽和或不飽和的線性烷基鏈，其分別具有8-22或14-22個碳原子。酯的脂肪單元具體地可選自硬脂酸、山萮酸、花生四烯酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸及其混合物。優選使用硬脂酸。
作為脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或者果糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及單硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物，例如Croda公司出售的名為Crodesta F50、F70、F110和F160的產品，其HLB(親水-親脂平衡)分別是5、7、11和16；且作為脂肪酸和甲基葡萄糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及Goldschmidt公司出售的名為Tego-care 450的二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯。還可以提及葡萄糖或麥芽糖的單酯，例如o-十六烷醯-6-D-葡糖苷甲酯和o-十六烷醯-6-D-麥芽糖苷甲酯。
根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的脂肪醇和糖的醚，在溫度低於或等於45℃時為固體，且具體地選自C8-C22脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或者果糖形成的醚或醚的混合物，以及C14-C22脂肪酸與甲基葡萄糖形成的醚或醚的混合物。具體地是烷基聚葡糖苷。
形成用於本發明的毫微乳劑的醚的脂肪單元的C8-C22或者C14-C22脂肪醇含有飽和或不飽和的線性烷基鏈，其分別具有8-22或14-22個碳原子。醚的脂肪單元具體地可選自癸基、鯨蠟基、二十二烷基、二十烷基、硬脂基、棕櫚基、肉豆蔻基、月桂基、辛基和十六烷醯單元，以及它們的混合物，例如鯨蠟硬脂基(cetearyl)。
作為脂肪醇和糖形成的醚的例子，可以提及如癸基葡糖苷和月桂基葡糖苷的烷基聚葡糖苷，其例如由Henkel公司分別以商品名Plantaren 2000和Plantaren 1200出售的產品，任選作為與十六醇十八醇混合物的混合物的鯨蠟硬脂基葡糖苷，其例如由Seppic公司出售的Montanov 68、Goldschmidt公司出售的Tego-care CG90以及Henkel公司出售的Emulgade KE3302，以及二十烷基葡糖苷，例如Seppic公司出售的名為Montanov 202的花生醇和山萮醇與二十烷基葡糖苷的混合物的形式。
作為這種類型的非離子兩親型脂質，更具體地使用單硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物、二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯和烷基聚葡糖苷。
4/根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的甘油脂肪酸酯，在溫度低於或等於45℃時為固體，具體地可選自由至少一種含有16-22個碳原子的飽和線性烷基鏈的酸和1-10個甘油單元形成的酯。一種或多種這樣的甘油脂肪酸酯可用於本發明的毫微乳劑。
這些酯具體地選自硬脂酸酯、山萮酸酯、花生酸酯、棕櫚酸酯及其混合物。優選使用硬脂酸酯和棕櫚酸酯。
作為可用於本發明的毫微乳劑的表面活性劑的例子，可以提及單硬脂酸十甘油(10個甘油單元)酯、二硬脂酸十甘油(10個甘油單元)酯、三硬脂酸十甘油(10個甘油單元)酯和五硬脂酸十甘油(10個甘油單元)酯(CTFA名Polyglyceryl-10 stearate、Polyglyceryl-10 distearate、Polyglyceryl-10tristearate、Polyglyceryl-10 pentastearate)，例如Nikko公司分別以名稱NikkolDecaglyn 1-S、2-S、3-S和5-S出售的產品，以及單硬脂酸二甘油酯(CTFA名Polyglyceryl-2 stearate)，例如Nikkol公司以名Nikkol DGMS出售的產品。
根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的山梨聚糖脂肪酸酯，在溫度低於或等於45℃時為固體，具體地可選自由C16-C22脂肪酸和山梨聚糖形成的酯以及由C16-C22脂肪酸和山梨聚糖形成的氧乙烯化的酯。它們是由至少一種含有至少一條分別具有16-22個碳原子的飽和線性烷基鏈的脂肪酸和山梨糖醇或乙氧基化的山梨糖醇形成的。氧乙烯化的酯一般含有1-100個環氧乙烷單元，且優選2-40個環氧乙烷(EO)單元。
這些酯可具體地選自硬脂酸酯、山萮酸酯、花生酸酯、棕櫚酸酯及其混合物。優選使用硬脂酸酯和棕櫚酸酯。
作為可用於本發明的毫微乳劑的山梨聚糖脂肪酸酯以及氧乙烯化的山梨聚糖脂肪酸酯的例子，可以提及ICI公司以名Span 60出售的單硬脂酸山梨聚糖酯(CTFA名Sorbitan stearate)，ICI公司以名Span 40出售的單棕櫚酸山梨聚糖酯(CTFA名Sorbitan palmitate)，以及ICI公司以名Tween65出售的三硬脂酸山梨聚糖酯20EO(CTFA名Polysorbate 65)。
根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的乙氧基化的脂肪族醚，在溫度低於或等於45℃時為固體，優選為由1-100個環氧乙烷單元和至少一個具有16-22個碳原子的脂肪醇鏈形成的醚。醚的脂肪族鏈具體選自二十二烷基、二十烷基、硬脂基和鯨蠟基單元及其混合物，如鯨蠟硬脂基。作為乙氧基化的脂肪族醚的例子，可以提及含有5、10、20和30個環氧乙烷單元的山萮醇醚(CTFA名Beheneth-5、Beheneth-10、Beheneth-20、Beheneth-30)，例如Nikko公司以名Nikkol BB5、BB10、BB20和BB30出售的產品，以及含有兩個環氧乙烷單元的硬脂醇醚(CTFA名Steareth-2)，例如ICI公司以名Brij 72出售的產品。
