長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體及製備方法
2023-05-27 03:00:31 1
專利名稱：長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體及製備方法
技術領域：
本發明涉及一種長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體及製備方法，屬於藥物技術領域。
背景技術：
長春新鹼為夾竹桃科植物長春花中提取的有效成分。抗腫瘤作用靶點是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影響紡錘體微管的形成，使有絲分裂停止於中期。還可幹擾蛋白質代謝及抑制RNA多聚酶的活力，並抑制細胞膜類脂質的合成和胺基酸在細胞膜上的轉運。長春新鹼對急性白血病、急性淋巴細胞白血病、惡性淋巴瘤、生殖細胞腫瘤、小細胞肺癌、尤文肉瘤、腎母細胞瘤、神經母細胞瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病、消化道癌、黑色素瘤及多發性骨髓瘤等療效顯著。長春新鹼雖然抗腫瘤作用良好，但毒副作用大，主要是神經毒性，因而極大的限制了其臨床應用。長春新鹼脂質體為現在的熱點研究方向，用來降低長春新鹼的神經毒性。脂質體是目前降低藥物毒性常見的製劑手段之一，但是以傳統的卵磷脂、膽固醇製備的常規脂質體在體內多被網狀內皮系統(reticuloendothelial system,RES)吞噬，在血液循環中駐留時間較短。並且其物理化學穩定性差，儲存和應用過程中容易發生融合聚集，包封藥物容易洩漏；官能團少，不易進行多功能化修飾等。近年來，開發新型脂質體的研究受到廣泛關注。
發明內容
鑑於長春新鹼在腫瘤治療上的存在的缺陷，本發明的目的在於提供一種長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體及其製備方法。這種高分子脂質體表面含有聚乙二醇及葉酸， 聚乙二醇可減少脂質體被人體網狀內皮系統捕捉，使其具有體內長循環性能；由於在多種腫瘤細胞(如卵巢癌、結腸直腸癌、肺癌、腎細胞癌等)膜表面葉酸受體高度表達，故製備的表面富含葉酸的高分子脂質體具有腫瘤靶向性能；製備的高分子脂質體緩釋時間長，載藥率高，穩定性好，可提高藥物的利用效率，降低由於藥物突釋造成的毒性；同時由於這種高分子脂質體粒徑小，具有穿過靶組織內皮細胞的能力，可以被腫瘤細胞攝取進入細胞內，將所包含的長春新鹼在細胞內釋放，從而大大提高藥物的利用效率。本發明利用分別經聚乙二醇(PEG)和葉酸(FA)修飾的雙親性殼聚糖衍生物賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(0QLCQ與膽固醇通過反相蒸發法或薄膜分散法製備出一種長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體。如圖2的粒徑分析測試結果所示，其有效粒徑在50 200nm之間。如圖1透射圖片所示，其粒徑均勻，分散性好，很少發生團聚現象。具體技術方案如下本發明的一種長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體，其所使用雙親性高分子為聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(PEG-0QLCQ和葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(FA-OQLCS)，其粒徑在50 200nm之間，粒徑均勻，表面含有聚乙二醇及葉
3酸修飾。本發明的長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體的製備方法，其原料質量份數比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽FA-OQLCS 聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽PEG-0QLCS 長春新鹼=1 1 2 0. 5 1 ;FA-0QLCS與 PEG-0QLCS總量膽固醇=4 2 1 ；採用反相蒸發法時，製備步驟如下a.將長春新鹼溶於蒸餾水中，形成水相，待用；b.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、膽固醇，溶於二氯甲烷中，形成油相，油相與步驟a)中水相體積比為 1 2 3 ；c.將水相在50 200w功率範圍下進行超聲，加入油相，超聲形成水油均勻的分散乳液；d.將步驟c)乳液在30 50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣流加以保護，當有機溶劑完全揮發後，即得到高分子脂質體。本發明可以將反相蒸發法改用薄膜分散法時，製備步驟如下a.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽和膽固醇溶於二氯甲烷中；b.將步驟a)混合物置於反應器中，在30 50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣流加以保護，使反應器中的有機溶劑完全揮發；c.將長春新鹼溶於蒸餾水中，加入步驟b)的反應器中，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器進行超聲分散，即得到高分子脂質體。上述的FA-OQLCS和PEG-0QLCS可以採用任何方法製備的都可以，也可以採用市售的，也可以採用如下方法製備本發明所述的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(0QLCQ按照常津等提供的方法(申請(專利)號200710056993.4)進行製備。