一種腎衰寧片有效成分的測定方法與流程
2023-05-27 16:43:11
本發明涉及一種中藥檢測方法,特別涉及一種腎衰寧片有效成分的測定方法。
背景技術:
腎衰寧片為一種已經上市的中成藥,配方為:太子參、黃連、半夏(制)、陳皮、茯苓、大黃、丹參、牛膝、紅花、甘草。
腎衰寧片具有益氣健脾,活血化瘀,通腑洩濁功效。用於脾失運化,瘀濁阻滯,升降失調所引起的腰痛疲倦,面色萎黃,噁心嘔吐,食欲不振,小便不利,大便粘滯及多種原因引起的慢性腎功能不全見上述症候者。
現有腎衰寧片的檢測方法主要包括:大黃的鑑別,黃連的鑑別,丹參的鑑別,以及鹽酸小檗鹼含量的測定,和丹參素含量測定,其中鹽酸小檗鹼含量測定方法採用分光光度法,在345nm的波長處測定吸收度,按鹽酸小檗鹼的吸收度計算含量。其中丹參素含量測定採用高效液相色譜法,選擇處方中丹參的有效成分丹參素作為含量指標,採用HPLC法進行測定,色譜條件流動相:磷酸鹽緩衝液(0.5%Nail2P04-0.03%H3P04):甲醇=95:5;檢測波長220nm;流速:lml/ml;色譜柱:Purospher STAR RP一18e,5um(1504.6mn);柱
但由於腎衰寧片化學成分種類較多且理化性質差異較大,僅對製劑中少數成分進行定量的方法評價製劑的質量,過於片面;很難完整表徵其化學特徵。
中藥指紋圖譜可以從分析角度完整的體現中藥的化學成分,從而實現對中藥的質量控制。因此建立腎衰寧片指紋圖譜,可較為直觀、全面地反映製劑的整體質量。本發明針對中藥製劑腎衰寧片,建立了指紋圖譜的評價方法,研究以系統指紋實現對製劑的整體質量評價。
技術實現要素:
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本發明公開了一種腎衰寧片的檢測方法,所述方法包括如下步驟:
步驟1:對照品溶液製備
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每0.8-1.2ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚8-12μg的溶液,即得。
步驟2:對照藥材溶液製備
分別取太子參(0.4-0.6g)、黃連(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陳皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黃(0.7-0.9g)、丹參(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、紅花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70-90%甲醇20-30ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟3:供試品溶液製備
取樣品粉末0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟4:測定法
分別取對照品溶液和供試品溶液各5-15μL,分別注入液相色譜儀檢測,記錄色譜圖,將所得色譜圖與標準指紋圖譜進行對照比較。
優選的,本發明的檢測方法,包括如下步驟:
步驟1:對照品溶液製備
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每1ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚10μg的溶液,即得。
步驟2:對照藥材溶液製備
分別取太子參(0.5g)、黃連(0.2g)、半夏(0.5g)、陳皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黃(0.8g)、丹參(1.0g)、牛膝(0.4g)、紅花(0.2g)、甘草(0.2g)等藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟3:供試品溶液製備
取含量測定項下的樣品粉末,取約1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟4:測定法
分別取對照品溶液和供試品溶液各1-6μL,分別注入液相色譜儀檢測,記錄色譜圖,將所得色譜圖與標準指紋圖譜進行對照比較。
其中所述標準指紋圖譜是經過對多批合格樣品進行高效液相色譜檢測,記錄色譜圖,並參考參照物的色譜圖經過計算機統計計算,生成得到的標準高效液相色譜圖。
本發明所述的檢測方法是對未知樣品進行高效液相色譜檢測,得到色譜圖,將所得色譜圖和上述標準指紋圖譜進行對比,相似度高於90%則為合格樣品,否則為不合格樣品。
為得到腎衰寧片的標準指紋圖譜,本發明進一步研究出一種腎衰寧片高效液相指紋圖譜建立方法,所述方法包括如下步驟:
1)合格樣品溶液的製備:
取合格的腎衰寧片,粉碎成粉末,取0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用45-55%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2)參照物溶液的製備:
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每0.8-1.2ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚8-12μg的溶液,即得。
另,分別取太子參(0.4-0.6g)、黃連(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陳皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黃(0.7-0.9g)、丹參(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、紅花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70-90%甲醇20-30ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
