一種大規模合成長鏈核酸分子的方法

2023-05-27 17:20:51

專利名稱：一種大規模合成長鏈核酸分子的方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸分子的合成方法，特別涉及一種由短鏈核酸分子合成長鏈核酸分子的大規模、低成本、高效率合成方法。
背景技術：
近年來，合成生物學的發展速度迅猛。生物能源、醫藥中間體等均可以通過合成基因的手段，達到改變細菌或細胞的代謝過程。例如，2006年，科學家利用工程酵母合成青蒿素中間體，將產率提高115毫克/毫升。2009年，Church小組通過一組寡核苷酸片段修飾基因組，加快大腸桿菌進化，使得番茄紅素Lycopene的產率增加五倍。更為令人振奮的是，科學家已經開始通過合成手段來合成完整的基因組，並以此構建新的生命體。2008年，科學家第一次合成了基因組長度具有582kb的生殖支原體(Mycoplasma genitalium)。2010年5月，科學家組裝修飾了一個基因組(有一百萬個鹼基組成)並將其植入到細菌中以此產生一個能夠自我複製的蕈狀支原體。這些成果表明，在·不久的將來，我們可以完全按照自己的意願來改造生命。基因合成的不斷成熟是合成生物學迅猛的關鍵之一。特別是近年來，DNA晶片技術的發展使得大規模合成基因成為可能。現在，在一張晶片上，可以同時合成上百萬寡核苷酸序列。然而這些寡核苷酸序列太短，一般在60bp到200bp之間。如何將這些短的片段變成足夠長度有效的基因(大於Ikb)，特別是如何有效地獲得成千上萬條條長片段基因是當前合成生物學研究領域的熱點和難點之一。解決這一難題的策略有兩個一是繼續提高寡核苷酸的合成能力，增加每條寡核苷酸的長度；二是，基於現有技術，開發有效的組裝方法，實現平行組裝上千萬條長片段基因。事實上，這兩種策略並不矛盾，有可能相互整合。但是，前者很大程度上依賴於技術的突破。而最近兩個工作證明後者，在操作上更為可行性。Church等利用選擇性放大部分寡核苷酸序列方法，先建立亞文庫，再進行組裝的策略，實現了合成47個基因(共35kb)。TianJindong小組等將晶片預先分成若干個物理單元，進行平行合成、放大以及組裝的方法，同樣實現74個基因(共30kb)的合成。然而，Church和Tian Jindong等人的工作,在合成的通量上(最大合成的數目)仍然具有很大的局限性，必須分步實現上千基因的合成；此外這些方法合成基因的成本上也較高，還有很大的提高餘地。本發明專利提出一種更為簡單可行的組裝方法，可平行實現多個基因的組裝。

發明內容
本發明的目的正是為了解決上述技術問題，提供一種新型寡核苷酸組裝合成長鏈核酸分子的方法。本發明採用核酸連接-純化-放大(Ligation-Puficaion-Amplification，or LPA)技術，使得寡核苷酸片段(30bp-200bp之間)有效地組裝合成長片段基因(500bp-lkbp)，進一步通過核酸擴增手段增加長片段基因的產量。利用該技術可方便、有效地從事寡核苷酸片段的組裝、純化和放大等操作，排除隨機組裝產物、不完全連接產物以及錯配組裝產物等副產物，實現三條或更多條基因的同時組裝和放大。為了純化簡單起見，採用固相連接-純化方法，即將核酸分子固定在磁珠等固相顆粒表面，達到從連接反應中快速、簡單分離純化產物的目的。在本發明中，術語「核苷酸序列」或「核酸分子」指的是核糖核酸(RNA)、脫氧核糖核酸(DNA)以及它們的衍生物或雜合體等。「固定化」(immobilize)指的是核酸分子(包括但不限於DNA、RNA等)通過化學基團(如氨基-NH2)與固態物體上的化學基團(如羧基-C00H)通過化學反應(如氨基與羧基脫去一分子水)形成共價鍵，從而將核酸分子與塊狀固體緊密連接在一起；或者指溶液中的核酸分子通過高親和分子(包括但不限於biotin與avidin或streptavidin)之間的相互作用與固態物體連接在一體；或者指溶液中的核酸分子與已經固定化到高分子塊體