將十八烷基二甲基叔胺12g置四口瓶中，加入 60mL溶劑，劇烈攪拌，升溫至55攝氏度，緩慢滴加環氧氯丙烷5. 5g，保溫回流數小時，減壓蒸餾除去未反應的環氧氯丙烷及溶劑，得淺黃色膏狀物二甲基環氧丙基十八烷基氯化銨。 取水溶性賴氨酸殼聚糖(粘均分子量10萬，脫乙醯度80%)3. Og溶於濃度為42% (w/v)的氫氧化鈉溶液IOOmL中，攪拌均勻後，加入異丙醇50mL，緩慢分批加入二甲基環氧丙基十八烷基氯化銨0. lmol，控制溫度在80攝氏度-85攝氏度，攪拌48h。鹽酸調pH= 7，無水丙酮洗滌，真空烘乾得雙親性賴氨酸殼聚糖十八烷基氯化銨。所述的PEG-0QLCS，其製備過程中，各組分的含量為OQLCS 0. 3 0. 5g ；單羧基化聚乙二醇QOOODa) 0. 2 l.Og ；乙基_ (3-二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC) 1 3g ；N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)O. 6 2. Ogo其製備過程如下稱取OQLCS 0. 3 0. 5g溶於IOmL 蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 2 1. Og溶於IOmL蒸餾水中，稱取EDC 1 3g 加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨後稱取NHS 0. 6 2. Og加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，10 40min後將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應12 Mh，反應結束後，用 8000-14000的透析袋透析1-7天，凍幹即得PEG-0QLCS。
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所述的FA-0QLCS，其製備過程中，各組分的含量為=OQLCS 0. 3 0. 5g ；葉酸 0. 2 1. Og ；三乙胺1 5mL ；乙基_ (3- 二甲基丙基)碳化二亞胺鹽酸(EDC) 1 3g ；N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS)O. 6 2. Og ；二甲基亞碸(DMSO) 110 200mL。其製備過程如下將葉酸溶於60 IOOmLDMSO中，向其加入1 5mL三乙胺，將1 3g EDC與0. 6 2. Og NHS 用少量的DMSO使其溶解後加入到上述反應體系中避光反應12 Mh以上。將產物過濾， 得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶於50 80mLDMS0中，加入0. 3 0. 5g OQLCS0用Na2HPO4與NaOH緩衝溶液調節反應體系的pH = 10，反應1 1.證。反應結束後，用8000-14000的透析袋透析1-7天，凍幹即得FA-0QLCS。本發明的有益效果整個製備過程簡單快捷，製備周期短，產率高。所製備的長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體的性能包括有效粒徑大小在50 200nm之間，粒徑均勻；載藥能力強，製備的高分子脂質體載藥率高達8-10% ；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月；緩釋性能明顯，緩釋時間可調。本發明所提供的脂質體(反相蒸發法)主要質量指標如下表
具體指標高分子脂質體傳統脂質體
有效粒徑50nm 200nm約500nm
載藥率高達8-10%<8% 緩釋時間高達15天<15天
功能化長循環、腫瘤靶向無
穩定性可在水溶液中保存2個月易發生融合聚集
圖1 實施例4中製備的長春新鹼納米靶向緩釋脂質體透射照片；圖2 實施例9中製備的長春新鹼納米靶向緩釋脂質體粒度分析圖。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。實施例1PEG-0QLCS製備過程。稱取OQLCS 0. 3g溶於IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 2g溶於IOmL蒸餾水中，稱取EDC Ig加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨後稱取NHS 0. 6g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，IOmin後將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應12h，反應結束後，用8000-14000的透析袋透析1天，凍幹即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS製備過程。將葉酸溶於60mLDMS0中，向其加入ImL三乙胺，將Ig EDC與
