一種全人源抗TNF-α單克隆抗體、其製備方法及用途的製作方法

2023-05-26 21:22:21

專利名稱：一種全人源抗TNF-α單克隆抗體、其製備方法及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種全人源單克隆抗體、其製備方法及用途。
背景技術：
TNF- α是體內的一種多功能免疫調節分子，它可以和細胞膜上的受體結合發揮作用，往往引起靶細胞的死亡(它的名稱即來源於此)或招引免疫效應細胞在局部的聚集。 TNF-α是一種可溶性的同源三聚體亞基，分子量為17kD (Smith，et al. , J. Biol. Chem. 262 6951-6954,1987) ο也發現有跨膜結合的前體TNF-α，分子量為^kD (Kriegler，et al.， Cell 53:45-53,1988)。單核巨噬細胞在受到內毒素和其他一些刺激物刺激後，能夠分泌 TNF- α和TNF- β，另外其他一些細胞也能分泌TNF- α。TNF-α在類風溼關節炎、細菌或病毒感染、慢性炎症、自身免疫病如愛滋病 (AIDS)、惡性腫瘤和/或神經退行性疾病等的病理進程中起十分關鍵的作用。TNF-α單克隆抗體可以中和TNF-α，在體內對TNF-α的活性起到了負調節的作用。而且有大量研究表明，TNF-α還是引起膿毒性休克綜合症的主要介質。膿毒性休克綜合症患者血清中TNF-α 水平升高預示著死亡率或致殘率升高。臨床上應用TNF-α抗體或者其受體對膿毒性休克綜合症有一定療效。此外，TNF-α是促進HIV無症狀感染狀態進入AIDS的主要介質之一，而針對 TNF-α的單克隆抗體能夠中和TNF-α的活性，在體內對TNF-α的活性進行負調節，可去除患者從無症狀感染狀態進入AIDS的誘因，達到一定的AIDS治療目的。將TNF-α的單克隆抗體與其他AIDS藥物聯合應用，拮抗由TNF-α過多所引起的副作用，將會明顯提高療效。最初科學家們製備獲得的是鼠源抗TNF-a單克隆抗體，用於中和TNF-α的治療。但研究發現鼠源單抗作為治療藥物存在許多缺陷，這是因為鼠源單抗用於人體具有強烈的免疫原性，體內消除快，半衰期短，導致臨床療效有限，副作用大。隨著人源化單抗技術的發展，克服了抗TNF-α鼠源單抗的缺陷。其中人鼠嵌合抗TNF-a單抗(Infliximab， Remicade )是利用基因工程上遊構建技術製備獲得的，其可變區仍取自鼠源TNF-α單抗，保留了與腫瘤壞死因子可溶性片段和跨膜區結合的特異性和親和力(Ka= IOkT1),恆定區為人IgG1的恆定區所取代，體內半衰期大大延長。另外還有已經在國外批准上市的 TNF-α抑制劑有腫瘤壞死因子受體一抗體融合蛋白(Enbrel，Amgen公司)和抗腫瘤壞死因子α全人單抗(Humira，Abbott公司)。從作用的靶點和作用特異性的角度來說，上述幾種藥物的作用機理幾乎是完全相同的。但上述抗體或融合蛋白都存在不同程度的免疫原性高、特異性低和/或穩定性不夠等問題，因此，本領域迫切需要建立既能夠保持或提高抗體的親和力和特異性，又能夠降低或基本消除抗體免疫原性的抗TNF-α抗體，從而進一步提高臨床應用的安全性和有效性。

發明內容
本發明構建了大容量的天然人源噬菌體抗體庫，從中篩選獲得了一株全人源抗 TNF-α 抗體 4Η16。更具體地，本發明公開了全人源抗TNF- α抗體，重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO 6所示，輕鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO 8所示；本發明公開了上述全人源抗TNF- α抗體，重鏈胺基酸序列為SEQ IDNO 10所示， 輕鏈胺基酸序列為SEQ ID NO 12所示；本發明還公開了一種核苷酸序列，編碼上述的全人源抗TNF-α抗體；本發明公開了上述核苷酸序列，其中編碼全人源抗TNF-α抗體重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO :5所示，編碼全人源抗TNF-α抗體輕鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO 7 所示；本發明公開了上述核苷酸序列，其中編碼全人源抗TNF-α抗體重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 9所示，編碼全人源抗TNF-α抗體輕鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO 11所示；本發明還公開了一種表達載體，含有上述的核苷酸序列，為pcDNA3. 