根據本發明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質的乙氧基化的脂肪酸酯，在溫度低於或等於45℃時為固體，是由1-100個環氧乙烷單元和至少一個具有16-22個碳原子的脂肪酸鏈形成的酯。酯的脂肪族鏈具體選自硬脂基、二十二烷基、二十烷基和棕櫚基單元及其混合物。作為乙氧基化的脂肪酸酯的例子，可以提及含有40個環氧乙烷單元的硬脂酸酯，例如ICI公司以名Myrj 52(CTFA名PEG-40 stearate)出售的產品以及含有8個環氧乙烷單元的山萮酸酯(CTFA名PEG-8 behenate)，例如Gattefosse公司以名Compritol HD5ATO出售的產品。
5/根據本發明，可用作毫微乳劑的非離子兩親型脂質的環氧乙烷和環氧丙烷的嵌段共聚物，具體地可選自式(V)的嵌段共聚物HO(C2H4O)x(C3H6O)y(C2H4O)zH (V)其中x、y和z是整數，從而x+z的範圍為2-100，y的範圍為14-60，以及它們的混合物，且更具體選自HLB為2-16的式(V)的嵌段共聚物。
這些嵌段共聚物可具體選自泊洛沙姆，且具體選自泊洛沙姆231，如ICI公司以名Pluronic L81出售的式(V)(其中x＝z＝6，y＝39)(HLB2)的產品；泊洛沙姆282，如ICI公司以名Pluronic L92出售的式(V)(其中x＝z＝10，y＝47)(HLB6)的產品；以及泊洛沙姆124，如ICI公司以名Pluronic L44出售的式(V)(其中x＝z＝11，y＝21)(HLB16)的產品。
作為非離子兩親型脂質，還可提及文獻EP-A-705593中所述的非離子表面活性劑的混合物，此處將所述文獻引入作為參考。
在非離子兩親型脂質中，可具體使用-PEG400異硬脂酸酯或PEG-8異硬脂酸酯(含8mol環氧乙烷)，-異硬脂酸二甘油酯，-含有2單元甘油的單月桂酸聚甘油酯和含10單元甘油的硬脂酸聚甘油酯，-油酸山梨聚糖酯，-異硬脂酸山梨聚糖酯及其混合物。
根據本發明，非離子兩親型脂質在毫微乳劑中的含量相對於組合物的總重量為0.2重量％至12重量％，且優選為0.2重量％至8重量％，且更優選為0.2重量％至6重量％。
陽離子兩親型脂質選自下文所列的那些。
它們在本發明的毫微乳劑中存在的濃度，優選為相對於毫微乳劑的總重量的0.01至6重量％，且更優選為0.2至4重量％。
油根據本發明的毫微乳劑的油相中含有至少一種油。可用於本發明的毫微乳劑中的油優選自-動物或植物來源的油，其由脂肪酸和多元醇的酯構成，具體是液態的甘油三酯，例如葵花油、玉米油、大豆油、鱷梨油、霍霍巴油、骨髓油、葡萄子油、芝麻油、榛子油、魚油和glyceryl tricaprocaprylate，或式為R9COOR10的植物或動物油，其中R9代表含有7至29個碳原子的高級脂肪酸殘基，並且R10代表含有3至30個碳原子的線性的或分支的基於烴的鏈，具體是烷基或鏈烯基，例如purcellin油或液體霍霍巴木蠟；-天然的或合成的精油，例如桉葉油、雜燻衣草油、燻衣草油、韋惕蔚油、山蒼子油、檸檬油、檀香油(sandlewood oil)、迷迭香油、春黃菊油、香薄荷油、肉豆蔻油、肉桂油、海索草油(hyssop oil)、 蒿子油、橙油、香葉醇油、杜松油和香檸檬油；-合成油，例如parleam油、聚烯烴和液體羧酸酯；-礦物油，例如十六烷、異十六烷和石蠟油；-滷代油，具體是碳氟化合物，例如氟代胺(fluoroamine)，如全氟三丁胺，氟代烴，例如全氟代十氫化萘(perfluorodecahydro-naphthalene)、氟代酯和氟代醚；-揮發性或非揮發性的矽油。
可用作合成油的聚烯烴具體是聚α-烯烴，且更具體是那些氫化的或未氫化的聚丁烯類型，且優選氫化的或未氫化的聚異丁烯類型。
可用作合成油的液體羧酸酯可以是單羧酸酯、二羧酸酯、三羧酸酯或四羧酸酯。酯的總碳數目一般大於或等於10，且優選小於100，且更優選小於80。它們具體是飽和或不飽和的、線性的或分支的C1-C26脂族酸與飽和或不飽和的、線性的或分支的C1-C26脂族醇形成的單酯，酯的總碳數目一般大於或等於10。也可以使用C4-C22二羧酸或三羧酸與C1-C22醇形成的酯，以及一羧酸、二羧酸或三羧酸與C2-C26二羥基、三羥基、四羥基或五羥基醇形成的酯。
在上面所述的酯中，優選使用棕櫚酸烷基酯，例如棕櫚酸乙酯、棕櫚酸異丙酯、棕櫚酸2-乙基己酯、棕櫚酸2-辛基癸酯；肉豆蔻酸烷基酯，例如肉豆蔻酸異丙酯、肉豆蔻酸丁酯、肉豆蔻酸鯨蠟酯、肉豆蔻酸2-辛基十二醇酯；硬脂酸烷基酯，例如硬脂酸己酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸異丁酯；蘋果酸烷基酯，例如蘋果酸二辛酯；月桂酸烷基酯，例如月桂酸己酯和月桂酸2-己基癸酯；異壬酸異壬酯；辛酸鯨蠟酯。
有利地，根據本發明的毫微乳劑含有至少一種分子量大於或等於400的油，具體是400至10000，更好地是400至5000，或甚至為400至2500。分子量大於或等於400的油可選自動物或植物來源的油、礦物油、合成油和矽油，以及它們的混合物。作為這種類型的油，舉例來說，可以提及棕櫚酸異鯨蠟酯、硬脂酸異鯨蠟酯、鱷梨油和霍霍巴油。
根據本發明的毫微乳劑包含一定量的油相(除兩親型脂質之外的油和其它脂肪物質)，所述量優選相對於毫微乳劑的總重量為2-40重量％，且更具體是4-30重量％，且更優選是4-20重量％。
油相和兩親型脂質(非離子和離子的兩親型脂質)優選在根據本發明的毫微乳劑中按照油相的量和兩親型脂質的量的重量比為3至10存在，且更為優選的範圍是3至6。術語「油相的量」在本文中指的是這種油相的成分的總量，不包括兩親型脂質的量。根據本發明的毫微乳劑除了上述式(I)的尿素衍生物之外，如果必要的話，還可含有溶劑，具體用於提高組合物的透明度。