50.6g NHS用少量的DMSO使其溶解後加入到上述反應體系中避光反應12h。將產物過濾， 得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶於50mLDMS0中，加入0. 3g OQLCS0用 Na2HPO4與NaOH緩衝溶液調節反應體系的pH= 10，反應Ih。反應結束後，用8000-14000的透析袋透析1天，凍幹即得FA-OQLCS。實施例2PEG-0QLCS製備過程。稱取OQLCS 0. 4g溶於IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇0. 6g溶於IOmL蒸餾水中，稱取EDC 2g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨後稱取NHS 1. 3g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，25min後將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應18h，反應結束後，用8000-14000的透析袋透析4天，凍幹即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS製備過程。將葉酸溶於80mLDMS0中，向其加入3mL三乙胺，將2g EDC與
1.3g NHS用少量的DMSO使其溶解後加入到上述反應體系中避光反應18h以上。將產物過濾，得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶於65mLDMS0中，加入0. 4gOQLCS。用 Na2HPO4與NaOH緩衝溶液調節反應體系的pH = 10，反應1. 25h。反應結束後，用8000-14000 的透析袋透析4天，凍幹即得FA-0QLCS。實施例3PEG-0QLCS製備過程。稱取OQLCS 0. 5g溶於IOmL蒸餾水中，待用；稱取單羧基化聚乙二醇l.Og溶於IOmL蒸餾水中，稱取EDC 3g加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，隨後稱取NHS 2. Og加入到單羧基化聚乙二醇水溶液中，40min後將上述溶液加入到OQLCS水溶液中，反應Mh，反應結束後，用8000-14000的透析袋透析7天，凍幹即得PEG-0QLCS。FA-OQLCS製備過程。將葉酸溶於IOOmLDMSO中，向其加入5mL三乙胺，將3g EDC與
2.Og NHS用少量的DMSO使其溶解後加入到上述反應體系中避光反應Mh以上。將產物過濾，得到黃色固體NHS-FA活性脂。取NHS-FA活性脂溶於80mLDMS0中，加入0. 5g0QLCS。用 Na2HPO4與NaOH緩衝溶液調節反應體系的pH = 10，反應1.證。反應結束後，用8000-14000 的透析袋透析7天，凍幹即得FA-0QLCS。實施例4反相蒸發法。稱取2. 5mg長春新鹼，溶於4. 5mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 5mgPEG-0QLCS，5mgFA-0QLCS、2. 5mg膽固醇，溶於2mL二氯甲烷中形成油相，將油相在50W功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在30°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應器中的有機溶劑完全揮發後，即得到產品。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為97. 8nm, 分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為8. 7% ；體外緩釋時間達到12天；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例5反相蒸發法。稱取7mg長春新鹼，溶於15mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 15mgPEG-0QLCS, 1 OmgFA-OQLCS, IOmg膽固醇，溶於5mL 二氯甲烷中形成油相，將油相在100W 功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在35°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應器中的有機溶劑完全揮發後，即得到產品。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為117. 7·，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 1% ；體外緩釋時間達到15天；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例6反相蒸發法。稱取IOmg長春新鹼，溶於20mL的蒸餾水中，形成水相；稱取 20mgPEG-0QLCS, 1 OmgFA-OQLCS、15mg膽固醇，溶於IOmL 二氯甲烷中形成油相，將油相在 200W功率下進行超聲，加入水相，超聲形成水油均勻的分散體系。將上述乳液在50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。當反應器中的有機溶劑完全揮發後，即得到產品。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為100. 3·，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為 9. 4% ；體外緩釋時間達到17天；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例7薄膜分散法。稱取1 OmgPEG-OQLCS，IOmg FA-OQLCS, 5mg膽固醇，溶於5mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新鹼溶於5mL水中，待用。將該混合物置於茄形瓶中，在30°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發。