1/ΖΕ0(+)或 pcDNA3. 1 (+)；本發明還公開了上述表達載體轉化的宿主細胞，為CHO-Kl細胞；本發明進一步公開了上述全人源抗體的製備方法，包括從噬菌體人源抗體庫篩選獲得高親和力全人源抗TNF-α單鏈抗體；全人源抗TNF-α完整抗體分子真核表達載體的構建；全人源抗TNF-α完整抗體分子在CHO細胞中的表達；全人源抗TNF-α完整抗體分子的純化。本發明最後公開了上述的全人源抗體在製備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。 其中自身免疫性疾病為類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病。本發明利用得到的抗體進行了一系列實驗，實驗結果表明與D2E7(adalimumab 單抗，Abbott公司)、中國發明專利申請號200310108440.0申請日2003年11月6日發明名稱為《全人源腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物》中公開的7B3比較起來， 本發明得到的抗體具有更高的抗體親和力和更強的TNF-α中和能力。


圖1.抗TNF- α抗體4Η16阻斷TNF- α與可溶性Ρ75受體的結合實驗結果；圖2.抗TNF- α抗體4Η16阻斷TNF- α與U-937細胞表面受體的結合實驗結果；圖3.抗TNF- α抗體4Η16拮抗TNF- α介導的細胞的殺傷效應實驗結果；
具體實施例方式以下實施例、實驗例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例抗體的製備(1)人抗體輕、重鏈恆定區基因的克隆用淋巴細胞分離液(鼎國生物技術發展公司產品)分離健康人淋巴細胞，用 Trizol試劑anvitrogen公司產品)提取總RNA，根據文獻(Cell，1980，22 :197-207)和文獻(NucleicAcids Research, 1982,10 :4071-4079)報導的序列分別設計引物採用 RT-PCR 反應擴增抗體重鏈和輕鏈恆定區基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收並克隆到 pGEM-T載體(Promega公司產品)中，測序驗證後確認獲得了正確的克隆。SEQ ID N0:1和 SEQ ID NO :2分別顯示了重鏈恆定區(Ch)的核苷酸序列和胺基酸序列。SEQ ID NO :3和 SEQ ID NO :4分別顯示了輕鏈恆定區(CJ的核苷酸序列和胺基酸序列。本例中的正確克隆記作 pGEM-T/CH 和 pGEM-T/Q。(2) cDNA 的製備收集50健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴細胞分離液(醫科院天津血研所生產)分離單個核細胞。用iTrizol試劑anvitrogen公司)從分離的人外周血淋巴細胞中提取細胞的總RNA。用cDNA反轉錄試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)反轉錄出 cDNA。以上步驟按照廠家提供的說明書進行。(3)引物設計參考文獻(Immunotechnology，1998，3 :271-278)設計併合成複製人抗體重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)基因的 VHBack，VaFor, VJack 和 \For 引物。VHBack，VaFor, VLBack 和 VLFor 的序列見 Immunotechnology，1998,3 :271_278。其中在 V11Back 引物的 5，端加上含有Sfi I位點的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在V11For引物的5』端加上序 ^lJ gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc,在 VlBack 弓|物的 5，端力口上序列 tcc ggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct,在 VLFor 弓|物的 5，端力口上含有 Not I 位點的序列 atg egg ccg C。(4).