這些溶劑優先選自-C1-C8低級醇，例如乙醇；-二元醇，例如甘油、丙二醇、1，3-丁二醇、一縮二丙二醇或者含有4至16個，且優選8至12個環氧乙烷單元的聚乙二醇；-糖類，例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖或者蔗糖。
這些溶劑可作為混合物使用。當它們存在於本發明的毫微乳劑中時，可使用的濃度優選相對於毫微乳劑的總重量為0.01-30重量％，且更好地為相對於毫微乳劑的總重量的5-20重量％。醇和/或糖的量相對於毫微乳劑的總重量優選為5-20重量％，並且二元醇的量相對於毫微乳劑的總重量優選為5-15重量％。
製備方法製備上面所限定的毫微乳劑的方法是，將含有尿素衍生物的水相和油相在溫度範圍10℃-80℃下通過強烈攪拌進行混合，在大於5×107Pa的壓力下進行高壓勻漿步驟，且任選地加入所用的聚合物。根據本發明優選的實施方案，隨後在大於5×107Pa的壓力下再進行另外一個高壓勻漿步驟。高壓勻漿優選在壓力為6×107Pa至18×107Pa下進行。剪切優選為2×106s-1至5×108s-1，且更好地是1×108s-1至3×108s-1(s-1表示秒-1)。該方法使得可能生產出與熱敏的活性化合物相容的毫微乳劑，它可以含有油和具體的香料，其中含有脂肪物質，而不會使其變性。
毫微膠囊本發明的毫微膠囊是專利申請EP 0 447 318、EP 0 557 489、EP 0 780115、EP 1 025 901、EP 1 029 587、EP 1 034 839、EP 1 414 390、FR 2 830776、EP 1 342 471、FR 2 848 879和FR04/50057所描述的那些。
毫微膠囊是具有油質芯和聚合物殼的芯-殼顆粒。上述的各個申請涉及各族聚合物以及各種獲得它們的方法。膠囊的大小總是小於1μm，且其可能具有小於80nm的大小。這些顆粒可用層狀液晶相包被，所述液晶相最常見由卵磷脂或聚二甲基矽氧烷共聚醇組成。包被必須由在與水接觸時能夠自發形成層狀液晶相的兩親型脂質組成。向這種能夠形成層狀相的兩親型脂質加入能夠賦予顆粒(毫微膠囊)正ζ電勢的陽離子表面活性劑。形成層狀相的兩親型脂質與陽離子表面活性劑的重量比為99/1-75/25。
可用的陽離子表面活性劑如下文中所列。
有機顆粒本發明的有機顆粒是固體毫微球體(nanosphere)，其不具有內腔，可通過各種方法形成(在水中分散、毫微沉澱(nanoprecipitation)、微乳劑等)，並且由至少一種聚合物或者至少一種共聚物，或者它們的混合物組成。由於聚合物或共聚物是陽離子的，或者由於它(們)是非離子的且使用了如下文所述的陽離子表面活性劑，所以顆粒是陽離子的，具有上文限定的ζ電勢。陽離子表面活性劑的量相對於聚合物為0-25％。
無機顆粒本發明的陽離子無機顆粒舉例來說，可以基於矽石、TiO2、ZnO、氧化鋁等。例如，可以提及如Nalco公司的Nanomer 2顆粒的水中膠體分散體中的氧化鋁顆粒。Clariant和Grace也提供這種類型的顆粒。
可用於製備本發明的陽離子型顆粒的陽離子表面活性劑可根據本發明使用的陽離子表面活性劑在下文列舉，該列舉是非限制性的。
陽離子兩親型脂質優選選自季銨鹽和脂肪族胺及其鹽。
季銨鹽舉例來說為-具有如下式(IV)的那些 其中自由基R1至R4，可以是相同的或不同的，代表線性的或分支的含有1至30個碳原子的脂族自由基，或者芳族自由基，例如芳基或烷基芳基。脂族自由基可以含有雜原子，例如具體是氧、氮、硫或滷素。例如，脂族自由基選自下列自由基烷基、烷氧基、聚氧化(C2-C6)烯、烷基醯胺、(C12-C22)烷基醯胺-(C2-C6)烷基、乙酸(C12-C22)烷基酯、羥烷基，其含有約1至30個碳原子；X是選自滷化物、磷酸根、乙酸根、乳酸根、(C2-C6)烷基硫酸根以及烷基-或烷基芳基磺酸根的陰離子，-咪唑啉鹽的季銨鹽，例如，具有如下式(V)的那些 其中R5代表含有8至30個碳原子的鏈烯基或烷基自由基，例如衍生自動物脂肪酸的自由基，R6代表氫原子、C1-C4烷基自由基或者含有8至30個碳原子的鏈烯基或烷基自由基，R7代表C1-C4烷基自由基，R8代表氫原子或者C1-C4烷基自由基，且X是選自滷化物、磷酸根、乙酸根、乳酸根、烷基硫酸根以及烷基-或烷基芳基磺酸根的陰離子。優選地，R5和R6代表含有12至21個碳原子的鏈烯基或烷基自由基的混合物，例如由動物脂肪酸衍生而來的那些，R7表示甲基，且R8表示氫原子。舉個例子來說，所述產品是由REWO公司以名「REWOQUATW 75」出售的產品。
-具有式(VI)的季二銨鹽(quaternary diammonium)
其中R9代表含有約16到30個碳原子的脂族自由基，R10、R11、R12、R13和R14，可以相同或不同，選自氫或含有1至4個碳原子的烷基自由基，且X是陰離子，其選自滷化物、乙酸根、磷酸根、硝酸根以及甲基磺酸根。這樣的季二銨鹽具體包括丙烷動物脂聯銨二氯化物(propanetallowdiammonium dichloride)；-包含至少一種酯功能的季銨鹽可根據本發明使用的包含至少一種酯功能的季銨鹽是，例如，具有下式(VII)的那些 其中-R15選自C1-C6烷基自由基和C1-C6羥烷基或二羥烷基自由基；-R16選自-自由基 -基於線性或分支的、飽和或不飽和的C1-C22烴的自由基R20，-氫原子，-R18選自-自由基
-基於線性或分支的、飽和或不飽和的C1-C6烴的基團R22，-氫原子，-R17、R19和R21，可以相同或不同，選自基於線性或分支的、飽和或不飽和的C7-C21烴的自由基；-n、p和r，可以相同或不同，是2至6的整數；-y是1至10的整數；-x和z，可以相同或不同，是0至10的整數；-X-是簡單或複雜的有機或無機陰離子；限制條件是x+y+z的和是1至15，當x是0時，R16代表R20，且當z是0時，R18代表R22。
烷基自由基R15可以是線性或分支的，且更具體是線性的。
優選地，R15代表甲基、乙基、羥乙基或二羥丙基自由基，且更具體是甲基或乙基自由基。有利地，x+y+z的和是1至10。
