亞氨基糖衍生物在抑制離子通道活性中的應用的製作方法

2023-05-26 23:52:51

專利名稱：亞氨基糖衍生物在抑制離子通道活性中的應用的製作方法
相關申請的交叉引用本申請要求於2002年9月23日申請的美國臨時申請順序號60/412,560的優先權，所述臨時申請通過引用全部結合到本文中。
背景C型肝炎病毒(HCV)是具有晚期肝硬化和肝細胞癌的顯著危險的慢性肝炎的主要原因(參見Di Bisceglie，A.M.，(1997)Hepatology 26(3增刊1)345-385)。HCV屬於黃病毒科(Flaviviridae)，該科由三個屬組成黃病毒(flavivirus)、瘟病毒(pestivirus)和嗜肝病毒(hepacivirus)。當缺乏合適的小動物模型和可靠的體外感染性測定用於HCV時，先用一種相關的瘟病毒即牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)，初步測試潛在的抗病毒藥物。已經採用BVDV體外感染性測定證明，含有葡萄糖類似物1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇(也稱為脫氧野尻黴素(deoxynojirimycin)或「DNJ」)或者半乳糖類似物1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-半乳糖醇(也稱為脫氧半乳糖野尻黴素(deoxygalactonojirimycin)或「DGJ」)的烷基化亞氨基糖衍生物是有效的抗病毒抑制劑(參見Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。
DNJ衍生物至少是部分抗病毒抑制劑，因為它們抑制ERα-葡糖苷酶I和II。這些酶去除形成N聚糖前體部分的三個葡萄糖殘基，所述前體被整個地轉移給ER中的新生糖蛋白。ERα-葡糖苷酶的抑制阻止含N聯寡糖的單葡萄糖基化糖蛋白的形成，並且阻止含N聯寡糖的單葡萄糖基化糖蛋白隨後與駐留在ER中的陪伴分子鈣聯接蛋白和鈣網蛋白的相互作用(參見Bergeron，J.J.等，(1994)TrendsBiochem.Sci.19(3)第124-8頁；Peterson，JR.等，(1995)Mol.Biol.Cell6(9)1173-84)。對於包括BVDV包膜糖蛋白和HCV包膜糖蛋白在內的許多宿主編碼的和病毒編碼的糖蛋白的適當摺疊來說，鈣聯接蛋白相互作用是至關重要的(參見Branza-Nichita，N.等，(2001)J Virol.75(8)3527-36；Choukhi，A.等，(1998)J. Virol.，1998 72(5)3851-8)。BVDV包膜糖蛋白的錯摺疊會降低病毒粒子從感染細胞中的分泌。
先前實驗已經顯示，長鏈烷基衍生物N-壬基-DNJ(NN-DNJ)的抗病毒效果比短鏈烷基衍生物N-丁基-DNJ(NB-DNJ)更顯著，儘管後者在細胞中達到更有效的ERα-葡糖苷酶抑制(參見Durantel，D.等，(2001)J. Virol.75(19)8987-98)。另外，不被識別ERα-葡糖苷酶的長鏈烷基DGJ-衍生物和不抑制ERα-葡糖苷酶的長鏈烷基DGJ-衍生物也顯示出有效的抗病毒活性。因此，ER α-葡糖苷酶抑制與觀察到的抗病毒效果沒有直接關係，排除了它作為單獨的抗病毒機制。
其它的作用機制顯然與烷基側鏈長度有關，因為短鏈N-丁基-DGJ(NB-DGJ)沒有顯示出抗病毒活性，而長鏈烷基衍生物NN-DGJ卻是有效的抑制劑。然而，這與烷基化亞氨基糖衍生物的兩親性去垢劑樣效應並無關係，因為在體外BVDV感染性測定中，結構類似的去垢劑n-辛基葡萄糖苷(n-OG)和n-壬基葡萄糖苷都不是抗病毒劑(參見Durantel，D.等，(2001)J.Virol.75(19)8987-98)。藥物處理影響病毒膜糖蛋白的二聚作用並且改變了BVDV病毒粒子分泌的膜糖蛋白組成，但並不影響病毒RNA複製，也不影響病毒蛋白質合成。
因其ERα-葡糖苷酶抑制活性，無論是長鏈還是短鏈烷基DNJ-衍生物都對登革病毒(DENV)和日本腦炎病毒(JEV)等黃病毒具有抗病毒性(參見Courageot，M.P.等，(2000)J Virol.74(1)564-72；Wu，S.F.等，(2002)J.Virol.，76(8)3596-604)。相比之下，DGJ-衍生物沒有顯示出針對黃病毒的抗病毒活性，但長鏈烷基DGJ-衍生物卻是有效的瘟病毒抑制劑。與更密切相關的瘟病毒和嗜肝病毒不同，黃病毒不含p7或類似的小跨膜蛋白。同樣，DNJ-衍生物和DGJ-衍生物可通過抑制p7或類似蛋白，抑制病毒複製。
HCV正鏈RNA基因組編碼一種約3000個胺基酸殘基的多蛋白前體。該多蛋白通過病毒蛋白酶和細胞蛋白酶進行共翻譯和翻譯後加工，以產生成熟的結構蛋白和非結構蛋白C、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B(有關綜述參見Reed，K.E.和C.M.Rice，(2000)Curr.Top.Microbiol Immunol 242第55-84頁)，以及來自多蛋白N-端區的核糖體移碼的潛在的F蛋白(參見Xu，Z.等，(2001)EMBO J.20(14)第3840-8頁)。儘管在翻譯過程中或緊接著在翻譯後，有效完成了多蛋白前體的大多數切割，但是在E2/p7和p7/NS2位點的切割卻是延遲的，導致產生E2-p7-NS2前體。此外，在E2和p7間的加工是不完全的，導致E2-p7以及E2和p7的產生(參見Lin，C.等，(1994)J. Virol.68(8)第5063-73頁；Mizushima，H.等，(1994)J.Virol.68(10)第6215-22頁)。
因為沒有可用的HCV複製的細胞培養模型，所以，有關HCV複製的信息都是通過使用BVDV細胞培養模型而來。同樣，有關p7的大多數功能性數據是從BVDV p7(一種與HCV p7非常類似的70個胺基酸的蛋白)的研究中獲得。通過將突變引入到感染性BVDV的cDNA克隆，已經得到有關BVDV p7的功能性數據。完整p7基因的一個符合讀框的缺失並不影響BVDV RNA複製，但卻導致產生非感染性病毒粒子。然而，可通過補充p7，產生感染性病毒粒子(參見Harada，T.，N.Tautz和H.J.Thiel，(2000)J.Virol.74(20)9498-506)，這表明瘟病毒p7對感染性子代病毒的產生是必要的。
HCV p7蛋白是63個胺基酸的肽，其已顯示出是兩次跨膜的多境起源的膜蛋白，並且其N-端和C-端朝向胞外環境(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。同樣，p7蛋白已顯示出包括兩個跨膜結構域。其N-端跨膜結構域包括從大約位置10到大約位置32的胺基酸，而其C-端跨膜結構域包括從大約位置36到大約位置58的胺基酸。儘管在所有HCV病毒株中這兩個跨膜結構域的胺基酸有所不同，但對於已報導的病毒株來說，跨膜結構域的大部分胺基酸(通常約大於70％)是疏水性胺基酸，其特徵為F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。這兩個跨膜結構域通過三個非疏水性胺基酸(K或R、G、R或K)連接，p7的共有序列是ALENLVVLNAASAAGTHGILWFLVFFCAAWYVKGRLVPGATYSLLGLWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。