噬菌體抗體庫的構建及篩選採用(2) 4^々cDNAfP (3)中的弓|物，利用 recombinant Phage antibody system 試劑盒(Amersham Biosciences公司)構建噬菌體單鏈抗體庫，然後用特異性抗原對文庫進行淘選。抗體庫構建和淘選方法參照recombinant Phage antibodysystem試劑盒說明書進行，用於淘選的特異性抗原「重組人TNF-α (rhTNF-α)」購自R&D公司。經多次淘選抗體庫後獲得了一株抗人TNF-α單鏈抗體4H16kFv，測序後獲得其基因序列。SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO :6分別顯示了 4H16&FV重鏈可變區核苷酸序列和胺基酸序列。SEQ ID NO 7和SEQ IDNO 8分別顯示了 4H16kFv輕鏈可變區\的核苷酸序列和胺基酸序列。(5)全人源抗體在真核細胞中的表達以4H16&FV基因和pGEM_T/CH為模版，通過重疊PCR合成全人源抗體重鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環；72°C 10分鐘。並使此全人源抗體重鏈基因的5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAG CTTCCTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。最後瓊脂糖凝膠電泳分離 PCR 擴增產物， 回收目的條帶並克隆到PGEM-T載體(Promega公司產品)中，篩選陽性克隆測序。挑選測序正確的克隆用HindIII和EcoR I酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體重鏈片段 4H16VhCh，與用 HindIII 和 EcoR I 酶切的質粒 pcDNA3. 1 (+) (Invitrogen 公司)進行連接， 構建成全人源重鏈真核表達載體pcDNA3. 1 (+) (4H16VhCh)。以4H16&FV基因和pGEM_T/Q截體為模板，通過重疊PCR合成全人源化抗體輕鏈基因，反應條件為95°C 15分鐘；94°C 50秒，58°C 50秒，72°C 50秒，30個循環；72°C 10分鐘，得到PCR產物，其5'端含有限制酶位點HindIII和信號肽基因序列，，3'端含有翻譯終止密碼TAA和限制酶位點EcoR I。信號肽基因序列為(ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTC CTGCTAATCAGTGCCTCAGTCATAATATCCAGAGGA)。挑選測序正確的克隆用 HindIII 和 EcoR I 酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收全人源抗體輕鏈片段4H16\(^，與用HindIII和EcoR I酶切的質粒pcDNA3. 1/ZE0(+) anvitrogen公司)載體進行連接，構建成全人源輕鏈真核表達載體 pcDNA3. 1/ZEO (+) (4H16VLCL)。於3. 5cm組織培養皿中接種3 X IO5CHO-Kl細胞(ATCC CRL-9618)，細胞培養至90% -95%融合時進行轉染取質粒101^(質粒？(^嫩3.1(+) (4H 16VHCH) 4 μ g，質粒 pcDNA3. 1/ZEO (+) (4H16VLCL) 6 μ g)禾口 20 μ 1 Lipofectamine2000Reagent (Invitrogen 公司產品)按LipofectamindOOOReagent試劑盒說明書進行轉染。轉染進行24h後細胞換含 600 μ g/ml G418 (Invitrogen 公司產品)禾口 250 μ g/ml Zeocin (Invitrogen 公司產品)的 DMEM培養基篩選抗性克隆。取細胞培養上清用ELISA檢測篩選高表達克隆羊抗人IgG(Fe) (KPL公司)包被於ELISA板，4°C過夜，用2% BSA-PBS於37°C封閉2h，加入待測的抗性克隆培養上清或標準品Human myeloma IgGl, κ (Sigma)，37°C溫育2h，加入HRP-羊抗人 IgG (κ) ((Southern Biotechnology Associates 公司)進行結合反應，37°C 溫育 lh，加入 TMB顯色液於37°C作用5min，最後用H2SO4終止反應，測A45tl值。將篩選得到的高表達克隆用無血清培養基擴大培養，用I^rotein A親和柱(GE公司產品)分離純化全人源抗體4H16。 將純化抗體用PBS進行透析，最後以紫外吸收法定量。