同型半胱氨酸幹化學法檢測試劑條及其製備方法
2023-05-27 02:06:51 3
專利名稱：同型半胱氨酸幹化學法檢測試劑條及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測同型半胱氨酸試劑條及其製造方法，屬於醫學檢驗領域。
技術背景同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)是人體內蛋氨酸代謝的中間產物，同時參與了體內轉硫 化作用途徑。同型半胱氨酸通過B12在5-甲基四氫葉酸存在下經葉酸循環重新甲基化為蛋氨 酸，隨後產生的5,10-二甲基四氫葉酸被甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)還原成5-甲基四氫葉 酸。同型半胱氨酸也能被甘氨酸三甲內鹽重甲基化為蛋氨酸。重甲基化在肝臟及腎臟中完成， 蛋氨酸循環中，食物中蛋氨酸轉化為S-腺苷甲硫氨酸(SAM)， SAM以作為甲基轉移酶甲基組 供體的底物，在甲基轉移酶作用下產生唯一產物S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)， SAH經SAH水 解酶水解為同型半胱氨酸及腺苷。如因各種原因引起血同型半胱氨酸濃度升高，可發生同型半胱氨酸尿症或高同型半胱氨 酸血症，並對動脈血管造成傷害。研究認為同型半胱氦酸是一新的血管系統疾病的獨立危險 因子，與心血管疾病、腦梗塞、外周血管性疾病有關，也與葉酸或維生素B12、 B6的缺乏相 關。六十年代末，McCully從病理上發現高胱氨酸尿症和胱硫醚尿症患者早期即可發生全身 動脈粥樣硬化和血栓形成，七十年代初他又通過動物模型證實同型半胱氨酸血中蓄積可導致 類似血管損害，八十年代人們提出高同型半胱氨酸血症是動脈粥樣硬化和冠心病的一個獨立 危險因素，尤其是冠狀動脈粥樣硬化和心肌梗塞的危險指標，它的濃度升高程度與疾病的危 險性成正比，被譽為"心臟新殺手"。目前不少研究表明高同型半胱氨酸是腦血管疾病危險因 素指標，是缺血性腦血管病、腦梗死的獨立危險因子，高同型半胱氨酸和腦卒中疾病發生密 切相關。同型半胱氨酸檢測目前主要採用的技術方法有高效液相(HPLC)方法、螢光偏振免 疫檢測(FPLA)方法、酶聯免疫技術(ELISA)和化學發光法等。高效液相(HPLC)方法 操作比較複雜，試驗耗時比較長，且試驗數據變異比較大。螢光偏振免疫檢測(FPLA)方法 檢測費時，須配備專用全自動螢光分析儀器，設備昂貴，不宜普及。酶聯免疫技術(ELISA) 大部分操作為手工操作，比較耗時，定量檢測需配備儀器，必須有專門的實驗室。化學發光 法，檢測時間在2h以上，且價格昂貴。以上方法均不適於在基層檢驗場所應用。免疫膠體金 層析技術操作簡單、快速、靈敏和特異性好，用於同型半胱氨酸的快速檢測，有益於同型半 胱氨酸基層醫療機構檢測的普及，此項技術雖然是一種較為成熟的技術，但對不同的抗原抗 體系統的應用有差異，包括原料來源，試劑配製，生產工藝等都不同，需進行新的設計和試驗。目前國內外均未査到有用於檢測同型半胱氨酸的幹化學試劑條，包括文獻報導和發明專 利。發明內容為克服現有同型半胱氨酸檢測技術的不足，本發明提供一種快速檢測同型半胱氨酸的試 劑條。本發明根據幹化學技術特點和同型半胱氨酸裂解酶系統特點，設計新的原材料，試劑 和工藝流程，應用本發明提供的試劑條檢測同型半胱氨酸水平，具有簡單，快速，靈敏和特 異性好等特點，IO分鐘以內出結果，並且價格低，適用於基層檢測和臨床初篩。本發明所述幹化學試劑條是由長條形的上下支持層及中間各測試層組成， 一端為手持 區，另一端測試區，其結構如圖l、圖2、圖3所示。它由上下支持層及中間各測試層組成， 測試區從上至下依次為擴散層、過濾層、酶試劑層、顯色劑層。其中，上支持層1和下支持 層2通過自帶的膠層粘合在一起；在測試區上支持層1開有加樣孔3，下支持層2的對應位 置開有測試孔8;擴散層4、過濾層5和酶試劑層6、顯色劑層7迭合，設置於加樣孔3合測 試孔8處的上支持層1和下支持層2之間。上述結構的幹化學試劑條，主要用於樣品為全血、血漿、血清或尿樣的測定。如果是血 漿、血清或尿樣樣品，則可省略過濾層5。