之後將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新鹼水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以50W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為93. 3nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為8. 3% ；體外緩釋時間達到10 天；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例8薄膜分散法。稱取langPEG-OQLCS，8mg FA-OQLCS, 7mg膽固醇，溶於6mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新鹼溶於4mL水中，待用。將該混合物置於茄形瓶中，在40°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發。之後將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新鹼水溶液，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器以200W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為97. 8nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 3% ；體外緩釋時間達到12天； 穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。實施例9薄膜分散法。稱取1 OmgPEG-OQLCS，5mg FA-OQLCS, 7. 5mg 膽固醇，溶於 3mL 二氯甲烷中。稱取5mg長春新鹼溶於6mL水中，待用。將該混合物置於茄形瓶中，在50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入適當流速的氮氣流加以保護。使茄形瓶中的有機溶劑完全揮發。之後將茄形瓶取下，向茄形瓶中加入長春新鹼水溶液，將脂質膜水化， 然後用超聲波清洗器以100W的功率進行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到高分子脂質體溶液。製備的長春新鹼靶向緩釋長循環脂質體有效粒徑為105. 7nm，分散性好；表面含有聚乙二醇和葉酸，具有長循環性及腫瘤靶向性；載藥率為9. 7% ；體外緩釋時間達到16 天；穩定性好，可在水溶液中保存至少2個月。
權利要求
1.長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體，其特徵其粒徑在50 200nm之間，表面含有聚乙二醇及葉酸修飾。
2.權利要求1的長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體的製備方法，其原料質量份數比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽FA-OQLCS 聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽PEG-0QLCS 長春新鹼=1 1 2 0. 5 1 ；FA-0QLCS與 PEG-0QLCS總量膽固醇=4 2 1 ；採用反相蒸發法時，製備步驟如下a.將長春新鹼溶於蒸餾水中，形成水相，待用；b.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、膽固醇，溶於二氯甲烷中，形成油相，油相與步驟a)中水相體積比為1 2 3;c.將水相在50 200w功率範圍下進行超聲，加入油相，超聲形成水油均勻的分散乳液；d.將步驟c)乳液在30 50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣流加以保護，當有機溶劑完全揮發後，即得到高分子脂質體。
3.如權利要求2的所述的製備方法，其特徵是所述的反相蒸發法改用薄膜分散法時， 製備步驟如下a.將聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽、葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽和膽固醇溶於二氯甲烷中；b.將步驟a)混合物置於反應器中，在30 50°C下於旋轉蒸發儀上進行旋蒸，同時向旋轉蒸發儀中通入氮氣流加以保護，使反應器中的有機溶劑完全揮發；c.將長春新鹼溶於蒸餾水中，加入步驟b)的反應器中，將脂質膜水化，然後用超聲波清洗器進行超聲分散，即得到高分子脂質體。
全文摘要
本發明涉及一種長春新鹼納米靶向緩釋長循環脂質體及製備方法。脂質體粒徑在50～200nm之間，其粒徑均勻，表面富含聚乙二醇和葉酸。原料質量份數比配比為葉酸修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(FA-OQLCS)∶聚乙二醇修飾的賴氨酸殼聚糖十八烷基季銨鹽(PEG-OQLCS)∶長春新鹼＝1∶1～2∶0.5～1；FA-OQLCS與PEG-OQLCS總量∶膽固醇＝4～2∶1；採用反相蒸發法或薄膜分散法製備；整個製備過程簡單快捷，製備周期短，製備的高分子脂質體載藥率可高達9.7％；通過表面聚乙二醇修飾，可使高分子脂質體不易被人體網狀內皮系統捕捉，延長在體內的循環時間，通過葉酸修飾，可使高分子脂質體具有腫瘤靶向性。
文檔編號A61K31/475GK102225053SQ201110161829
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月16日 優先權日2011年6月16日
發明者常津, 康世胤, 王漢傑, 王生, 蘇文雅 申請人:天津大學