當R16是基於烴的自由基R20時，它可以是長的且含有12至22個碳原子，或者是短的且含有1至3個碳原子。
當R18是基於烴的基團R22時，它優選含有1至3個碳原子。
有利的是，R17、R19和R21，可以相同或不同地，選自基於線性或分支的、飽和或不飽和的C11-C21烴類的自由基，且更具體是選自線性或分支的、飽和或不飽和的C11-C21烷基或鏈烯基自由基。
優選地，x和z，可以相同或不同地，是0或1。
有利地，y等於1。
優選地，n、p和r，可以相同或不同地，是2或3，且更具體等於2。
陰離子優選地是滷化物(氯化物、溴化物或碘化物)或者烷基硫酸根，更具體是甲基硫酸根。然而，可以使用甲磺酸根、磷酸根、硝酸根、甲苯磺酸根、衍生自如乙酸根或乳酸根的有機酸的陰離子，或者任何其它與包含酯功能的銨相容的陰離子。
陰離子X-更具體地是氯化物或甲基硫酸根。
更具體地使用具有式(VII)的銨鹽，其中-R15代表甲基或乙基自由基，
-x和y等於1；-z等於0或1；n、p和r等於2；-R16選自-自由基 -甲基、乙基或基於C14-C22烴的自由基；-氫原子；-R18選自-自由基 -氫原子R17、R19和R21，可以相同或不同，選自基於線性或分支的、飽和或不飽和的C13-C17烴的自由基，且更具體選自線性或分支的、飽和或不飽和C13-C17烷基或鏈烯基自由基。
有利地，基於烴的自由基是線性的。
例如，可以提及具有式(VII)的化合物，如二醯基乙氧基二甲銨、二醯基乙氧基羥基乙基甲基胺、單醯基乙氧基二羥乙基甲基胺、三醯基乙氧基甲銨和單醯基乙氧基羥基乙基二甲胺鹽(具體是氯化物或甲基硫酸鹽)及其混合物。醯基自由基優選含有14至18個碳原子，且更優選衍生自如棕櫚油或葵花油的植物油。
當化合物中含有幾個醯基自由基時，後者可以是相同或不同的。
這些產品可通過以下方式獲得，例如，通過三乙醇胺、三異丙醇胺、烷基二乙醇胺或烷基異丙醇胺在動物或植物來源的脂肪酸或脂肪酸的混合物中進行的直接酯化，任選地進行烷氧基化，或通過對它們的甲酯進行酯交換作用。酯化後使用烷化劑，例如滷代烷(優選甲基或乙基滷)、硫酸二烷基酯(優選硫酸甲酯或硫酸乙酯)、甲磺酸甲酯、對甲苯磺酸甲酯、氯乙二醇(glycol chlorohydrin)或氯甘油(glycerol chlorohydrin)進行的季銨化作用。
這些化合物舉例來說，為HENKEL公司出售的DEHYQUART、STEPAN公司出售的STEPANQUAT、CECA公司出售的NOXAMIUM以及REWOWITCO公司出售的REWOQUAT WE 18。
根據本發明的組合物優選含有季銨單酯、二酯和三酯鹽的混合物，其中按重量計大部分是二酯鹽。
作為銨鹽的混合物，例如，可以使用含有按重量計15-30％的醯基乙氧基乙基二羥基乙基甲基銨硫酸甲酯，45-60％的二醯基乙氧基羥基乙基甲基銨硫酸甲酯和15-30％的三醯基乙氧基甲基銨硫酸甲酯的混合物，其中醯基自由基含有14至18個碳原子並且衍生自任選部分氫化的棕櫚油。也可使用專利US-A-4 874 554和US-A-4 137 180中所述的包含至少一種酯功能的銨鹽。
在具有式(IV)的季銨鹽中，優選的是，首先，四烷基氯化銨，例如，二烷基二甲基氯化銨或烷基三甲基氯化銨，其中烷基自由基含有約12至22個碳原子，具體是二十二烷基三甲基氯化銨、二硬脂基二甲基氯化銨、鯨蠟基三甲基氯化銨或者苄基二甲基硬脂基氯化銨，或者其次，VANDYK公司以名「CERAPHYL 70」出售的硬脂醯胺丙基二甲基(乙酸肉豆蔻酯)氯化銨。
根據本發明，二十二烷基三甲基氯化銨或者二十二烷基三甲基溴化銨以及CTAB(鯨蠟基三甲基溴化銨)是最優選的季銨鹽。
本發明的脂肪族胺符合式 -R1是基於分支或不分支的、飽和或不飽和的烴的鏈，含有8至30個碳原子，且優選10至24個碳原子。
-R2和R3獨立地選自分支或不分支的、飽和或不飽和的烴，含有1至10個碳原子，且優選1至4個碳原子。
-R2和R3還可以相互獨立地對應於氫原子H。
-M為1至10，並且優選為1至5。
作為非限制性的例子，可提及硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇醯胺、硬脂基二乙醇醯胺、硬脂二亞乙基三胺、硬脂醯胺丙基二甲胺、硬脂醯胺丙基二乙胺、硬脂醯胺乙基二乙胺、硬脂醯胺乙基二甲胺、棕櫚醯胺丙基二甲胺、棕櫚醯胺丙基二乙胺、棕櫚醯胺乙基二乙胺、棕櫚醯胺乙基二甲胺、山萮酸醯胺丙基二甲胺、山萮酸醯胺丙基二乙胺、山萮酸醯胺乙基二乙胺、山萮酸醯胺乙基二甲胺、花生酸醯胺丙基二甲胺、花生酸醯胺丙基二乙胺、花生酸醯胺乙基二乙胺和花生酸醯胺乙基二甲胺。
作為商購可得的脂肪族胺，可提及Croda所售的Incromine BB、Nikkol所售的Amidoamine MSP以及Inolex所售的Lexamine。
至於其它的脂肪族胺，可提及例如硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇醯胺、硬脂基二乙醇醯胺以及硬脂二亞乙基三胺，其中尤其是Sabo公司銷售的Sabomina系列。
還可以提及如Kao Corp.的Acetamine系列的脂肪族胺乙酸鹽。
這些脂肪族胺也可以被乙氧基化，如Berol 380、390、453和455，Akzo Nobel的Ethomeens或者Condea Chemie的Marlazin L10、OL2、OL20、T15/2、T50。
本發明的顆粒還可以為了化妝、皮膚病學或眼的目的而引入到任何藥學載體中。可提及例如洗劑、血清、凝膠和所有類型的乳劑。
根據本發明的組合物可以是通常用於局部施用的任何藥學形式，例如溶液，凝膠，洗劑或血清類型的分散體，具有液體或半液體乳型稠度的乳劑，其由脂相分散於水相中(O/W)或反過來(W/O)而得到，或者具有軟的半固體的或固體的乳膏或凝膠類型稠度的懸浮液或乳劑，或者微乳劑，微膠囊，微粒或者離子和/或非離子類型的泡狀分散體。這些組合物通過常規的方法製備。
根據本發明的組合物也可以包含任何正常用於化妝或藥學領域的添加劑。
當然，本領域技術人員會注意這樣選擇這種或這些任選的額外的化合物，和/或其量，從而使根據本發明的組合物的有利的特性不會或基本上不會被削弱。