3)檢測:將合格樣品溶液和參照物溶液分別注入液相色譜儀,測定,得到色譜圖。
4)經過對多批次合格樣品進行測定,所得色譜圖綜合後,最終得到標準對照指紋圖譜,共有15個標記峰,其中2、6號峰為丹參特徵峰,3、5、9、10、11、12、13、14、15號峰為大黃特徵峰,4號為陳皮特徵峰、8號為黃連特徵峰。
優選的,本發明的腎衰寧片高效液相指紋圖譜建立方法,包括如下步驟:
1)合格樣品溶液的製備:
取合格的腎衰寧片,粉碎成粉末,取0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用45-55%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2)參照物溶液的製備:
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每1ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚10μg的溶液,即得。
另,分別取太子參(0.5g)、黃連(0.2g)、半夏(0.5g)、陳皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黃(0.8g)、丹參(1.0g)、牛膝(0.4g)、紅花(0.2g)、甘草(0.2g)等藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
3)檢測:將合格樣品溶液和參照物溶液分別注入液相色譜儀,測定,得到色譜圖。
4)經過對多批次合格樣品進行測定,所得色譜圖綜合後,最終得到標準對照指紋圖譜,共有15個標記峰,其中2、6號峰為丹參特徵峰,3、5、9、10、11、12、13、14、15號峰為大黃特徵峰,4號為陳皮特徵峰、8號為黃連特徵峰。
本發明是在現有技術的基礎上對有關檢測方法進行篩選,最終得到一種實用有效的指紋圖譜檢測方法。
本發明的篩選方法如下:
1儀器與試藥
儀器:Shimadzu 20A高效液相色譜儀(四元泵,DAD檢測器)
試劑:乙腈為色譜純,水為去離子水,其它試劑均為分析純。
2色譜條件
色譜柱:Agilent Extend C18(4.6×250mm,5μm)
流動相:以乙腈為流動相A,以0.1%的磷酸為流動相B,按下表中的規定進行梯度洗脫;流速為1.0ml/min;檢測波長為280nm;柱溫為30℃,進樣量10μl。
流動相梯度洗脫表
3供試品溶液的製備取含量測定項下的樣品粉末,取約1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
4、對照溶液製備
4.1對照品溶液製備取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每1ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚10μg的溶液,即得。
4.2對照藥材溶液製備分別取太子參(0.5g)、黃連(0.2g)、半夏(0.5g)、陳皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黃(0.8g)、丹參(1.0g)、牛膝(0.4g)、紅花(0.2g)、甘草(0.2g)等藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
色譜峰的歸屬
樣品共有15個標記峰,經與對照藥材比對,其中2、6號峰為丹參特徵峰,3、5、9、10、11、12、13、14、15號峰為大黃特徵峰,4號為陳皮特徵峰、8號為黃連特徵峰。
5方法學考察
5.1重複性試驗取同一批樣品,同時製備6份供試品溶液,分別進樣測定。結果各共有峰的相對保留時間RSD值在0.05-0.1%之間,相對峰面積RSD值在2.1-3.5%之間,表明重複性良好。
5.2精密度試驗取同一供試品溶液,連續進樣6次,測定指紋圖譜。結果各共有峰的相對保留時間RSD值在0.01~0.2%之間,相對峰面積為RSD值在1.2~2.1%之間,表明精密度良好。
5.3穩定性試驗取同一份供試品溶液,分別在0、4、8、12、15、24小時進樣測定,結果各共有峰的相對保留時間RSD值在0.03-0.4%之間,相對峰面積值在1.1-2.3%之間,表明供試品至少在24內穩定。
6對照指紋圖譜的生成及相似度計算
取10批樣品,按正文方法進行測定,將測定結果導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統,生成對照指紋圖譜。按相似度評價系統,將供試品指紋圖譜與生成的對照指紋圖譜進行相似度計算,結果見下表。
10批樣品的相似度分析結果
和現有技術相比,本發明準確度高,靈敏度高,穩定性好,重現性好,操作簡單實用,取得了意料不到的技術效果。
附圖說明
圖1,樣品色譜圖
圖2,丹參素鈉色譜圖
圖3,丹酚酸B色譜圖
圖4,橙皮苷色譜圖
圖5,鹽酸小檗鹼色譜圖
圖6,蘆薈大黃素色譜圖
圖7,大黃素色譜圖
圖8,大黃酸色譜圖
圖9,大黃酚色譜圖
圖10,大黃素甲醚色譜圖
圖11,陳皮色譜圖
圖12,大黃色譜圖
圖13,丹參色譜圖
圖14,黃連色譜圖
圖15,甘草色譜圖
圖16,法半夏色譜圖
圖17,茯苓色譜圖
圖18,紅花色譜圖
圖19,牛膝色譜圖
圖20,太子參色譜圖
圖21,標準指紋圖譜
圖22,10批樣品相似度圖譜
具體實施方式
以下通過實施例進一步說明本發明。
實施例1
步驟1:對照品溶液製備
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每0.8-1.2ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚8-12μg的溶液,即得。
步驟2:對照藥材溶液製備