上的純化序列通過鹼基配對生成氫鍵緊密連接在一起。因此，「固定化」不同於物理的吸附或粘附，通常的洗滌方式可以將吸附或粘附在高分子塊體上的雜質洗去，卻不能洗去「固定化」到高分子塊體上的核酸分子。核酸擴增方法，是指任何基於核酸模板，實現核酸擴增放大的方法，包括但不限於聚合酶鏈式反應(PCR)、轉錄、等溫擴增等方法。「聚合酶鏈式反應(PCR) 」，又稱體外DNA擴增技術，包括變性、退火和延伸三個步驟。用於DNA模板等擴增放大。本發明採用的技術方案如下。一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的設計及合成設計一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列，將所述核苷酸序列的雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段，合成小片段核酸分子的方法已經非常成熟，而且成本很低，如上百萬條60bp的寡核苷酸片段只需幾千元人民幣，每一個鹼基不足O. 01分；2)端點的化學修飾將位於上述核苷酸序列端點位置的4條小片段核酸分子中的至少一條的端點一該端點同時也是上述核苷酸序列的端點一進行化學修飾，使其帶有可以發生生物和/或化學反應的化學基團和/或生物分子，上述進行了化學修飾的小片段核酸分子稱為「純化序列」 ；3)短鏈核酸分子片段的連接步驟I合成得到的包括上述純化序列的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；4)純化準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，上述化學基團和/或生物分子能夠與純化序列上的化學基團和/或生物分子連接，將該塊狀固體加入步驟3得到的含有長鏈核酸分子的溶液中進行孵育，包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列將通過純化序列上的化學基團和/或生物分子固定化到固體表面，分離得到塊狀固體，衝洗塊狀固體；5)擴增利用核酸擴增技術對固定化到塊狀固體表面的包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列進行擴增放大；任選的步驟6)剪切通過酶切除核苷酸序列中除目標長鏈核酸分子之外多餘的核苷酸片段，得到目標核酸分子。上述技術方案與現有技術的最大區別在於其在擴增放大步驟之前進行了純化。由於核苷酸的互補配對存在一定的錯配率，因而通過核苷酸互補配對將短鏈核酸分子連接成長鏈的核酸分子的時候，並不是所有的產物都是目標核酸分子，如果不加以純化便對其進行擴增放大的話，擴增產物中的非目標長鏈核酸分子將更多，不但浪費了大量的原料，而且大大增加了分離難度與成本。然而，在本申請之前，本領域似乎形成了一種技術偏見，研究者形成了這樣一種定勢思維合成得到長鏈核酸分子之後立即進行擴增放大，因而當有研究者嘗試將長鏈核酸分子劃分為短鏈核酸分子，然後由短鏈核酸分子連接合成長鏈核酸分子的時候，他們發現擴增放大之後的體系中目標核酸分子的含量很少，產率很低，成本非常高。本申請的發明人在研究過程中考慮到，可能是擴增放大步驟之前存在於體系中的非目標核酸分子導致了最終體系中的大量非目標連接產物，當發明人嘗試在擴增放大步驟之前預先對核酸分子進行純化的時候，驚奇地發現擴增放大產物中的非目標核酸分子的含量減小了數千萬倍，從而使得合成效率大大提高，同時合成成本大幅下降。對核酸分子進行純化可以採用傳統的HPLC、PAGE、毛細管電泳或者凝膠電泳等方法，將不同長度的核酸分子分離開，也可以採用發明人設計的固相分離方法，具體操作是先將位於包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列端點位置的4條小片段核酸分子中的至少一條的端點一該端點同時也是上述核苷酸序列的端點一進行化學修飾，使其帶有可以發生生物和/或化學反應的化學基團和/或生物分子，上述進行了化學修飾的小片段核酸分子稱為「純化序列」;然後準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，上述化學基團和/或生物分子能夠與純化序列上的化學基團和/或生物分子連接，將該塊狀固體加入含有「包含長鏈核酸分子的核·苷酸序列」的溶液中進行孵育，上述核苷酸序列將通過純化序列上的化學基團和/或生物分子固定化到固體表面，分離得到塊狀固體，衝洗塊狀固體，便可以將非目標產物(通常是物理吸附到塊狀固體表面，或者連接到塊狀固體表面但是核酸分子上存在未連接的缺口)衝洗掉，於是塊狀固體上固定化的核酸分子便基本全是包含目標核酸分子的核苷酸序列了，如此便簡單地實現了核酸分子的純化，使得擴增放大的準確率大大提高。當然，上述固相分離也可以在將短鏈核酸分子片段連接成長鏈核酸分子之前進行，先將塊狀固體與純化序列一起孵育，使純化序列固定化到塊狀固體表面，然後將塊狀固體與其他短鏈核酸分子一起在核酸分子連接酶的作用下連接成長鏈核酸分子，同樣可以簡單地對塊狀固體進行衝洗以達到純化的目的。