具體地，人們會注意保證這種引入不會損害與siRNA締合的陽離子型顆粒的穩定性。
根據本發明的組合物具體地可以包含化妝的或藥學活性的試劑。優選包括脫色劑、防曬劑。
可摻入該組合物的脫色劑包括，例如下列化合物曲酸；鞣花酸；熊果苷及其衍生物，如申請EP-895 779和EP-524 109中所描述的那些；氫醌；氨基苯酚衍生物，例如申請WO 99/10318和WO 99/32077所描述的那些，且具體是N-膽甾醇基氧羰基-對-氨基苯酚和N-乙基氧羰基-對-氨基苯酚；亞氨基苯酚衍生物，具體是在申請WO 99/22707中所描述的那些；L-2-氧代四氫噻唑-4-羧酸或前半胱氨酸，及其鹽或酯；抗壞血酸及其衍生物，具體是抗壞血酸葡糖苷；以及植物提取物，具體是甘草、桑樹和黃芩的提取物，該列舉不具有限制性。
防紫外線輻射劑可選自有機的防UV劑或無機的防UV輻射劑。
根據本發明的有機的防UV劑可以是水溶性的、脂溶性的或者在平常的化妝溶劑中不溶的。它們可具體選自鄰氨基苯甲酸鹽；肉桂衍生物；二苯甲醯甲烷衍生物；水楊酸衍生物，樟腦衍生物；如在專利申請US4,367,390、EP 863 145、EP 517 104、EP 570 838、EP 796 851、EP 775 698、EP 878 469和EP 933 376中所描述的三嗪衍生物；二苯甲酮衍生物，具體是在申請EP 1 046 391和DE 10012408中所描述的那些；丙烯酸β，β』-二苯基酯衍生物，苯並三唑衍生物，苯並咪唑衍生物；imadazolines；bisbenzoazolyl衍生物，例如在專利EP 669 323和US 2,463,264中所描述的那些；對氨基苯甲酸(PABA)衍生物；如在申請US 5,237,071、US 5,166,355、GB2303549、DE 19726184和EP 893 119所描述的亞甲基雙(羥苯基苯並三唑)衍生物；遮蔽聚合物和遮蔽矽氧烷，具體是在申請WO 93/04665中所描述的那些；如在專利申請DE 19855649中描述的α-烷基苯乙烯衍生的二聚體；和如在專利申請EP 0 967 200和DE 19755649中所描述的4，4-二芳基丁二烯衍生物。
無機遮蔽劑一般是有塗層或無塗層的金屬氧化物的色素或毫微色素(nanopigment)(初級顆粒的平均大小；一般為5nm至100nm，優選10nm至50nm)，例如，氧化鈦毫微色素(非晶態或晶態的金紅石和/或銳鈦礦形式)、氧化鐵毫微色素、氧化鋅毫微色素、氧化鋯毫微色素或者氧化鈰毫微色素，它們本身都是廣為人知的UV光保護劑。另外，常規的塗層劑是氧化鋁和/或硬脂酸鋁。具體地，這些有塗層或無塗層的金屬氧化物毫微色素可見於專利申請EP 0 518 772和EP 0 518 773的描述。
根據本發明的防輻射劑在根據本發明的組合物中存在的比例一般是相對於組合物總重量的0.1-20重量％，且優選為相對於組合物總重量的0.2-15重量％。
根據另一個目的，本發明還涉及至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達中的用途。
具體地，根據本發明的寡核苷酸可用作皮膚的漂白劑和/或抗褐變劑。
根據本發明的雙鏈RNA寡核苷酸還可以用於製備局部的、化妝品的或者皮膚病學的組合物，以用於降低黑色素合成，具體是以治療著色過度、色素形成斑以及皮膚變色為目的，或者用於毛囊漂白，由於黑色素細胞機能亢進而導致的局部著色過度，例如特發性黑斑病，發生於妊娠期間(「孕斑(pregnancy mask)」或者褐黃斑)或者oestro-progestin避孕期間，由於良性黑色素細胞機能亢進和增殖而導致的局限性著色過度，例如稱為光化性著色斑的老年色素形成斑，可能由於損傷後傷口癒合或者光敏作用而造成的偶發性著色過度，以及白斑病的特定形式，例如白癜風。對於後者(傷口癒合可能導致疤痕，這使皮膚呈現淺色外觀)，由於不可能使損傷的皮膚再次著色，那麼通過使剩餘的正常皮膚區進行脫色而完成所述方法，從而使皮膚整體呈現均一的白色。
本發明的另一個目的涉及化妝方法，其用於使膚色漂白和/或增亮和/或使褐色皮膚顏色均勻，其包括局部施用至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸。
優選地，寡核苷酸在局部組合物中以小於或等於1nM的濃度配製。
更優選地，寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合，所述顆粒選自上面所述的表面活性劑膠束、嵌段聚合物膠束、非離子和陽離子表面活性劑脂質體、非離子表面活性劑微囊、油質體、毫微乳劑顆粒、毫微膠囊、有機顆粒或無機顆粒。
為了化妝、皮膚病學、眼或藥物護理的目的，要避免侵入性方法，例如皮下或眼注射。與根據本發明的siRNA締合的陽離子型顆粒可以以懸浮液形式或摻合到化妝上可接受的載體，例如洗劑、血清、乳化的或非乳化的凝膠、油/水型乳劑、水/油型乳劑或多重型乳劑、微乳劑等形成，局部施用於皮膚或黏膜或眼內。
為促進與siRNA締合的顆粒的穿透，可修改水的滲透性；這樣，就有可能通過用Cortex technology的Tewameter TM210或Dermalab測量IWL(不顯性失水)來控制水的滲透性。
舉例來說，可使用以下方法-在施用根據本發明的組合物之前進行剝離(corneodisc，「塗劑」)、化學去皮或機械皮膚磨擦術；-用一種或多種具有脫脂效果的溶劑混合物預處理；-用去汙劑發泡產品清潔皮膚；-例如，通過用不透水的合成膜(例如，Blenderm)覆蓋要處理的皮膚表面或者通過應用一層凡士林進行封閉預處理和/或封閉後處理。其作用是阻斷皮膚天然的IWL並導致表皮脂質的水合過度而變得更加可通透。
在施用本發明的組合物之後，還可使用本領域技術人員公知的方法，所述方法促進皮膚中分子的穿透，例如，離子電滲療法或電穿孔法。