亞基因組複製子的研究已經顯示，HCV p7對基因組複製並不是必須的(參見Lohmann，V.等，(1999)Science 285(5424)第110-3頁；Pietschmann，T.等，(2001)J.Virol.75(3)第1252-64頁)，但是其在產生感染性病毒中的作用尚不清楚。已表明HCV p7是一組稱為病毒通道蛋白(viroporin)的小蛋白的推定成員，這類蛋白介導陽離子穿透膜並且對於病毒粒子的釋放或成熟來說是重要的。對於某些病毒通道蛋白，已經顯示跨膜結構域足以形成膜通道(參見Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20頁)。
概述一個實施方案涉及用於治療HCV感染的方法，即給予有需要的患者(特別是人)有效抑制HCV p7蛋白活性的亞氨基糖衍生化合物。用於所述方法的化合物能有效抑制HCV p7蛋白透化膜的能力。在最廣泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II其中每個R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同。
R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的取代基取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH，其中所選的取代基可以相同或不同。特別合適的取代基包括壬基、7-氧雜壬基和10-氧雜十一烷基，而特別需要的化合物包括N-壬基脫氧野尻黴素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻黴素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)。
可將一種或多種所述化合物包裝成用於治療HCV感染的試劑盒。該試劑盒可包括治療HCV感染的說明書以及給予所述化合物的用具。
另一個實施方案涉及用於篩選能抑制HCV p7活性的化合物的方法。具體地講，可根據化合物是否抑制p7或p7變體透化膜的能力進行篩選。在這樣的方法中，需要使用人工膜系統或細菌系統。
附圖簡述

圖1A顯示大腸桿菌(E.coli)Rosetta gami(DE3)pLacl細胞的生長曲線。在指定時間內(誘導後的小時)監測非轉化細胞(A)、pTriEx1.1轉化的細胞(B)和pTiEx1.1 p7轉化的細胞(C)的光密度(OD600nm)。顯示了未誘導細胞(○)和加入1mM IPTG誘導的細胞(□)的生長曲線。圖1B顯示，在指定時間內由非轉化大腸桿菌Rosetta gami(DE3)pLacl細胞(A)、pTriEx1.1轉化的細胞(B)和pTiEx1.1 p7轉化的細胞(C)釋放的[3H]-尿苷。顯示了未誘導細胞(○)和加入1mM IPTG誘導的細胞(□)的生長曲線。
圖2顯示合成HCV p7的Tris-tricine凝膠電泳分析。凝膠經銀染色(左圖)或轉移到膜上，隨後用鏈黴抗生物素探測(右圖)。
圖3A顯示將合成HCV p7重組到BLM中的通道記錄。直線表示閉合狀態。圖3B顯示，數據收集約30分鐘後記錄的電流曲線。圖3C顯示，如圖3A所示，在+100mV膜電位記錄到的電流曲線柱狀圖。
圖4顯示短鏈(NB-DNJ，NB-DGJ)和長鏈(NN-DNJ，NN-DGJ)烷基亞氨基糖衍生物對BLM中p7通道信號的影響。鉗制電位穩定維持在+100mV，加入亞氨基糖衍生物直至指定的終濃度。
圖5顯示N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(或者稱為N7-氧雜壬基-甲基-DGJ)對BLM中p7通道信號的影響。鉗制電位穩定維持在+100mV，加入N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ直至指定的終濃度。
圖6顯示歸一化總電流曲線和標準偏差對藥物濃度繪製的曲線示意圖。對於NN-DNJ(方形)和NN-DGJ(菱形)，數據代表4秒鐘的3個代表性的曲線片段的平均值，而對於N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(三角)，數據代表30秒鐘的3個代表性的曲線片段的平均值。按照公式「總電流」＝1/(1+([藥物]/Kapp)，由數據S擬合推導出近似結合常數(Kapp)為對於NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM；對於NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM；對於N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。
圖7顯示SP240(即N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素)對BLM中p7通道信號的影響。
定義除非另有說明，本文所用的術語「烷基」是指含有一個或多個碳原子的直鏈和支鏈烷基，包括例如甲基、乙基、丁基和壬基。
本文所用的術語「芳基」是指苯環等單環芳基，或者茚滿基、萘基或芴基等苯並稠合芳基。
本文所用的術語「雜芳基」是指含有一個或多個雜原子的芳族化合物。實例包括吡啶基、呋喃基和噻吩基或含有一個或多個雜原子的苯並稠合芳族化合物，例如吲哚基或喹啉基。
本文所用的術語「雜原子」是指N、O、S等非碳原子。
本文所用的術語「環烷基」是指含有3、4、5、6、7或8個碳的碳環，包括例如環丙基和環己基。
除非另有說明，本文所用的術語「烷氧基」是指含有一個或多個碳原子的直鏈或支鏈烷氧基，包括例如甲氧基和乙氧基。
本文所用的術語「烯基」是指含有一個或多個雙鍵的直鏈或支鏈烷基，例如乙烯基和丙烯基。
本文所用的術語「芳烷基」是指被苄基和苯乙基等芳基取代的烷基。
本文所用的術語「炔基」是指含有一個或多個三鍵的直鏈或支鏈烷基，例如乙炔基和丙炔基。
本文所用的術語「芳氧基」是指-OH基團中的氫原子被芳基取代而產生的取代基，包括例如苯氧基。
本文所用的術語「芳烷氧基」是指被芳基取代的烷氧基，例如2-苯基乙氧基。
本文所用的術語「烷基氨基」是指被一個烷基取代的氨基，例如甲氨基(-NHCH3)和乙氨基(-NHCH2CH3)。
本文所用的術語「二烷基氨基」是指被兩個烷基取代的氨基，例如二甲氨基(-N(CH3)2)和二乙氨基(-N(CH2CH3)2)。
本文所用的術語「DNG」是指1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-葡萄糖醇或「脫氧野尻黴素」。
本文所用的術語「DGJ」是指1，5-二脫氧-1，5-亞氨基-D-半乳糖醇或「脫氧半乳糖野尻黴素」。
本文所用的術語「BLM」是指「黑脂膜」。
優選實施方案的詳述在所公開的方法中使用的化合物，作為HCV p7的抑制劑是有效的。在最廣泛的方面，所述化合物由下式I或II表示 I II在一方面，所述方法設計給予式I化合物。每個R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基。每個取代基可以相同或不同。
在一個優選的實施方案中，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥甲基(-CH2OH)。或者，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥基(-OH)。最優選的實施方案設計R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