分別取太子參(0.4-0.6g)、黃連(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陳皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黃(0.7-0.9g)、丹參(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、紅花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70-90%甲醇20-30ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟3:供試品溶液製備
取樣品粉末0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟4:測定法
分別取對照品溶液和供試品溶液各5-15μL,分別注入液相色譜儀檢測,記錄色譜圖,將所得色譜圖與標準指紋圖譜進行對照比較。
優選的,本發明的檢測方法,包括如下步驟:
步驟1:對照品溶液製備
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每1ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚10μg的溶液,即得。
步驟2:對照藥材溶液製備
分別取太子參(0.5g)、黃連(0.2g)、半夏(0.5g)、陳皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黃(0.8g)、丹參(1.0g)、牛膝(0.4g)、紅花(0.2g)、甘草(0.2g)等藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟3:供試品溶液製備
取含量測定項下的樣品粉末,取約1.0g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇50ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用50%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
步驟4:測定法
分別取對照品溶液和供試品溶液各1-6μL,分別注入液相色譜儀檢測,記錄色譜圖,將所得色譜圖與標準指紋圖譜進行對照比較。
本發明進一步公開一種腎衰寧片高效液相指紋圖譜建立方法,所述方法包括如下步驟:
1)合格樣品溶液的製備:
取合格的腎衰寧片,粉碎成粉末,取0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用45-55%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2)參照物溶液的製備:
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每0.8-1.2ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼45-55μg、含丹酚酸B、橙皮苷80-120μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚8-12μg的溶液,即得。
另,分別取太子參(0.4-0.6g)、黃連(0.18-0.22g)、半夏(0.4-0.6g)、陳皮(0.18-0.22g)、茯苓(0.3-0.5g)、大黃(0.7-0.9g)、丹參(0.8-1.2g)、牛膝(0.3-0.5g)、紅花(0.18-0.22g)、甘草(0.18-0.22g)藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入70-90%甲醇20-30ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
3)檢測:將合格樣品溶液和參照物溶液分別注入液相色譜儀,測定,得到色譜圖。
4)經過對多批次合格樣品進行測定,所得色譜圖綜合後,最終得到標準對照指紋圖譜,共有15個標記峰,其中2、6號峰為丹參特徵峰,3、5、9、10、11、12、13、14、15號峰為大黃特徵峰,4號為陳皮特徵峰、8號為黃連特徵峰。
優選的,本發明的腎衰寧片高效液相指紋圖譜建立方法,包括如下步驟:
1)合格樣品溶液的製備:
取合格的腎衰寧片,粉碎成粉末,取0.8-1.2g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入45-55%甲醇45-55ml,密塞,稱定重量,超聲處理25-35分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用45-55%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
2)參照物溶液的製備:
取丹參素鈉、丹酚酸B、橙皮苷、鹽酸小檗鹼、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量,精密稱定,加甲醇分別製成每1ml含丹參素鈉、鹽酸小檗鹼50μg、含丹酚酸B、橙皮苷100μg、含蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚10μg的溶液,即得。
另,分別取太子參(0.5g)、黃連(0.2g)、半夏(0.5g)、陳皮(0.2g)、茯苓(0.4g)、大黃(0.8g)、丹參(1.0g)、牛膝(0.4g)、紅花(0.2g)、甘草(0.2g)等藥材粉末,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入80%甲醇25ml,密塞,稱定重量,超聲處理(功率250W,頻率40kHz)30分鐘,取出,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續濾液,即得。
3)檢測:將合格樣品溶液和參照物溶液分別注入液相色譜儀,測定,得到色譜圖。
4)經過對多批次合格樣品進行測定,所得色譜圖綜合後,最終得到標準對照指紋圖譜,共有15個標記峰,其中2、6號峰為丹參特徵峰,3、5、9、10、11、12、13、14、15號峰為大黃特徵峰,4號為陳皮特徵峰、8號為黃連特徵峰。