本發明中，上支持層和下支持層可採用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙 烯或聚酯纖維等，其中以聚酯材料為最好。單片支持層厚度為50—200um。上下支持層規格 相同為40X6mm—60X12mm。上下支持層上的加樣孔和測試孔可為圓形孔，直徑相同，大小 為4一10mm。加樣孔3用於滴加樣品，測試孔8用於觀察測試區顏色的變化和測定光密度的 變化。本發明中，通過加樣孔3可將樣品直接加到擴散層4中。擴散層4的作用是將測試的樣 品均一的滲透到下一層中去。適合做擴散層的材料包括尼龍膜、無紡布、玻璃纖維、各種濾 紙或合成纖維等。優選合成纖維材料。其中最適合的材料為聚酯纖維或尼龍纖維材料。擴散 層4做成網布形式，網布的孔徑大小為40—400um，纖維直徑為40—400 y m。擴散層的材 料一般為親水性質的，這樣有利於樣品的擴散，也可使用表面活性劑進行預處理。本發明中，過濾層5的作用是過濾紅細胞並避免溶血，其材料可以是各種過濾性的膜、 高分子材料等，例如各種玻璃纖維材料和專用濾血膜，優選非對稱合成膜，膜的孔徑為0. 15 —10um。本發明中，酶試劑層6和顯色劑層稱為反應層。加樣後，樣品中的同型半胱氨酸滲透到 試劑層發生反應而逐漸顯色。適合做試劑層的材料有各種濾紙、纖維織物、無紡布、玻璃纖 維或非對稱合成膜。膜類以非對稱的膜系列為好。酶分解底物釋放的色原標記物直接滲透到膜的測試孔8 —側，在測試孔8 —側進行測定。本發明中，酶試劑層6中的試劑包括緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原劑、 保護劑、穩定劑；其中，緩衝體系為Tris-HCl緩衝液，濃度為50—100mM;裂解酶為同型半 胱氨酸裂解酶和/或蛋氨酸裂解酶，濃度為0. 1-0.5U/ml;輔助酶為磷酸吡多醛，濃度為10— 50yM;表面活性劑是曲拉通和/或吐溫-20，濃度為0.02 — 0.08%;還原劑為氨丁三醇(2—羧 基乙基)磷化氫，濃度為0.5 — 2mM;保護劑為海藻糖，濃度為0.5—2.0%;穩定劑為多糖類 或雙糖類，濃度為0.5 — 2.0%。本發明中，顯色劑層7中試劑包括底物、激活劑；其中，底物為N,N-二甲基-p-亞苯基 二胺鹽，濃度為5 — 30mM;激活劑為氯化鐵和/或鐵氰化鉀，濃度為10 — 50mM。 本發明所述試劑條的製備方法，包括如下步驟1) 製備吸附有酶試劑的載體膜6:將緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原劑、保護劑、穩定劑製備成反應液，將上述溶液浸潤載體膜，再將載體膜在乾燥箱烤乾；2) 製備吸附有顯色劑的載體膜7:將底物、激活劑製備成顯色液，將上述溶液浸潤 載體膜，再將載體膜在乾燥箱烤乾；3) 將上述製備好的載體膜完全乾燥後，按照反應順序，先將顯色劑層7粘附在下支 ,持層2上，再在顯色劑層7上粘附酶試劑層6，再再酶試劑層6上粘附過濾層5，再在過濾層5上粘附擴散層4，最後在擴散層4粘附上支持層1，裁成細條，即成一種檢測同型半胱氨酸的幹化學試劑條。 為定量測定同型半胱氨酸的含量，發明人還研製了反射式分光光度計(另案申請專利)， 與本發明幹化學試劑條配套使用。在該光度計測定試劑條反應後在660nm波長下反射光密度 的變化。該儀器可以將反應溫度控制在37土0.5'C。計算方法採用速率法，測定在150秒內 完成，自動報告和儲存實驗檢測結果，並列印。本發明的有益效果應用本發明提供的試紙條檢測人體內同型半胱氨酸水平，成本低廉， 操作簡單、快速、靈敏，且特異性好，與一臺小型反射式分光光度計配套使用，因此可廣泛 應用於各級醫療檢驗場所，尤其是基層醫療機構，包括鄉鎮衛生院等均可開展。本發明有益 於高同型半胱氨酸血症的篩查的普及，進而對於心腦血管事件發生的預防有極為重要的意義。
圖1為本發明的幹化學試劑條外觀示意圖 3.加樣孔圖2為本發明的幹化學試劑條剖面示意圖1.上支持層；2.下支持層；3.加樣孔；4.擴散層；6.酶試劑層；7.顯色劑層；8.測試孔圖3為本發明的幹化學試紙條剖面示意圖1.上支持層；2.下支持層；3.加樣孔；4.擴散層；5.過濾層；6.酶試劑層；7.顯色 劑層；8.測試孔具體實施方式