R2為選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且所述取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基、C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH。
優選R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更優選R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。R2的直鏈C7-11烷基取代基的實例包括庚基、辛基和壬基。R2的取代烷基的實例為7-氧雜壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最優選R2為正壬基、7-氧雜壬基或10-氧雜十一烷基。
在式I的某些實施方案中，所述化合物可以由下式之一來表示
上式中每個環碳原子的立體化學可以與其它環碳原子的立體化學各不相同。更優選所述化合物具有一個下表1給出的結構式
表1
更優選所述化合物具有一個以下結構式 再更優選R2為壬基、7-氧雜壬基或10-氧雜十一烷基，最優選的化合物包括N-壬基脫氧野尻黴素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻黴素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6，-二脫氧半乳糖野尻黴素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)和它們的異構體，例如 所公開方法的另一方面設計給予式II化合物。每個R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基。每個取代基可以相同或不同。
在一個優選的實施方案中，R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為羥甲基(-CH2OH)。或者，R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為羥基(-OH)。最優選的實施方案設計R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
在式II中，R4為選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基。每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH。
優選R4為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。更優選R4為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基、取代的C7-11烷基或被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。R4的直鏈C7-11烷基取代基的實例包括庚基、辛基和壬基。R4的取代烷基的實例為7-氧雜壬基(-CH2(CH2)5-O-CH2CH3)。最優選R4為n-壬基、7-氧雜壬基或10-十一烷基。
在一個實施方案中，公開了用於治療HCV感染的方法，所述方法包括使HCV p7蛋白或者包含p7蛋白的膜組分與一種或多種抑制p7蛋白活性的化合物接觸。本發明人已表明p7蛋白增加膜的通透性，類似於膜通道蛋白的功能。另外，本發明人已表明特定化合物能抑制p7透化膜的能力。然而，所公開的方法設計本文公開的化合物也可抑制p7蛋白的其它活性。
所選化合物可通過與p7蛋白的相互作用，抑制該蛋白的一種或多種活性。在這種情況下，如具體結合測定所示，需要選擇與p7蛋白結合且其表觀結合常數不大於約Kapp＝130μM(即Kapp＝114.2(±18.3)μM)的化合物。或者，如具體通透性測定所示，可能需要選擇能阻斷p7蛋白透化膜的能力的化合物，當所述化合物濃度不大於約180μM時。
當所選化合物抑制p7透化膜的能力時，所述化合物可阻止p7形成通道，或者在通道形成後所述化合物可阻斷該通道(即作為通道阻斷劑)。或者，所述化合物可通過與一種或多種膜組分(例如磷脂)相互作用而改變膜流動性或局部特性，抑制p7蛋白。因此，所述化合物可抑制p7形成功能性膜通道的能力。
在又一個實施方案中，提供用於篩選有效抑制HCV p7活性的潛在抗病毒藥的方法。通常，所述方法包括將p7或p7變體摻入到膜系統中並觀察通透性增加，例如通過採用標準方法記錄跨膜電流。然後將試驗化合物加入到膜系統中，以測定所述化合物是否抑制p7透化膜的能力。理想的化合物在不超過約180μM的濃度下可完全阻斷p7透化膜的能力。
黑脂膜(「BLM」)可用於所述方法，但也可採用其它膜系統。黑脂膜是本領域眾所周知的，BLM通常用於研究膜通透性，例如在由通道形成蛋白介導時(參見Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁)。
當選定用於觀察p7活性的合適膜系統後，可以將p7摻入到所述膜中，以形成含p7的膜。可從其中p7蛋白顯示出增加選定膜通透性的任何HCV病毒株中選取p7蛋白。例如，可選定來自HCV-H病毒株的p7蛋白(即ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1))，或者可選定來自另一病毒株的p7蛋白。可能需要使用p7共有序列，所述共有序列是通過比較已報導的p7蛋白的胺基酸序列而獲得，或者可能需要選擇來自特定HCV分化體(例如分化體1)的p7蛋白。
在篩選方法的另一個實施方案中，可能需要使用所選p7蛋白的變體，如果所述變體是功能性的話(例如當採用本領域已知方法測定時，所述變體顯示出透化所選的膜)。可能的變體包括融合、缺失和/或突變或取代。例如，可能需要產生生物素醯化p7蛋白，用於所述方法。在另一個實例中，可能需要至少使用顯示出透化所選膜的p7或p7衍生物的部分(例如選定的p7蛋白或變體可證明在BLM中電導水平不小於約60pS(即86±22pS))。也可能需要在選定的p7胺基酸序列中產生突變。當產生突變時，可能需要根據HCV病毒株之間的比較，保持給定位置上胺基酸的一定特性。例如，對來自不同HCV株p7序列的比較已顯示出某些胺基酸位置的特性可以是「疏水性」、「中性」或「親水性」(參見Carrere-Kremer，S.等，(2002)J.Virol.76(8)3720-30)。「疏水性胺基酸」可屬於F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
選定的p7蛋白或變體可以人工合成，或者在細菌細胞或真核細胞等合適的生物系統中表達。當所述蛋白摻入到選定的膜系統中後，可以通過測定所述蛋白是否證明活性(例如引起通透性增加或細胞活力下降)，來測定膜通透性。可以使試驗化合物與所述蛋白和/或含p7的膜組分接觸，以測定所述化合物是否抑制所述蛋白的活性。在所述方法中，可以在p7摻入到膜之前和/或之後，使試驗化合物與p7和/或含p7的膜組分接觸。