具體操作步驟如下一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的設計及合成設計一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列，將所述核苷酸序列的雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段；2)端點的化學修飾將位於上述核苷酸序列端點位置的4條小片段核酸分子中的至少一條的端點一該端點同時也是上述核苷酸序列的端點一進行化學修飾，使其帶有可以發生生物和/或化學反應的化學基團和/或生物分子，上述進行了化學修飾的小片段核酸分子稱為「純化序列」;3)短鏈核酸分子片段的連接準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，上述化學基團和/或生物分子能夠與純化序列上的化學基團和/或生物分子連接，將該塊狀固體加入步驟2得到的純化序列的溶液中進行孵育，純化序列將通過其上的化學基團和/或生物分子固定化到固體表面，將上述孵育後的塊狀固體與步驟I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；4)純化分離得到塊狀固體，衝洗塊狀固體；5)擴增利用核酸擴增技術對固定化到塊狀固體表面的目標長鏈核酸分子進行擴增放大；任選的步驟6)剪切通過酶切除核苷酸序列中除目標長鏈核酸分子之外多餘的核苷酸片段，得到目標核酸分子。而如果採用常規的純化方法，則步驟如下一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的合成將目標長鏈核酸分子雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段；2)短鏈核酸分子片段的連接步驟I合成得到的小片段核 酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；3)純化利用HPLC、PAGE、毛細管電泳或者凝膠電泳等方法對步驟2的產物進行純化，分離得到目標長鏈核酸分子；4)擴增利用核酸擴增技術對步驟3純化得到的目標長鏈核酸分子進行擴增放大。步驟I中所述「一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列」可以是目標長鏈核酸分子本身。這樣最後的步驟6便可以省略，步驟5直接得到目標長鏈核酸分子。或者，步驟I中所述「一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列」由目標長鏈核酸分子及位於目標長鏈核酸分子兩端的PCR引物序列和純化序列組成。這樣設計的好處是，不同的目標長鏈核酸分子可以使用同樣的純化序列、在步驟5進行PCR擴增時將用到的PCR引物序列，這樣有利於進一步降低成本。優選地，可以在純化步驟之前進一步包括轉錄步驟，如此能更進一步地提高擴增方法的準確率，進一步降低成本。優選地，步驟I中將目標核酸分子雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開至少3個核苷酸，優選彼此錯開至少5個核苷酸，進一步優選彼此錯開至少7個核苷酸，最優選彼此錯開至少9個核苷酸。劃分點錯開較多，則錯配的機率變小，合成的準確度增加。優選地，所述長鏈核酸分子包括至少700個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目< 150 ;或者所述長鏈核酸分子包括至少1000個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目(100。現有技術中合成200個核苷酸以下的核酸分子技術已經很成熟，成本也相當低，利用本發明的方法可以將這些容易獲得的短鏈核酸分子連接為想要的長鏈的核酸分子，現有技術的方法合成700個、1000個以上或者更長的核酸分子成本非常高，利用本發明的方法可以大大降低成本。優選地，所述塊狀固體包括磁性材料、矽、二氧化矽、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。實際上，任何已知的固體材料，只要其表面可以進行化學修飾或者連接生物基團，都可以使用。優選地，純化序列修飾有生物素(biotin)，塊狀固體表面修飾有鏈酶親和素(streptavidin);或者純化序列修飾有氨基，塊狀固體表面修飾有羧基；或者純化序列修飾有羧基，塊狀固體表面修飾有氨基；或者純化序列修飾有疊氮化物(azide)，塊狀固體表面修飾有炔烴(alkyne);或者純化序列修飾有炔烴，塊狀固體表面修飾有疊氮化物。