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，凡依照本發明公開內容所作出的本 領域等同替換，均屬於本發明的保護範圍。實施例l:同型半胱氨酸幹化學試紙條的製備方法，它包括如下步驟 具體的試紙條的組成見附圖1、 2、 3。1) 製備吸附有酶試劑的載體膜6:將緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原劑、保護劑、穩定劑製備成反應 液，將上述溶液浸潤載體膜，再將載體膜在乾燥箱烤乾；2) 製備吸附有顯色劑的載體膜7:將底物、激活劑製備成顯色液，將上述溶液浸潤載體膜，再將載體膜在乾燥箱烤乾；3) 將上述製備好的載體膜完全乾燥後，按照反應順序，先將顯色劑層7粘附在下支持層2 上，再在顯色劑層7上粘附酶試劑層6，在酶試劑層6上粘附過濾層5，再在過濾層5上 粘附擴散層4，最後在擴散層4粘附上支持層1，裁成細條，即成一種檢測同型半胱氨酸 的幹化學試劑條。其中，上支持層和下支持層可採用高分子聚合材料，如聚乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯或 聚酯纖維等，其中以聚酯材料為最好。單片支持層厚度為50—200ym。上下支持層規格相同 為40X6腿一60X12mm。上下支持層上的加樣孔和測試孔可為圓形孔，直徑相同，大小為4 一10mm。加樣孔3用於滴加樣品，測試孔8用於觀察測試區顏色的變化和測定光密度的變化。通過加樣孔3可將樣品直接加到擴散層4中。擴散層4的作用是將測試的樣品均一的滲 透到下一層中去。適合做擴散層的材料包括尼龍膜、無紡布、玻璃纖維、各種濾紙或合成纖 維等。優選合成纖維材料。其中最適合的材料為聚酯纖維或尼龍纖維材料。擴散層4做成網 布形式，網布的孔徑大小為40—400um，纖維直徑為40—400um。擴散層的材料一般為親 水性質的，這樣有利於樣品的擴散，也可使用表面活性劑進行預處理。7過濾層5的作用是過濾紅細胞並避免溶血，其材料可以是各種過濾性的膜、高分子材料 等，例如各種玻璃纖維材料和專用濾血膜，優選非對稱合成膜，膜的孔徑為O. 15 — 10um。酶試劑層6和顯色劑層稱為反應層。加樣後，樣品中的同型半胱氨酸滲透到試劑層發生 反應而逐漸顯色。適合做試劑層的材料有各種濾紙、纖維織物、無紡布、玻璃纖維或非對稱 合成膜。膜類以非對稱的膜系列為好。酶分解底物釋放的色原標記物直接滲透到膜的測試孔 8—側，在測試孔8—側進行測定。酶試劑層6中的試劑包括緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原劑、保護劑、 穩定劑；其中，緩衝體系為Tris-HCl緩衝液，濃度為50—100mM;裂解酶為同型半胱氨酸裂 解酶和/或蛋氨酸裂解酶，濃度為0. l-0.5U/ml;輔助酶為磷酸吡多醛，濃度為10 — 50yM; 表面活性劑是曲拉通和/或吐溫-20，濃度為0.02_0.08%;還原劑為氨丁三醇(2—羧基乙基) 磷化氫，濃度為0. 5 — 2mM;保護劑為海藻糖，濃度為0. 5 — 2.0%;穩定劑為多糖類或雙糖 類，濃度為0.5—2.0%。顯色劑層7中試劑包括底物、激活劑；其中，底物為N,N-二甲基-p-亞苯基二胺鹽，濃 度為5 — 30mM;激活劑為氯化鐵和/或鐵氰化鉀，濃度為10 — 50mM。實施例2:同型半胱氨酸幹化學試紙條的使用方法1. 將試劑條按照需要數量取出，待用；2. 採30微升被檢測者的末梢血/血漿/血清，直接滴加在加樣孔中3;3. 反應5-10分鐘後，觀察下端透明膜後的顏色；4. 結果判斷出現明顯的藍色即為陽性(超過15UM/L);無色或淺藍色即為陰性(低於15uM/L);5. 或使用反射式分光光度計進行測定。反射式分光光度計以預設的程序進行計算，列印結 果。
權利要求