在體外皮膚模型的情況中，可應用下述處理-在沉積根據本發明的組合物之前，可通過改變介質(0.10-0.75mM代替1.5mM)或通過加入螯合劑而降低Ca2+含量。其效果是降低膜間的粘附，這樣就提高了皮膚的滲透性(Effects of extra-and intracellular calciumconcentration on DNA replication，lateral growth，and differentiation of humanepidermal cells in culture.Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol.1990；59(1)17-25)；-利用離子電滲療法、電穿孔法以及公知的任何方法來改變該模型的滲透性。
實施例1-配方陽離子膠束-實施例1辛基-β-葡糖苷/十六烷基三銨溴化物按摩爾比5/1E1100mM溶於蒸餾水中E250mM溶於蒸餾水中E325mM溶於蒸餾水中E412.5mM溶於蒸餾水中將2種表面活性劑(非離子+陽離子)溶於蒸餾水中。將SEQ ID NO.1的siRNA的懸浮液(20μM)以體積比(siRNA膠束)1∶1至1∶9加入，從而按比例降低膠束濃度。
-實施例2把癸基-β-葡糖苷/二十二烷基三銨氯化物膠束按摩爾比5/1溶於蒸餾水中。按前面實施例中的相同濃度製備。
這兩種懸浮液可應用於皮膚來治療色素形成斑和皮膚變色或者用於漂白毛囊。
陽離子脂質體-實施例1「液體」小泡PEG 400異硬脂酸酯5.5％二十二烷基三銨氯化物 0.5％蒸餾水 qs 100-實施例2「剛性」小泡棕櫚酸山梨聚糖酯 2.75％膽固醇 2.75％二十二烷基三銨氯化物 0.5％蒸餾水 qs 100這些脂質體懸浮液的例子是通過透析而實現的。把構成小泡的脂質溶於辛基-β-葡糖苷的水溶液中。然後使該溶液對水透析72小時。
然後加入SEQ ID NO.4的siRNA懸浮液，使濃度相對於小泡約為3％的脂質。該非離子脂質體懸浮液可以施用於皮膚以用於治療色素形成斑和皮膚變色或者用於漂白毛囊。
陽離子油質體-油相Stéaraineries Dubois所售的單硬脂酸蔗糖酯 0.45％硬脂酸山梨聚糖酯4EO(Tween 61 Uniquema) 0.30％二十二烷基三銨氯化物 0.21％乙酸維生素E0.5％霍霍巴油 0.5％庚酸十八酯 1％揮發性矽油 1％維生素E甘油酯 0.5％防腐劑 0.02％BHT0.01％-水相蒸餾水 qs 100防腐劑 0.1％該分散體通過高壓勻漿實現，目的是使顆粒大小約170nm。然後以1∶1至1∶20(siRNA/油質體)的比例加入SEQ ID NO.16的siRNA懸浮液(20μM)。siRNA就會與顆粒的表面複合。
陽離子毫微膠囊-有機相聚己酸內酯(MW50000) 1％維生素E1％聚二甲基矽氧烷共聚醇DC25695(Dow Corning) 0.5％二十二烷基三銨氯化物 0.21％丙酮 200ml-水相
Pluronic F68 0.5％蒸餾水 200ml把有機相在攪拌下引入水相中。然後使丙酮和100ml水相蒸發掉，從而得到毫微膠囊的懸浮液，其大小是220nm。然後以1∶1至1∶20(siRNA/毫微膠囊)的比例加入SEQ ID NO.37的siRNA懸浮液(20μM)。於是siRNA就會與顆粒的表面複合。
有機納米顆粒(nanoparticle)-有機相聚己二酸亞乙基酯(Scientific Polymer產品) 2％聚二甲基矽氧烷共聚醇DC25695(Dow Corning) 0.5％二十二烷基三銨氯化物 0.21％丙酮 200ml-水相Pluronic F68 0.5％蒸餾水 200ml把有機相在攪拌下引入水相。然後使丙酮和100ml水相蒸發掉，從而得到納米顆粒的懸浮液，所述納米顆粒的大小是180nm。然後以1∶1至1∶20(siRNA/納米顆粒)的比例加入SEQ ID NO.40的siRNA懸浮液(20μM)。於是siRNA就會與顆粒的表面複合。
陽離子毫微乳劑-油相Uniqema所售PEG 400異硬脂酸酯 1％二十二烷基三銨氯化物 1％鱷梨油 1％霍霍巴油 3％環五甲基矽氧烷 2％-水相蒸餾水 30％一縮二丙二醇 10％-稀釋相蒸餾水 qs 100％防腐劑 0.1％乳劑通過將油相在非常強烈的攪拌下分散在水相中製備。然後將得到的懸浮液使用非常高壓力的勻漿器在壓力約1200b下勻漿幾次。顆粒的大小達到50nm量級並且懸浮液是透明的。然後加入稀釋相。
如前面的例子一樣，然後以1∶1至1∶20(siRNA/毫微乳劑)的比例加入SEQ ID NO.42的siRNA懸浮液(20μM)。於是siRNA就會與顆粒的表面複合。
實施例2-根據本發明的siRNA的活性測量根據本發明的序列為SEQ ID NOS 1-47的47種siRNA的有效性利用Invitrogen開發的「pSCREEN-iTTM系統」測試進行評價，該系統用於評價對酪氨酸激酶抑制的有效性(GenBank登記號M27160)。
測試的實驗方案·在48孔板中接種2×104A549細胞/孔並培養過夜。
·用2μg/ml的Lipofectamine 2000(Invitrogen)與下面的三種試劑複合一式三份地進行共轉染5小時·與LacZ基因偶聯的酪氨酸酶pScreen-iTTM載體-10ng/孔·螢光素酶報告質粒-20ng/孔·1nM StealthTMRNA(表I中給出的序列)·將細胞在轉染後24小時進行裂解，並測量β-半乳糖苷酶(β-Gal)和螢光素酶(Luc)的活性。β-Gal/Luc的比率決定了酪氨酸酶抑制的百分比。
表II給出了得到的結果。
表II對47種雙鏈RNA寡核苷酸降解酪氨酸酶mRNA(GenBank登記號M27160)的有效性的測定。
其次，對於20種最有效的序列，也就是其在1nM下有效性大於91％的序列測定了劑量效應。結果在表III中給出。
Table III用0.0016nM至1nM的劑量通過劑量效應對20種選擇的序列的有效性的測定。
本發明的siRNAs中20種最有效的序列在1nM時表現出的有效性超過94％。測試的最低劑量是0.016nM，其對應於降解編碼酪氨酸酶的mRNA的有效性為72％。