SEQ ID NO :9和SEQ ID NO: 10分別顯示了全人源抗體4H16的重鏈核苷酸序列和胺基酸序列。SEQ ID N0:11和SEQ ID N0 12 分別顯示了全人源抗體4H16的輕鏈核苷酸序列和胺基酸序列。實驗例7B3 按照中國專利申請號200310108440.0，申請日2003年11月6日，發明名稱 《全人源腫瘤壞死因子抗體，其製備方法以及藥物組合物》中公開的方法製備得到。實驗例1.抗TNF α抗體的親和力檢測運用 Biacore Τ100 系統(Biacore ΑΒ，Uppsala, Sweden)通過表面等離子體激元共振(SPR)檢測TNFa抗體的親和力常數。將重組人TNFa (R&D公司產品)通過氨基共價結合與CM5生物傳感晶片(Biacore)上，將①全人源抗體4H16 ；②全人源抗體 adalimumab (Humira, D2E7，市售產品)；③陽性對照全人源抗TNF α抗體7Β3 ；④陰性對照抗體 Trastuzumab (以 PBS/0. 05 % TWEEN-20 (ICI Americas)(去汙劑)配溶液，配成不同的濃度O倍比濃度稀釋)，以50μ Ι/min的流速通過晶片。每次檢查之後，用5μ 1 50mM 鹽酸水溶液以3μ 1/min的流速洗滌，從而將殘留的抗體從固定化的配體上洗脫下來。用 BIAevalution軟體(TlOOevalution 2. O版，Biacore)，通過非線性回歸法分析結合曲線。 結果如表1所示，全人源抗體4H16的KD值顯著低於全人源抗體adal imumab和全人源TNF α 抗體783，說明全人源抗體4!116對1順0的親和力高於adalimumab和全人源抗體TNF α抗體7Β3，實驗結果見表1表1親和力實驗結果
權利要求
1.一種全人源抗TNF-α單克隆抗體，其特徵在於，重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO 6所示，輕鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO 8所示。
2.權利要求1所述的全人源抗TNF-α單克隆抗體，其特徵在於，重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO: 10所示，輕鏈胺基酸序列為SEQ ID N0:12所示。
3.編碼權利要求1所述的全人源抗TNF-α單克隆抗體的DNA序列，其特徵在於，重鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO :5所示，輕鏈可變區的核苷酸序列為SEQ ID NO :7所示。
4.編碼權利要求2所述的全人源抗TNF-α單克隆抗體的DNA序列，其特徵在於，重鏈的核苷酸序列為SEQ ID NO :9所示，輕鏈的核苷酸序列為SEQ IDN0:11所示。
5.含有權利要求3或4所述的DNA序列的表達載體，為pcDNA3.1/ΖΕ0⑴或 pcDNA3. 1 (+)。
6.含有權利要求5所述的表達載體的宿主細胞，為CHO-Kl細胞。
7.權利要求1或2所述的全人源抗TNF-α單克隆抗體的製備方法，包括從噬菌體人源抗體庫篩選獲得高親和力全人源抗TNF-α單鏈抗體、全人源抗TNF-α完整抗體分子真核表達載體的構建、全人源抗TNF-α完整抗體分子在CHO細胞中的表達和全人源抗TNF-α 完整抗體分子的純化四個步驟。
8.權利要求1或2所述的全人源抗TNF-α單克隆抗體在製備治療自身免疫性疾病藥物中的用途。
9.權利要求8所述的用途，其中自身免疫性疾病為類風溼性關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種全人源抗TNF-α單克隆抗體、其製備方法及用途。本發明構建了大容量的天然人源噬菌體抗體庫，從中篩選獲得了一株全人源抗TNF-抗體4H16，其重鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO6所示，輕鏈可變區胺基酸序列為SEQ ID NO8所示。本發明還公開了4H16抗體的製備方法以及編碼4H16抗體的核苷酸序列、含該核酸序列的表達載體和宿主細胞。本發明的4H16抗體與D2E7單抗相比，具有更高的抗體親和力和更強的TNF-中和能力，可用於製備治療自身免疫性疾病藥物。
文檔編號C07K16/24GK102167741SQ201010125249
公開日2011年8月31日 申請日期2010年2月25日 優先權日2010年2月25日
發明者仝昕, 李川, 郭懷祖 申請人:百邁博藥業有限公司