優選地，核酸分子連接酶可以是T4連接酶或Taq連接酶。本發明所產生的技術效果是非常顯著而且振奮人心的，現有技術合成較短的核酸分子(核苷酸數目在200以下)技術較成熟，成本也較低，然而進一步合成更長的核酸分子(500個核苷酸以上)時成本急劇增加，雖然有研究者利用不同策略合成得到了一定數量的基因(如Tian Jindong等人利用物理空間分隔一次得到74個基因，約30kb)，然而這些工作所能完成的通量仍然受操作的複雜程度和成本的制約。而本發明由於在對連接產物進行擴增之前預先進行了純化，保證了所有連接反應、純化反應、擴增反應可以平行針對所有產物同時進行，沒有增加太多額外的操作和成本，實現了大通量、大規模的長鏈核酸合成。


圖I本發明的寡核苷酸片段(即短鏈核酸分子)組裝成長鏈核酸分子的示意圖。主要包括三步寡核苷酸片段的連接，連接產物的純化以及放大。一組寡核苷酸片段充分混合後，進行磷酸化處理。為方便下一步對連接產物進行純化起見，其中一條寡核苷酸鏈的5』端帶有生物素(biotin)。這些序列經過退火(annealing),在T4連接酶或Taq連接酶的作用下，形成完整的雙鏈。隨後，加入帶streptavidin修飾的磁珠進行純化,這樣可以有效地 去除反應底物、錯誤連接產物以及沒有連接完全的雙鏈。最後，通過PCR等核酸擴增方式，將進行純化好的產物擴增放大。圖2單一 554bp核酸片段的獲得。一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)和純化序列(見表I)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一 554bp核酸片段(經過測序確認)。每條DNA片段的起始量可以低至O.Olfmol，仍然可以得到連接產物。圖3單一 731bp核酸片段的獲得。一組25bp-60bp的核酸片段(23條)、接頭序列(I和2)和純化序列(見表2)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一 731bp核酸片段(經過測序確認)。每條DNA片段的起始量可以低至O.Olfmol，仍然可以等到連接產物。圖4單一 1026bp核酸片段的獲得。一組25bp-60bp的核酸片段(33條)、接頭序列(I和2)和純化序列(見表3)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一 1026bp核酸片段(經過測序確認)。圖5存在幹擾片段下，單一片段554bp核酸片段的獲得。一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)、純化序列(I條)(表I)以及一組幹擾序列(12條)(見表4)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一完全正確的554bp核酸片段(經克隆測序確認)。圖6存在幹擾片段下，單一片段731bp核酸片段的獲得。一組25bp_59bp的核酸片段(23條)、接頭序列(I和2)、純化序列(I條)以及一組幹擾序列出條)(見表5)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一完全正確的731bp核酸片段(經克隆測序確認)。圖7存在幹擾片段下，單一片段1026bp核酸片段的獲得。一組25bp-60bp的核酸片段(33條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)以及一組幹擾序列出條)(見表6)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得單一完全正確的981bp核酸片段(經克隆測序確認)。圖8存在幹擾片段下，同時獲得554bp、731bp、1026bp三條核酸片段。一組25bp_59bp的核酸片段(17+23+33 = 73條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)以及一組幹擾序列(12+6+6=24條)(見表1-6)，經過圖I連接、純化、放大三步操作，獲得三條完全正確核酸片段，分別為554bp，731bp，1026bp (經克隆測序確認)。