1、一種檢測同型半胱氨酸的幹化學試劑條，一端為手持區，另一端為測試區，其特徵在於由上支持層(1)、下支持層(2)、擴散層(4)、過濾層(5)和酶試劑層(6)、顯色劑層(7)組成，其中，上支持層(1)和下支持層(2)通過自帶的膠層粘合在一起；在測試區上支持層(1)開有加樣孔(3)，下支持層(2)的對應位置開有測試孔(8)；擴散層(4)、過濾層(5)和酶試劑層(6)、顯色劑層(7)迭合，設置於加樣孔(3)和測試孔(8)處的上支持層(1)和下支持層(2)之間；酶試劑層(6)中的試劑包括緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原劑、保護劑、穩定劑；其中，緩衝體系為Tris-HCl緩衝液，濃度為50-100mM；輔助酶為磷酸吡多醛，濃度為10-50μM；表面活性劑是曲拉通和/或吐溫-20，濃度為0.02-0.08％；保護劑為海藻糖，濃度為0.5-2.0％；穩定劑為多糖類或雙糖類，濃度為0.5-2.0％；顯色劑層(7)中試劑包括底物、激活劑。
2、 根據權利要求1所述的幹化學試劑條，其特徵在於所述擴散層(4)和酶試劑層(6)之 間設有過濾層(5)。
3、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述的上、下支持層材料為聚乙烯、聚 氯乙烯、聚苯乙烯或聚酯纖維，厚度為50—200um，兩支持層規格相同，長40--60mm， 寬6-12mm;所述加樣孔(3)和測試孔(8)為圓孔，直徑相同為4一10mm。
4、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述擴散層(4)材料為尼龍膜、無紡 布、玻璃纖維、濾紙或合成纖維材料。
5、 根據權利要求4所述的試劑條，其特徵在於所述擴散層(4)採用合成纖維網布形式， 網布的孔徑為40—400 u m，纖維直徑為40—400 u m。
6、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述酶試劑層(6)和顯色劑層(7)材 料為濾紙、纖維織物、無紡布、玻璃纖維或非對稱合成膜。
7、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述過濾層(5)材料為玻璃纖維或濾 過膜，孔徑為0. 15 — 10um。
8、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述裂解酶為同型半胱氨酸裂解酶和/ 或蛋氨酸裂解酶，濃度為O. l-0.5U/ml;優選為蛋氨酸裂解酶。
9、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述還原劑為氨丁三醇磷化氫，濃度為 0. 5 — 2mM。
10、 根據權利要求1或2所述的試劑條，其特徵在於所述底物釆用N， N-二甲基-p-亞苯 基二胺鹽，濃度為5 —30mM;激活劑為氯化鐵和/或鐵氰化鉀，濃度為10—50mM。
11、 一種檢測同型半胱氨酸的幹化學試劑條的製備方法，包括如下步驟1)製備吸附有酶試劑的載體膜(6):將緩衝體系、裂解酶、輔助酶、表面活性劑、還原齊U、保護劑、穩定劑製備成反應液，將上述溶液浸潤載體膜，再將載體膜在乾燥箱烤 幹；2) 製備吸附有顯色劑的載體膜(7):將底物、激活劑製備成顯色液，將上述溶液浸潤載 體膜，再將載體膜在乾燥箱烤乾；3) 將2)製備好的載體膜完全乾燥後，按照反應順序，先將顯色劑層(7)粘附在下支 持層(2)上，再在顯色劑層(7)上粘附酶試劑層(6)，在酶試劑層(6)上粘附過 濾層(5)，再在過濾層(5)上粘附擴散層(4)，最後在擴散層(4)粘附上支持層(1)。
全文摘要
本發明提供一種同型半胱氨酸幹化學檢測試劑條及其製備方法。目的是提供了一種能快速半定量/定量檢測同型半胱氨酸的試劑條及其製造方法。該試劑條是由長條形的上下支持層及中間各測試層組成，分為手持區和測試區。測試區從上至下依次為擴散層、過濾層、酶試劑層、顯色劑層。擴散層可選用各種合成纖維材料的網格材料，過濾層可選用各種濾血的濾過性材料，酶試劑層和顯色劑層可選用各種非對稱性的合成膜。上支持層上開一加樣孔，樣品從加樣孔進入擴散層後滲透進過濾層、酶試劑層和顯色劑層，在酶試劑層和顯色劑層發生化學反應而發生顏色的改變，通過下支持層的測試孔即可測定反應過程的光密度的變化。
文檔編號G01N21/77GK101592656SQ20081011392
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月29日 優先權日2008年5月29日
發明者多 於, 徐希平, 燕 王, 謝愛武 申請人:北京華安佛醫藥研究中心有限公司;深圳奧薩醫藥有限公司