在一個實施方案中，可能需要使用亞氨基糖衍生物作為篩選方法中的試驗化合物。具體地講，可能需要使用本文所述的DGJ烷基化衍生物或DNJ烷基化衍生物作為試驗化合物。特別需要烷基化亞氨基糖N-壬基脫氧野尻黴素(NN-DNJ)、N-壬基脫氧半乳糖野尻黴素(NN-DGJ)、N-7-氧雜壬基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素(即N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ、N-7-氧雜壬基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素或N-7-氧雜壬基-甲基-DGJ)和N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素(即N-10-氧雜十一烷基-6-甲基脫氧半乳糖野尻黴素、N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ、N-10-氧雜十一烷基-6-脫氧-DGJ、(2R，3S，4R，5S)-1-(9-甲氧基壬基)-2-甲基-3，4，5-哌啶三醇、(2R，3R)-2，3-二羥基丁二酸酯(1∶1)或SP240)的衍生物和/或它們的異構體。
在另一個實施方案中，可能需要使用已顯示出與p7或其它膜組分相互作用的、作為所述方法中的試驗化合物的化合物或其衍生物(例如已顯示出在體外與p7相互作用的化合物)。在又一個實施方案中，可能需要使用已顯示出破壞由p7或其它蛋白形成的通道的化合物，和/或已知是由p7或其它蛋白形成的通道的阻斷劑的化合物，或其衍生物，作為所述方法中的試驗化合物。例如，已知金剛烷胺是甲型流感病毒M2通道的通道阻斷劑(參見Hay，A.J.等，(1985)EMBO J.4(11)第3021-4頁；Duff，K.C.和R.H.Ashley，(1992)Virology 190(1)第485-9頁；Sunstrom，N.A.等，(1996)J. Membr.Biol.150(2)第127-32頁；Fischer，W.B.等，(2001)Eur.Biophys.J.30(6)第416-20頁)。近來，其他人已表明，p7形成離子通道，該通道被金剛烷胺阻斷(參見Griffin等，FEBS Letters，2003，Jan.20；535(1-3)34-8)。因此，可能需要使用金剛烷胺或其衍生物作為所述方法中的試驗化合物。
在一個實施方案中，當細菌細胞膜通透性增加可導致細胞生長被抑制時，誘導型細菌系統可用於觀察通透性。例如，在合適的細菌系統中，可以從誘導型啟動子表達p7或其變體，以確定所述細胞是否表現出細胞生長的抑制。或者，在誘導p7表達之前，可以通過用[3H]-尿苷等放射性分子標記細胞，來證實通透性的增加。在誘導p7表達之後，可以通過測定釋放到培養基中的[3H]-尿苷，來評價通透性。可以將試驗化合物給予所述細菌，以測定所述化合物是否抑制細胞生長和/或所述化合物是否抑制[3H]-尿苷釋放到培養基中。
化合物的製備可以用市售的亞氨基化合物作為原料，製備用於本文所述方法的化合物。市售來源包括Sigma，St.Louis，MO；Cambridge ResearchBiochemicals，Norwich，Cheshire，United Kingdom；和Toronto ResearchChemicals，Ontario，Canada。
或者，可以通過本領域技術人員已知的合成方法合成本發明的化合物。例如，各種脫氧野尻黴素(DNJ)衍生物的合成描述於美國專利第5,622,972；5,200,523；5,043,273；4,944,572；4,246,345；4,266,025；4,405,714；和4,806,650號，以及美國申請順序號10/031,145。本文所述其它亞氨基糖化合物是已知的，並且可以通過以下美國專利給出的方法來製備第4,861,892；4,894,388；4,910,310；4,996,329；5,011,929；5,013,842；5,017,704；5,580,884；5,286,877；5,100,797；和6,291,657號。
藥用組合物當需要以藥用組合物或藥物形式給予所述化合物時，本文公開的化合物可以配製成供各種給藥方式用。技術和製劑通常可在以下文獻中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(第18版)，MackPublishing Co.(1990)。
所述藥物可以適合於通過任何合適途徑給藥，例如通過口服(包括口腔含化或舌下)、直腸、鼻腔、局部(包括口腔含化、舌下或經皮)或胃腸外(包括皮下、肌內、靜脈內或皮內)途徑，雖然優選口服給藥。所述組合物可以通過藥學領域已知的任何方法來製備，例如通過在無菌條件下將活性成分與載體混合在一起。
對於本領域普通技術人員來說，藥學上可接受的鹽通常是眾所周知的，可以包括但不限於以下實例乙酸鹽、苯磺酸鹽(benzenesulfonate)、苯磺酸鹽(besylate)、苯甲酸鹽、碳酸氫鹽、酒石酸氫鹽、溴化物、依地酸鈣、樟磺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、依地酸鹽、乙二磺酸鹽、依託酸鹽、乙磺酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、葡糖酸鹽、穀氨酸鹽、乙醇醯氨苯胂酸鹽、己基間苯二酚酸鹽、海巴明、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、羥萘酸鹽、碘化物、依西酸鹽、乳酸鹽、乳二糖酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽、粘酸鹽、萘磺酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、泛酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、鹼式乙酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、單寧酸鹽、酒石酸鹽或茶氯酸鹽。其它藥學上可接受的鹽可以在例如以下文獻中找到REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(第18版)，參見上文。
優選的藥學上可接受的鹽包括例如乙酸鹽、苯甲酸鹽、溴化物、碳酸鹽、檸檬酸鹽、葡糖酸鹽、氫溴酸鹽、鹽酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、雙羥萘酸鹽(恩波酸鹽)、磷酸鹽、水楊酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽或酒石酸鹽。
對於注射來說，所述化合物和藥物可以配製在水溶液中，最好是在Hank氏溶液、Ringer氏溶液等生理上相容的緩衝液中，或者在生理鹽水緩衝液中。對於所述經黏膜給藥，在製劑中使用適合於待穿透屏障的滲透劑。所述滲透劑是本領域眾所周知的。
採用藥學上可接受的載體，將本文公開的化合物配製成用於所述方法實踐的適合於系統給藥的製劑，這包括在所述方法的範圍之內。適當選用載體和合適的生產管理，本方法的組合物、特別是配製成溶液劑的本方法組合物可以通過胃腸外給藥，例如通過靜脈內注射。採用本領域眾所周知的藥學上可接受的載體，可以容易地將所述化合物配製成適合於口服給藥的製劑。所述載體使所述方法的化合物能夠配製成片劑、丸劑、膠囊劑、液體製劑、凝膠劑、糖漿劑、膏劑、混懸劑等，用於口服給予待治療的患者。
適用於本方法的藥用組合物包括如下組合物其中含有達到其預定目的有效量的活性成分。本領域技術人員能夠適當地確定有效量，尤其是根據本文所提供的詳細的公開內容。
除了活性成分之外，這些藥用組合物可含有合適的藥學上可接受的載體，所述載體包括便於將所述活性化合物加工成藥學上可使用的製劑的賦形劑和輔料。配製成用於口服給藥的製劑可以呈片劑、錠劑、膠囊劑或溶液劑的形式。