具體實施例方式以下將通過具體的實施例說明本發明，但是這些具體的實施例不應當理解為對本發明的限制，對某些細節進行修改將仍然落入本發明的保護範圍之內。材料和方法一組DNA片段溶解充分混合後，稀釋到IOOfmol/ μ I。按照產品要求，利用Τ4寡聚核苷酸激酶(Polynucleotide kinase, NEB)對所有DNA片段進行磷酸化處理，然後在37°C孵育I個小時。磷酸化後，DNA片段進一步稀釋到每一條的含量為lfmol。同時，將Tl磁珠(Dynal)與5』端修飾生物素的DNA探針在室溫下孵育15分鐘，然後用緩衝液清洗三次。將DNA片段溶液與固定化了「純化序列」的磁珠混合，在65°C下孵育兩個小時。為了保證DNA鏈間充分雜交，整個反應器在220轉/分鐘震蕩。然後將反應器緩慢降溫至室溫，清洗磁珠，除去多餘的DNA片段。最後，在T4或Taq連接酶的作用下，將磁珠上雜交好 的DNA，進行過夜連接。為了大量獲得連接好的DNA產品，下一步我們將它們進行必要的擴增。常用的方法包括PCR、轉錄等各種擴增方式，或者可以將兩種方式相互結合使用進行擴增。最後將放大產物進行純化，克隆和測序。從實施例1-7的結果(實驗結果見圖1-8及

)可以看出，即使DNA片段的起始量低至O. Olfmol的時候，依然可以得到目標DNA分子，這一點對於基於晶片合成的核酸製備非常重要。由於現階段晶片大規模合成小核酸分子方法得到每一條分子的含量約為lfmol，不經過擴增，很難等到足夠量的核酸分子，因此擴增反應是必須的。本發明由於預先進行了純化，在擴增前儘可能的除去對產物擴增有影響的副產物，使得DNA片段的起始量低至O. Olfmol的時候，依然可以得到目標DNA分子，這是採用晶片技術大規模合成長鏈核酸分子的關鍵所在。此外，圖5-8的結果證明，本發明抗幹擾的能力特別強。從表4-6可以看出，每個實驗中我們人為地加入了若干條幹擾序列，每一條幹擾序列中都在不同的位置設置了 5個隨機的核苷酸(N代表隨機核苷酸)，這將對合成目標長鏈核酸分子造成非常大的幹擾，在實際合成時是不會存在如此大的幹擾的，本發明的方法在存在如此強烈的幹擾的情況下依然得到了目標產物，說明本發明的方法抗幹擾能力非常強，很適合大規模、高準確度地合成長鏈核酸分子。實施例I一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)(見表I)先充分混合，然後經過激酶磷酸化處理。經過退火(annealing),在T4連接酶的作用下，形成完整的雙鏈。隨後，加入帶streptavidin修飾的磁珠進行純化,這樣可以有效地去除反應底物、錯誤連接產物以及沒有連接完全的雙鏈。最後，通過PCR等核酸擴增方式，將進行純化好的產物擴增放大。實施例2實驗過程與實施例I相同，只是將表面修飾streptavidin的磁珠顆粒先於純化序列孵育15分鐘，用緩衝液清洗三次。然後在其它序列混合，進行磷酸化處理。再經過退火、連接反應。最後，進行純化和擴增。實施例3
實驗過程與實施例I或2相同,只是將表面修飾streptavidin的磁珠顆粒換為玻璃、聚合物顆粒，如聚甲基丙烯醯胺、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-羥基乙酸聚合物(PLGA)、聚丙烯酸(PAA)、聚甲基丙烯酸、聚2-羥乙基(甲基)丙烯酸酯、聚N-異丙基(甲基)丙烯醯胺、聚乙酸乙烯酯或聚丙烯胺，得到的結果與實施例I相似。實施例4一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)(見表I)先充分混合，然後經過激酶磷酸化處理。經過退火(annealing),在T4連接酶的作用下，形成完整的雙鏈。隨後，利用HPLC對產物進行純化，這樣可以有效地去除反應底物，錯誤連接產物以及沒有連接完全的雙鏈。最後，通過PCR等核酸擴增方式，將進行純化好的產物擴增放大。實施例5
實驗過程與實施例4相同，只是將HPLC對產物的純化改為PAGE膠純化、凝膠電泳純化、毛細管電泳純化等方式，實驗結果與實施例4類似。實施例6實驗過程與實施例I或2相同，只是在一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)中，再加入12條幹擾片段(見表5)。克隆測序發現，全部為正確554bp核酸片段。實施例7實驗過程與實施例6相同，只是在一組25bp_59bp的核酸片段(17條)、接頭序列(I和2)和純化序列(I條)中，加入12條幹擾片段，再加入68條25bp-59bp的核酸片段。克隆測序發現，可同時獲得554bp、731bp、1026bp三條核酸片段。附表PCR 引物forward primer TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGTreverse primer AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT表I.獲得554bp片段所需序列