實施例3-對根據本發明的siRNA引發的可能干擾素類型應答進行的評價本發明主題的siRNAs經證實不會引發幹擾素類型的應答。為此，利用定量PCR(qPCR)測量了OAS-1和IFIT-1(幹擾素誘導型三十四肽重複結構域)基因的表達，它們是公知的由幹擾素誘導的(Wieland SE等，Searching for Interferon-Induced Genes That Inhibit Hepatitis B Virus Replication inTransgenic Mouse Hepatocytes，J.of Virology 2003；771227-1236。PersengievSP等，Nonspecific，concentration-dependent stimulation and repression ofmaminalian gene expression by small interfering RNAs(siRNAs).RNA 2004；1012-18。Bridge AJ等，Induction of an interferon response by RNAi vectors inmammalian cells.Nature Genet.2003；34263-264。Scacheri PC等，Shortinterfering RNAs can induce unexpected and divergent changes in the levels ofuntargeted proteins in mammalian cells.Proc.Natl.Acad Sci.USA 2004，1011892-1897。Sledz CA等，Activation of the interferon system by short-interferingRNAs.Nat Cell Biol.2003；9834-9。Patzwahl R等，Enhanced expression ofinterferon-regulated genes in the liver of patients with chronic hepatitis C virusinfectiondetection by suppression-subtractive hybridization.J Virol.2001；751332-1338。)，測量的方法按照由Invitrogen銷售的「BLOCK-iTTMRNAiStress Response Control Kit(human)for monitoring interferon-mediated stressresponse to double-stranded RNA in human cells」中所描述的方案。
hOAS-1基因表達水平的測量hOAS-1基因的表達水平與GAPDH參考基因表達水平相關。
結果只有陽性對照(1kb的長dsRNA)誘導了hOAS-1基因表達的明顯提高。測試的序列(SEQ ID NOS.1、2、4、13和46)都沒有明顯地提高hOAS-1基因的表達。
hIFIT-1基因表達水平的測量
結果只有陽性對照(1kb的長dsRNA)明顯誘導了hIFIT-1基因的表達，其在約25的閾周期值檢測到。測試的序列(SEQ ID NOS.1、2、4、13和46)誘導hIFIT-1基因表達的閾周期值只有約32-36，也就是說7-11個周期的差異對應於信使的量低了102-103倍。
這些測定使得可能推斷，根據本發明的dsRNA不會誘導幹擾素類型的應答。
序列表110L』Oréal SA120抑制酪氨酸酶表達的雙鏈RNA寡核苷酸130OA05362/CB16048170PatentIn version 3.3210121125212DNA213智人(Homo sapiens)4001gcguaauccu ggaaaccaug acaaa 25210221125212DNA213智人(Homo sapiens)4002gccuaccuca cuuuagcaaa gcaua 25210321125212DNA213智人(Homo sapiens)4003ccugugucuc cucuaagaac cugau 25210421125212DNA213智人(Homo sapiens)
4004ccauagggac cuauggccaa augaa 25210521125212DNA213智人(Homo sapiens)4005ccgauuggag gaguacaaca gccau 25210621125212DNA213智人(Homo sapiens)4006ggaccuuuac ggcguaaucc uggaa 25210721125212DNA213智人(Homo sapiens)4007ggcguaaucc uggaaaccau gacaa 25210821125212DNA213智人(Homo sapiens)4008ccugucagaa uauccuucug uccaa 25210921125212DNA213智人(Homo sapiens)
4009ccuggaaacc augacaaauc cagaa 252101021125212DNA213智人(Homo sapiens)40010ccaauaugaa ucugguucca uggau 252101121125212DNA213智人(Homo sapiens)40011gguuccaugg auaaagcugc caauu 252101221125212DNA213智人(Homo sapiens)40012gcaaagcaua ccaucagcuc agacu 252101321125212DNA213智人(Homo sapiens)40013ggaguacaac agccaucagu cuuua 252101421125212DNA