本文所述的藥物以及用於本文所提供的方法中的藥物可包括一種或多種以下成分防腐劑、增溶劑、穩定劑、潤溼劑、乳化劑、甜味劑、著色劑、香味劑、鹽、緩衝劑、包衣劑或抗氧化劑。它們也可含有除所述化合物和/或本文所述藥物之外的治療活性藥物。通過將活性化合物與固體賦形劑混合，任選研磨所得混合物，並且如果需要在加入合適的輔料後，加工顆粒狀混合物，以得到片心或錠心，可以獲得供口服用的藥物製劑。具體地講，合適的賦形劑是填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑，例如玉米澱粉、小麥澱粉、大米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、西黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基-纖維素、羧甲基-纖維素鈉(CMC)和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP聚維酮碘)。如果需要，可以加入崩解劑，例如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。
可用於口服的藥物製劑包括由明膠製成的鎖口型(push-fit)膠囊以及由明膠和增塑劑(例如甘油或山梨醇)製成的密封軟膠囊。鎖口型膠囊可含有活性成分以及乳糖等填充劑、澱粉等粘合劑和/或滑石粉或硬脂酸鎂等潤滑劑，任選穩定劑。在軟膠囊劑中，活性化合物可以溶於或懸浮於合適的液體例如脂肪油、液狀石蠟或液體聚乙二醇(PEG)中。另外，可以加入穩定劑。
給藥途徑下面將會更詳細考慮不同的給藥途徑a.口服給藥適合於口服給藥的藥物可以是膠囊劑或片劑；散劑或顆粒劑；溶液劑、糖漿劑或混懸劑(在水或非水液體中)；食用泡沫劑(foams)或泡沫劑(whips)；或乳劑。
片劑或硬明膠膠囊劑可以包含乳糖、玉米澱粉或其衍生物、硬脂酸或其鹽。
軟明膠膠囊劑可以包含植物油、蠟、油脂、半固體或液體多元醇等。
溶液劑和糖漿劑可包含水、多元醇和糖。對於製備混懸劑來說，可以使用油(例如植物油)，以提供水包油或油包水混懸劑。
b.經皮給藥適於經皮給藥的藥物可以是設計在一段較長時間內與受體皮膚保持密切接觸的透氣型貼劑(discrete patch)。例如，可通過離子導入法，給予貼劑中的活性成分(離子導入法描述於PharmaceuticalResearch，3(6)318(1986))。
c.局部給藥適於局部給藥的藥物可以是軟膏劑、乳膏劑、混懸洗劑、散劑、溶液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑。
對於眼部感染或口腔和皮膚等其它外部組織感染來說，最好使用局部軟膏劑或乳膏劑。當配製軟膏劑時，可以將活性成分與石蠟或水混溶性軟膏基質混合。或者，可以將活性成分與水包油基質或油包水基質一起配製成乳膏劑。
適於眼部局部給藥的藥物包括滴眼劑。此時，活性成分可溶解或懸浮在合適載體例如水性溶劑中。
適於口腔局部給藥的藥物包括糖錠劑、軟錠劑和漱口劑。
d.直腸給藥適於直腸給藥的藥物可以是栓劑或灌腸劑。
e.鼻腔給藥使用固體載體的適於鼻腔給藥的藥物包括粗粉(例如粒徑範圍在20-500微米)。這可以以吸入的方式給藥，即從靠近鼻子的盛有粉劑的容器中通過鼻腔快速吸入。
使用液體載體的適於鼻腔給藥的組合物包括鼻腔噴霧劑或滴鼻劑。這些可包含活性成分的水性或油性溶液劑。
適於通過吸入給藥的藥物包括微粒粉劑或霧劑，它們可由不同種類的儀器產生，例如加壓的氣溶膠、噴霧器或吹藥器。可以製造這些儀器，以便提供預先確定的活性成分的劑量。
f.胃腸外給藥適於胃腸外給藥的藥物包括水性和非水性無菌注射溶液劑或混懸劑。它們可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑和賦予組合物與預定受體的血液基本等滲的溶質。所述組合物中可以存在的其它成分包括例如水、乙醇、多元醇、甘油和植物油。適於胃腸外給藥的組合物可以呈單劑量或多劑量容器形式，例如密封的安瓿和小瓶，並且可以在冷凍-乾燥(凍幹)條件下貯存，只需在臨用前加入無菌液體載體例如無菌注射用水即可。可從無菌粉針劑、顆粒劑和片劑製備臨用注射溶液劑。
g.劑量可通過常規試驗，容易地確定劑量，並且在主治醫生或臨床醫生的監控下進行。確定合適劑量的指導原則是給予合適而有效且無毒或可接受毒性的材料劑量(參見例如Fingl等，(1975)ThePharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1頁)。對於NN-DNJ或類似化合物，預計成人日劑量可以在0.1mg-5g活性藥物的範圍內，可以在3mg-2400mg範圍內，最好在5mg-800mg範圍內，更優選在15mg-400mg，最優選15mg-100mg。每天可以給予單次日劑量，或者每天給予2次、3次或更多次劑量。
以下實施例僅僅用來說明上述方法；它們並不是用來以任何方式限制本發明範圍的。
實施例1.誘導p7在細菌中表達下面一組實驗證明，可誘導p7在細菌中表達。本實驗可用於確定p7或p7變體是否能透化膜。實驗也顯示出p7的表達導致細胞生長的停止，此外，p7的表達導致放射性標記尿苷的釋放。
實施例1.1.材料與方法p7表達質粒的構建。採用標準克隆方法，通過DNA操作構建重組質粒。通過聚合酶鏈式反應(PCR)，使用作為模板的編碼質粒pTM1/CE1E2p7的HCV 1a株的cDNA(AF009606)(由J.Dubuisson友好提供)，擴增HCV p7的編碼區。使用以下2個寡核苷酸引物進行PCR反應引物1，AAGCGCCCATGGCTTTGGAGAACCTCGTAATAC(SEQ ID NO.2)和引物2，ATTGAATTCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTGGTGGTATGCCCGCTGAGGCAAC(SEQ ID NO.3)。引物1和引物2分別編碼p7的5′端區和3′端區。為了在5′端產生NcoI限制位點，在3′端產生EcoRI限制位點，將下劃線序列引入引物中。純化所得PCR產物，用NcoI和EcoRI限制酶(Roche)消化，並與事先已用NcoI和EcoRI消化的pTriEx1.1表達載體(Novagen)連接。連接混合物用於轉化感受態大腸桿菌R.gami(DE3)pLacl細胞(CN Biosciences)。含有重組質粒的細菌克隆在含有50μg/ml羧苄西林(Sigma)的培養基中擴增。分離質粒DNA，進行限制性分析，並且使用用於T7啟動子的引物和引物2進行測序，以便排除在PCR反應中引入突變的可能性。所分離的含p7質粒命名為pTriEx1.1p7。
誘導p7在細菌中表達。在37℃，在50μg/ml羧苄西林存在下，將含有pTriEx1.1或pTriEx1.1 p7質粒的大腸桿菌R.gami(DE3)pLacl細胞的單菌落在LB培養基中振蕩培養，直到它們的OD600nm達到0.5為止。將3ml這樣的起始培養物加入到含有50μg/ml羧苄西林和0.4％葡萄糖的100ml LB培養基中，並將細胞在同樣條件下培養。當細胞的OD600nm達到0.5-0.7時，通過加入1mM異丙基硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)(Roche)誘導p7表達，並通過監測OD600n跟蹤它們的進一步生長。未轉化細菌(沒有pTriEx1.1質粒)在沒有羧苄西林時生長。