權利要求
1.一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，其特徵在於該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的設計及合成設計一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列，將所 述核苷酸序列的雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段；2)端點的化學修飾將位於上述核苷酸序列端點位置的4條小片段核酸分子中的至少一條的端點一該端點同時也是上述核苷酸序列的端點一進行化學修飾，使其帶有可以發生生物和/或化學反應的化學基團和/或生物分子，上述進行了化學修飾的小片段核酸分子稱為「純化序列」 ;3)短鏈核酸分子片段的連接步驟I合成得到的包括上述純化序列的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；4)純化準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，上述化學基團和/或生物分子能夠與純化序列上的化學基團和/或生物分子連接，將該塊狀固體加入步驟3得到的含有長鏈核酸分子的溶液中進行孵育，包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列將通過純化序列上的化學基團和/或生物分子固定化到固體表面，分離得到塊狀固體，衝洗塊狀固體；5)擴增利用核酸擴增技術對固定化到塊狀固體表面的包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列進行擴增放大；任選的步驟6)剪切通過酶切除核苷酸序列中除目標長鏈核酸分子之外多餘的核苷酸片段，得到目標核酸分子。
2.一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，其特徵在於該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的設計及合成設計一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列，將所述核苷酸序列的雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段；2)端點的化學修飾將位於上述核苷酸序列端點位置的4條小片段核酸分子中的至少一條的端點一該端點同時也是上述核苷酸序列的端點一進行化學修飾，使其帶有可以發生生物和/或化學反應的化學基團和/或生物分子，上述進行了化學修飾的小片段核酸分子稱為「純化序列」 ;3)短鏈核酸分子片段的連接準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，上述化學基團和/或生物分子能夠與純化序列上的化學基團和/或生物分子連接，將該塊狀固體加入步驟2得到的純化序列的溶液中進行孵育，純化序列將通過其上的化學基團和/或生物分子固定化到固體表面，將上述孵育後的塊狀固體與步驟I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；4)純化分離得到塊狀固體，衝洗塊狀固體；5)擴增利用核酸擴增技術對固定化到塊狀固體表面的目標長鏈核酸分子進行擴增放大；任選的步驟6)剪切通過酶切除核苷酸序列中除目標長鏈核酸分子之外多餘的核苷酸片段，得到目標核酸分子。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於步驟I中所述「一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列」為目標長鏈核酸分子本身。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特徵在於步驟I中所述「一段包含目標長鏈核酸分子的核苷酸序列」由目標長鏈核酸分子及位於目標長鏈核酸分子兩端的PCR引物序列和純化序列組成。
5.根據權利要求1-4的任一項所述的方法，其特徵在於在步驟4和5之間還包括轉錄步驟。