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212DNA213智人(Homo sapiens)40019gaccuuuacg gcguaauccu ggaaa 252102021125212DNA213智人(Homo sapiens)40020gccuuggcau agacucuucu uguug 252102121125212DNA213智人(Homo sapiens)40021gcacagauga guacauggga gguca 252102221125212DNA213智人(Homo sapiens)40022gagagacgac ucuuggugag aagaa 252102321125212DNA213智人(Homo sapiens)40023gaggaguaca acagccauca gucuu 2521024
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caacagccau cagucuuuau gcaau 252104421125212DNA213智人(Homo sapiens)40044gcauaccauc agcucagacu auguc 252104521125212DNA213智人(Homo sapiens)40045ccaucagucu uuaugcaaug gaacg 252104621125212DNA213智人(Homo sapiens)40046ggaucaacac ccauguuuaa cgaca 252104721125212DNA213智人(Homo sapiens)40047cagagguucc ugucagaaua uccuu 252104821119212DNA213智人(Homo sapiens)
40048ugcaccacuu gggccucaa 19
權利要求
1.組合物，其包含至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸，所述寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合。
2.根據權利要求1的組合物，其特徵在於該寡核苷酸通過在2』-位置添加-O-甲基基團而被修飾。
3.根據權利要求1或2的組合物，其特徵在於該雙鏈RNA寡核苷酸存在的濃度小於或等於100μM。
4.根據權利要求1-3任一項的組合物，其特徵在於該陽離子型顆粒選自表面活性劑膠束、嵌段聚合物膠束、非離子和陽離子表面活性劑脂質體、非離子表面活性劑微囊、油質體、毫微乳劑顆粒、毫微膠囊、有機顆粒或無機顆粒。
5.根據權利要求1-4任一項的組合物，其特徵在於該陽離子型顆粒的大小小於或等於500nm。
6.根據權利要求1-5任一項的組合物，其特徵在於該陽離子型顆粒的大小小於或等於300nm。
7.根據權利要求1-6任一項的組合物，其特徵在於該陽離子型顆粒是非離子兩親型表面活性劑和陽離子表面活性劑形成的膠束。
8.根據權利要求1-6任一項的組合物，其特徵在於該嵌段聚合物膠束選自陽離子兩親型嵌段聚合物膠束、非離子兩親型嵌段聚合物和陽離子兩親型嵌段聚合物形成的膠束以及非離子兩親型嵌段聚合物和陽離子表面活性劑形成的膠束。
9.至少一種選自SEQ ID NOS.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達中的用途。
10.至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達中的用途，其特徵在於所述的寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合。
11.根據權利要求9或10的用途，作為用於皮膚的漂白劑和/或作為抗褐變劑。
12.根據權利要求9-11任一項的用途，用於預防形成和/或消除色素形成斑，和/或老年斑，和/或用於增亮和/或漂白褐色皮膚和/或使褐色皮膚顏色均勻。
13.至少一種選自SEQ ID NOS.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在製備用於皮膚脫色的組合物中的用途。
14.至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在製備用於皮膚脫色的組合物中的用途，其特徵在於所述的寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合。
15.根據權利要求14的用途，其特徵在於該組合物用於治療特發性黑斑病、妊娠或者oestro-progestin避孕相關的著色過度、偶發性著色過度、由白斑病和/或白癜風引起的著色過度。
16.用於漂白和/或增亮膚色和/或使褐色皮膚顏色均勻的化妝方法，其包括局部施用至少一種選自SEQ ID NOS.2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸。
17.用於漂白和/或增亮膚色和/或使褐色皮膚顏色均勻的化妝方法，其包括局部施用至少一種選自SEQ ID NOS.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48的序列的雙鏈RNA寡核苷酸，其特徵在於所述的寡核苷酸與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10-80mV的陽離子型顆粒締合。
18.根據權利要求16或17的方法，其特徵在於所述的寡核苷酸以小於或等於100μM的濃度配製在局部組合物中。
19.根據權利要求16-18任一項的方法，其特徵在於局部施用前進行選自剝離、化學去皮、機械皮膚磨擦術、施用一種或多種具有脫脂效果的溶劑以及用去汙劑發泡產品清潔皮膚的皮膚預處理。
20.根據權利要求16-19任一項的方法，其特徵在於局部施用後進行封閉的後處理。
全文摘要
本發明涉及新的用於降低酪氨酸酶表達的雙鏈RNA寡核苷酸，其在化妝和/或藥學目的上的用途，以及它與大小小於或等於1μm、ζ電勢為10－80mV的陽離子型顆粒的締合。
文檔編號A61K9/127GK1966084SQ20061014475
公開日2007年5月23日 申請日期2006年9月20日 優先權日2005年9月21日
發明者C·科林-迪詹戈恩, J·-T·斯蒙納特 申請人:萊雅公司