細菌細胞釋放[3H]-尿苷。如上所述培養細菌，但是這次是在2μCi/ml[3H]-尿苷(Amersham，UK)存在下培養，直到它們的OD600nm達到0.5為止。然後沉澱細胞，用PBS洗滌3次並重懸浮在25ml生長培養基中。15分鐘後，通過加入1mM IPTG誘導p7表達。誘導後，在不同時間取出0.5ml試樣，將細胞通過離心沉澱，上清液與3.5mlUltima Gold閃爍混合劑(Packard，UK)混合，使用Beckman LS 3801閃爍計數器，通過閃爍計數測定釋放到培養基中的放射性。
實施例1.1.結果誘導p7在細菌中表達。為了評價HCV p7對膜通透性的影響，使用受嚴格控制的T7 lac啟動子調節的IPTG誘導型系統，讓p7在大腸桿菌Rosetta gami(DE3)pLacl細胞中表達(參見Dubendorff，J.W.和F.W.Studier，(1991)J. Mol.Biol.219(1)第45-59頁)。Rosetta gami(DE3)pLacl細胞攜帶處於lacUV5啟動子控制之下的染色體拷貝T7RNA聚合酶，並且從pLacl質粒提供足夠的lac阻抑物，以保證在未誘導狀態下的嚴格性表達(參見Studier，F.W.和B.A.Moffatt，(1986)J.Mol.Biol.189(1)第113-30頁)。用IPTG誘導後，通過監測不同時間的細胞密度，跟蹤p7表達對宿主細胞的影響。IPTG的加入對非轉化細胞(圖A，上圖)和pTriEx1.1轉化的細胞(圖B，上圖)沒有影響，然而p7的表達導致細胞群體生長的停止(圖1C，上圖)，很可能是因為在大腸桿菌細胞膜上形成孔。
為了分析化合物從表達HCV p7的細菌內流出，給重組克隆加載放射性標記的尿苷，並在誘導後測定不同時間點的放射性的釋放(圖1，下圖)。在非轉化細胞或攜帶親代質粒的克隆中沒有觀察到顯著流出[3H]-尿苷(圖1A和圖B，下圖)。在誘導p7合成2小時後，表達p7的細胞開始向培養基中釋放[3H]-尿苷。在4小時的監測周期中，[3H]-尿苷的釋放增加(圖1C)，表明p7誘導外細胞膜的通透性。
實施例2.合成的p7摻入到BLM中下面一組實驗證明，根據通道記錄測定，合成的p7可增加BLM的通透性。實驗也顯示出長鏈烷基亞氨基糖衍生物抑制p7活性。
實施例2.1.材料與方法.
肽的合成和產物質量控制。由英國的Albachem合成N-端加有生物素-標記的50mg相當於p7(HCV H株)的肽(生物素-ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.4))。使用基體輔助雷射解吸電離質譜(MALDI-MS)分析p7肽將p7蛋白溶於40％乙腈中，得到含有1mg/ml肽的溶液。將1μl該溶液試樣與1μl含有16mM辛基-葡糖苷溶液的飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸的95∶5乙腈/水(v/v)溶液混合。將該混合物試樣(1μl)置於質譜儀靶中並讓其風乾。用胰蛋白酶自溶物對測得的質量進行外標。用TofSpec 2E質譜儀(Micromass，Wythenshawe，Manchester，UK)，在反射模式下操作，記錄質譜。源電壓、提取電壓和聚焦電壓分別為20000V、19950V和16000V。所有數據都運用Mass Lynx版本3.2軟體進行分析。按照MALDI質譜分析，觀察到對應於全長p7肽的峰，即在m/z 7247.8。
為了測定全長肽的純度，使用以下方法的修改版本，將所述肽再進行Tris-Tricine凝膠電泳Schgger和yon Jagow，(1987)Anal.Biochem.，166(2)第368-79頁。簡而言之，將溶於40％乙腈/水(500μg/ml)的p7(5μg)在Tricine樣品緩衝液中加樣到凝膠(8×10cm2)上，所述凝膠由分離膠(20.18％T，0.83％C)、間隔膠(11.44％T，0.34％C)和濃縮膠(10.9％T，0.32％C)組成，其中T是單體(丙烯醯胺和雙丙烯醯胺)濃度的總百分數，而C是相對於T來說的交聯劑濃度的百分數。在30V恆壓下進行凝膠電泳，直到樣品完全進入濃縮膠後，將電壓升至110V。
通過銀染色和蛋白質印跡分析凝膠。對於銀染色，將凝膠在50％甲醇中洗滌10分鐘，然後在5％甲醇中洗滌10分鐘。然後將凝膠在40μM DTT溶液中孵育10分鐘，然後用水衝洗並在0.1％AgNO3水溶液中孵育10分鐘。隨後用水洗滌3次，共10秒鐘，然後加入顯影液(7.5g NaCO3，125μl甲醛的250ml水)。通過加入固體一水檸檬酸，終止顯影過程。將凝膠用水衝洗並浸泡在35％乙醇/2％甘油中，然後乾燥。
對於蛋白質印跡分析，用半乾電印跡儀(2小時，40mA)(Merek)，將凝膠上的蛋白在轉移緩衝液(24mM Tris鹼，192mM甘氨酸，20％甲醇)中轉移到Immobilon P膜(Amersham，UK)上。將該膜在含有3％牛奶的PBS-0.1％Tween中封閉過夜，然後在室溫下與辣根過氧化物酶偶聯的鏈黴抗生物素(1μg/ml的PBS-0.1％Tween，1％牛奶)一起孵育3小時。然後在PBS-0.1％Tween、1％牛奶中洗滌2次，然後按照製造商的說明書，用ECL檢測系統(Amersham，UK)進行顯影。
銀染色凝膠和蛋白質印跡兩者都顯示出預期分子量的一種主要種類(圖2)，表明至少部分加樣的蛋白含有全長生物素醯化p7蛋白。然而，因為以前曾觀察到有和沒有尿素的凝膠之間解析度的差異，所以在沒有尿素情況下重新分析化學合成的p7。雖然鏈黴抗生物素探測的蛋白質印跡顯示全長生物素醯化p7的存在，但是在銀染色凝膠上觀察到約為一半表觀分子量的額外的寬條帶，所述條帶佔總p7的50％-60％。該寬條帶相當於通過質譜觀察到的來自較小的非生物素醯化p7的種類，其質量理論上相當於含有N-端跨膜結構域的p7片段。因為已證明難以從p7的截短形式分離出全長p7，所以隨後將其混合物用於在黑脂膜中進行通道記錄。
黑脂膜(BLM)中的通道記錄。製備BLM以研究膜動力學，是本領域眾所周知的。在聚四氟乙烯薄膜(厚度約25μm，Yellow SpringsInstruments，Ohio，USA)中，形成的BLM跨越橢圓形小孔，其長軸直徑約為100μm(參見Montal，M.和P.Mueller，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69(12)第3561-6頁)。將40μl脂質混合物(1-棕櫚醯-2-油醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)∶1-棕櫚醯-2-油醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(POPC)(4∶1(w/w))溶於戊烷(5mg/ml)中，並鋪在水性面下相的上面(0.5M KCl，5mM HEPES，1mM CaCl2，pH 7.4)。這使得約0.2mg脂質沉積在聚四氟乙烯薄膜的每一面上。讓溶劑蒸發10分鐘後，通過提高聚四氟乙烯膜孔上方小室的緩衝液水平，形成BLM。形成穩定的BLM後，從200倍過量貯液，將HCV p7蛋白(溶於乙醇)加入到接地的水性面下相(雙層每邊小室中的體積2ml)，反面小室達到終濃度約為50μM。時間延遲約10分鐘後，出現記錄。用Axopatch 1 D放大器，在5kHz頻率下記錄電流。數據用50Hz的截止頻率進行過濾，然後用軟體Origin 5.0進行分析。或在正面或在反面加入藥物(來自NN-DNJ(Synergy Pharmaceuticals)、NN-DGJ(Toronto Research Chemicals)和N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ(United Therapeutics Inc.)的10mM貯液，以及來自NB-DNJ(Sigma)和NB-DGJ的100mM貯液)。通過向測試室中序貫加入等體積，來增加藥物濃度。加入藥物約1分鐘後，在+100mV記錄數據達約3分鐘。