6.根據權利要求1-5的任一項所述的方法，其特徵在於在擴增步驟完成之後進一步進行純化。
7.根據權利要求1-6的任一項所述的方法，其特徵在於步驟I中將目標核酸分子雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開至少3個核苷酸，優選彼此錯開至少5個核苷酸，進一步優選彼此錯開至少7個核苷酸，最優選彼此錯開至少9個核苷酸。
8.根據權利要求1-7的任一項所述的方法，其特徵在於所述塊狀固體包括磁性材料、矽、二氧化矽、陶瓷、高分子材料、石英或者玻璃。
9.根據權利要求1-8的任一項所述的方法，其特徵在於純化序列修飾有生物素(biotin),塊狀固體表面修飾有鏈酶親和素(streptavidin)。
10.根據權利要求1-9的任一項所述的方法，其特徵在於純化序列修飾有氨基，塊狀固體表面修飾有羧基；或者純化序列修飾有羧基，塊狀固體表面修飾有氨基；或者純化序列修飾有疊氮化物(azide)，塊狀固體表面修飾有炔烴(alkyne);或者純化序列修飾有炔烴，塊狀固體表面修飾有疊氮化物。
11.根據權利要求1-10的任一項所述的方法，其特徵在於步驟3中的核酸分子連接酶是T4連接酶或Taq連接酶。
12.根據權利要求1-11的任一項所述的方法，其特徵在於所述長鏈核酸分子包括至少700個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目< 150 ;或者所述長鏈核酸分子包括至少1000個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目< 200。
13.一種大規模合成長鏈核酸分子的方法，其特徵在於該方法先合成短鏈核酸分子，然後將短鏈核酸分子連接為長鏈核酸分子，所述長鏈核酸分子的長度至少為短鏈分子長度的2倍；該方法包括如下步驟1)短鏈核酸分子片段的合成將目標長鏈核酸分子雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開，合成所述小片段；2)短鏈核酸分子片段的連接步驟I合成得到的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對，形成帶有缺口的雙鏈，在核酸分子連接酶的作用下，形成完整的長鏈核酸分子；3)純化利用HPLC、PAGE、毛細管電泳或者凝膠電泳等方法對步驟2的產物進行純化，分離得到目標長鏈核酸分子；4)擴增利用核酸擴增技術對步驟3純化得到的目標長鏈核酸分子進行擴增放大。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於在步驟3和4之間還包括轉錄步驟。
15.根據權利要求13或14所述的方法，其特徵在於在擴增步驟完成之後進一步進行純化。
16.根據權利要求13-15的任一項所述的方法，其特徵在於步驟I中將目標核酸分子雙鏈中的每一條單鏈分別劃分為若干個小片段，兩條鏈中的劃分點彼此錯開至少3個核苷酸，優選彼此錯開至少5個核苷酸，進一步優選彼此錯開至少7個核苷酸，最優選彼此錯開至少9個核苷酸。
17.根據權利要求13-16的任一項所述的方法，其特徵在於步驟2中的核酸分子連接酶是T4連接酶或Taq連接酶。
18.根據權利要求13-17的任一項所述的方法，其特徵在於所述長鏈核酸分子包括至少70 0個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目(150 ;或者所述長鏈核酸分子包括至少1000個核苷酸，每一個小片段中的核苷酸數目< 200。
全文摘要
一種由短鏈核酸分子合成長鏈核酸分子的大規模、低成本、高效率合成方法，包括1)短鏈核酸分子片段的合成；2)端點的化學修飾將位於長鏈核酸分子端點位置的小片段核酸分子的端點進行化學修飾，稱為「純化序列」；3)短鏈核酸分子片段的連接準備塊狀固體，所述固體表面具有化學基團和/或生物分子，將該塊狀固體加入步驟2得到的純化序列的溶液中進行孵育，純化序列將固定化到固體表面，將塊狀固體與步驟1合成得到的小片段核酸分子在溶液中通過互補配對形成帶有缺口的雙鏈，在連接酶作用下形成完整的長鏈核酸分子；4)純化分離並衝洗塊狀固體；5)利用核酸擴增技術對固定化到塊狀固體表面的目標長鏈核酸分子進行擴增放大。
文檔編號C12N15/10GK102876658SQ20111019363
公開日2013年1月16日 申請日期2011年7月12日 優先權日2011年7月12日
發明者馬千君, 李紹路 申請人:北京唯尚立德生物科技有限公司