實施例2.2.結果將p7摻入到BLM中。根據記錄跨BLM通道信號的測定，將p7加入到緩衝液小室增加BLM通透性。在-100mV，通道電導水平上升至2nS(圖3A)。在+50mV所測最小平均電導水平約為86±22pS(表1)。
表1
表1p7的電導水平。數據來自圖3A的記錄，表示為平均值±平均值的標準誤，如括號內所示。根據1秒時間段的記錄來計算平均值。
*來自1秒時間段的平均值和標準差**從目測曲線確定數值特定電導水平的壽命範圍從幾百毫秒到幾分鐘。穩定的長期持續的電導狀態以約100pS(和100pS的倍數)的間隔變化，表明形成相對穩定的通道，其電導約為100pS。記錄的波動可顯示亞電導狀態的存在。圖3B中顯示了在+100mV進行記錄的柱狀圖的實例。延長對同一樣品的測量，導致增加的噪聲水平，這最終排除了對特定電導水平的設定(圖3C)。在一些實驗中，將p7插入到BLM中，產生脈衝樣活性(例如圖4，左上圖)。
對含有生物素-p7蛋白的膜進行鏈黴抗生物素金染色，隨後通過透射電鏡術檢測該複合物，表明生物素-p7蛋白象通道(數據未顯示)，正如對生物合成-合成HCV p7所報導的一樣(參見Griffin等，FEBSLetters，2003年1月20日；535(1-3)34-8)。(另見Pavlovic等，PNAS 2003年5月13日；100(10)6104-8)。
無論是包括跨膜結構域I(″TMD I″)(例如ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLK(SEQ ID NO.5))的肽還是包括跨膜結構域II(″TMD II″)(例如GRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.6))的肽加入到BLM中，都不能獨自形成通道，對其測定表明，缺乏通道信號(數據未顯示)。甚至將這兩個結構域加入到BLM中，也不形成通道(數據未顯示)。
將藥物濃度逐漸增加的亞氨基糖衍生物加入到膜一側的緩衝液中，測定它們對p7誘導的通道活性的效應。對於短鏈烷基衍生物NB-DGJ和NB-DNJ，p7通道活性保持不變(圖4，上圖)。同樣，高達3.0mM的N-辛基葡糖苷對通道活性也沒有影響(數據未顯示)。然而，加入更多的長鏈烷基衍生物NN-DGJ、NN-DNJ和N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，導致對p7通道信號的劑量依賴性抑制(圖4，下圖和圖5)。從所得歸一化總電流曲線的曲線示意圖和它們各自的S擬合(圖6)，推導出近似結合常數為對於NN-DGJ，Kapp＝110.4(±19.9)μM，對於NN-DNJ，Kapp＝45.2(±10.7)μM，對於N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ，Kapp＝114.2(±18.3)μM。對於NN-DGJ，在約140μM觀察到通道活性被完全阻斷，而對於NN-DNJ在105μM、對於N7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ在180μM觀察到通道活性被完全阻斷。在增加任何藥物濃度時，沒有觀察到漏電流。
同樣，加入更多的長鏈烷基衍生物SP240(即N-10-氧雜十一烷基-1，6-二脫氧半乳糖野尻黴素)，導致對p7通道信號的劑量依賴性抑制(圖7)。對於SP240，在約100μM觀察到通道活性被完全阻斷。
本說明書引用的所有專利和其它參考文獻都預示著本發明所屬領域技術人員的技術水平，並且通過引用包括任何表格和附圖在內的全部內容結合到本文中，其程度與每篇參考文獻各自通過引用全部結合到本文中一樣。
本領域技術人員將容易理解，可以適當地修改本發明以獲得結果和所提到的優勢以及固有的優勢。作為代表性的優選實施方案的本文所述方法、變化和化合物/組合物都是示例性的，並不是為了限制本發明的範圍。對於本領域技術人員來說，那些改變和其它用途全都包括在本發明中。
對本領域技術人員顯而易見的是，可以在不偏離本發明的範圍和精神的情況下，對在此公開的本發明進行不同的取代和修改。例如，可以利用各種不同的結合對，以及各種不同的治療藥和診斷藥。因此，所述額外的實施方案都包括在本發明的範圍之內。
在缺乏本文未具體公開的任何要素和限制的情況下，可以適宜地實施本文說明性地描述的本發明。因此，例如，在各種情況下，術語「包括」、「基本由...組成」和「由...組成」中的任一個都可以用其它兩個術語來替換。所用的術語和短語可用作描述性而不是限制性的術語和短語，而且不會在使用所述術語和短語時排除任何等同的所示、所述的特徵或其部分，但是人們知道，在本發明範圍內可以進行不同的修改。因此，人們應理解，儘管已經通過優選實施方案具體公開了本發明，但是本領域技術人員也可採用本文公開構思的任選特徵、修改和變化，並且所述修改和變化被認為是在本發明的範圍之內。
另外，當按照馬庫什化合物或其它分類的替代化合物描述本發明的特徵或方面時，本領域技術人員將會知道，也因此按照馬庫什化合物或其它化合物的任何各個成員或成員亞類來描述本發明。
另外，除非有相反的說明，當實施方案中提供各種數值時，採用任何2個不同數值作為範圍的端點來描述額外的實施方案。其範圍也包括在本發明的範圍之內。
權利要求
1.一種治療C型肝炎病毒(HCV)感染的方法，所述方法包括給予有需要的患者選自式I化合物或式II化合物、其相關異構體、藥學上可接受的鹽和溶劑合物的化合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH。
2.權利要求1的方法，所述方法還包括使HCV p7蛋白和含有p7蛋白的膜組分中的一個或它們兩個與所述化合物接觸。
3.權利要求1的方法，其中所述化合物是式I化合物。
4.權利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為-CH2OH。
5.權利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少一個為-OH。
6.權利要求3的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
7.權利要求6的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
8.權利要求3的方法，其中R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15和R15′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
9.權利要求8的方法，其中所述化合物是選自以下的化合物 相關異構體及其混合物。
10.權利要求9的方法，其中所述化合物是選自下表給出的化合物
11.權利要求1的方法，其中所述化合物是選自以下的化合物及其混合物
12.權利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
13.權利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
14.權利要求11的方法，其中R2為直鏈C7-18烷基。
15.權利要求14的方法，其中R2為直鏈C7-11烷基。
16.權利要求15的方法，其中R2為正壬基。
17.權利要求11的方法，其中R2為被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。
18.權利要求17的方法，其中R2為7-氧雜壬基。
19.權利要求17的方法，其中R2為10-十一烷基。
20.權利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DNJ。
21.權利要求1的方法，其中所述化合物是N-壬基-DGJ。
22.權利要求1的方法，其中所述化合物是N-7-氧雜壬基-6-脫氧-DGJ。
23.權利要求1的方法，其中所述化合物是N-10-氧雜十一烷基-甲基-DGJ。
24.權利要求1的方法，其中所述化合物是式II化合物。
25.權利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為-CH2OH。
26.權利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少一個為-OH。
27.權利要求24的方法，其中R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′中的至少兩個選自-CH3、-CH2OH和-OH。
28.權利要求27的方法，其中R4為直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基或取代的C1-18烷基。
29.權利要求27的方法，其中R4為直鏈C7-11烷基、支鏈C7-11烷基或取代的C7-11烷基。
30.權利要求27的方法，其中R4為被C1-6烷氧基取代的直鏈或支鏈C1-18烷基。
31.權利要求27的方法，其中R4為正壬基。
32.權利要求27的方法，其中R4為7-氧雜壬基。
33.權利要求27的方法，其中R4為10-氧雜十一烷基。
34.權利要求2的方法，其中含有p7蛋白的膜相對於不含p7蛋白的膜來說具有增加的通透性，並且所述化合物降低增加的通透性。
35.權利要求34的方法，其中所述化合物抑制通道的形成。
36.權利要求34的方法，其中所述化合物是通道阻斷劑。
37.權利要求1的方法，其中所述患者是人。
38.一種用於篩選潛在HCV抗病毒藥的方法，所述方法包括將p7蛋白和變體中的至少一個摻入到膜中，以產生含有p7的膜，其中所述含有p7的膜相對於不含p7的膜來說具有增加的通透性；使含有p7的膜的一種或多種組分與試驗化合物接觸；將其中一種或多種組分已經接觸試驗化合物的含有p7的膜的通透性與其中沒有組分接觸試驗化合物的含有p7的膜的通透性進行比較。
39.權利要求38的方法，其中所述p7蛋白選自HCV分化體1的成員。
40.權利要求38的方法，其中所述p7蛋白包含胺基酸序列ALENLVILNAASLAGTHGLVSFLVFFCFAWYLKGRWVPGAVYALYGMWPLLLLLLALPQRAYA(SEQ ID NO.1)
41.權利要求38的方法，其中所述p7變體包含至少一個跨膜結構域。
42.權利要求41的方法，其中所述p7變體包含至少一個從所選p7蛋白的大約位置10到大約位置32的胺基酸序列，以及從大約位置36到大約位置58的胺基酸序列。
43.權利要求41的方法，其中所述跨膜結構域中大於約70％的胺基酸是以下成員F、I、W、Y、L、V、M、P、C和A。
44.權利要求38的方法，其中所述p7變體包含生物素醯化p7蛋白。
45.權利要求38的方法，其中使所述p7蛋白與試驗化合物接觸。
46.權利要求38的方法，其中通過記錄跨膜電流來比較通透性。
47.權利要求38的方法，其中所述膜包括黑脂膜。
48.權利要求38的方法，其中所述試驗化合物抑制通道的形成。
49.權利要求38的方法，其中所述試驗化合物是通道阻斷劑。
50.權利要求38的方法，其中所述試驗化合物選自式I化合物或式II化合物、其相關異構體、藥學上可接受的鹽和溶劑合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH；-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基；其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1- 6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH。
51.權利要求38的方法，其中所述試驗化合物是金剛烷胺或其衍生物。
52.一種用於治療C型肝炎病毒(HCV)感染的試劑盒，所述試劑盒包括(A)式I化合物或式II化合物、其相關異構體、藥學上可接受的鹽或溶劑合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12＇、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為各自獨立選自以下的取代基直鏈C7-18烷基、取代的C1-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基；其中每個直鏈C7-18烷基、支鏈C3-18烷基、C2-18烯基和炔基和芳烷基可任選被取代，且每個取代的C1-18烷基被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基，芳氧基；芳烷氧基；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH；和(B)用於治療HCV感染的說明書。
53.一種式I化合物或式II化合物、其相關異構體、藥學上可接受的鹽或溶劑合物的組合物 其中每個取代基R11、R11′、R12、R12′、R13、R13′、R14、R14′、R15、R15′、R31、R31′、R32、R32′、R33、R33′、R34和R34′各自獨立選自-H；-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN；-NO2；-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；-NHOH；芳基；和雜芳基，其中每個取代基可以相同或不同；其中每個烷基、烯基、炔基、芳基和雜芳基部分可任選被一個或多個獨立選自以下的基團取代-OH；-F；-Cl；-Br；-I；-NH2；烷基氨基和二烷基氨基；直鏈或支鏈C1-6烷基，C2-6烯基和炔基；芳烷基；直鏈或支鏈C1-6烷氧基；芳氧基；芳烷氧基；-(亞烷基)氧基(烷基)；-CN，-NO2，-COOH，-COO(烷基)；-COO(芳基)；-C(O)NH(C1-6烷基)；-C(O)NH(芳基)；磺醯基；(C1-6烷基)磺醯基；芳基磺醯基；氨磺醯基，(C1-6烷基)氨磺醯基；(C1-6烷基)硫基；(C1-6烷基)磺醯胺基；芳基磺醯胺基；-NHNH2；和-NHOH；且R2和R4為10-氧雜十一烷基。
全文摘要
公開了通過給予有效抑制C型肝炎病毒(HCV)p7蛋白活性的亞氨基糖衍生化合物而治療HCV感染的方法和試劑盒，以及用於篩選抑制p7蛋白或其變體活性的化合物的方法。所公開的N－取代亞氨基化合物及其藥用組合物抑制HCV p7透化膜的能力。特別有效的化合物是衍生自N－烷基化哌啶的亞氨基糖。也公開了用於篩選潛在HCV抗病毒藥的方法。
文檔編號A61K31/40GK1694696SQ03825200
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月23日 優先權日2002年9月23日
發明者尼科爾·齊特茲曼, 雷蒙德·德韋克 申請人:牛津大學校委會