一種纖維蛋白溶解酶生產菌及生產纖維蛋白溶解酶的方法
2023-05-27 06:28:36 2
專利名稱：一種纖維蛋白溶解酶生產菌及生產纖維蛋白溶解酶的方法
技術領域：
一種纖維蛋白溶解酶生產菌及生產纖維蛋白溶解酶的方法，本發明涉及一種生產纖維蛋白溶解酶菌株——芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006，保藏編號為CCTCC NOM 205071，屬於食品生物技術領域。
背景技術：
心腦血管疾病一直號稱威脅人類健康的頭號殺手，據有關調查報告顯示，每24秒就有一個中國人死於心腦血管疾病，每13秒就有一位中國人因此而致殘。我國每年死於心腦血管疾病的人有300多萬，佔我國每年總死亡人數的50％，而患病倖存下來的人中，75％不同程度喪失勞動能力，4％重殘。血栓栓塞性疾病是其中致死和致殘第一位的原因，沒有血栓就沒有心腦血管事件。
人體的血管和血液循環作為一個整體，各個系統、器官和組織生理機能的維持需要血液充分而不間斷的供應。動脈負責將血液運輸到器官和組織；在毛細血管內，血液中的營養物質和氧氣供應給組織，組織中的代謝產物也可通過毛細血管運走；然後這些血液通過靜脈系統運輸回到心臟，心臟再將回流的血液泵向動脈系統，完成一次血液循環。
血栓是流動的血液在血管(動脈或靜脈)腔內或心腔內發生凝固，形成血凝塊，堵塞血管腔，導致血管內血流明顯減少，甚至完全中斷的一種疾病。血栓發生在動脈，導致供血的器官或組織嚴重缺血或血流中斷，如腦供血不足、不穩定性心絞痛，甚至壞死，如急性心肌梗死、腦卒中。血栓發生在靜脈，如下肢深靜脈血栓形成，可引起下肢血液回流障礙，引起水腫和靜脈功能不全等。栓塞是心臟或血管內已形成的血栓脫落，順血流堵塞其他重要臟器血管的症候群。如心房纖顫常有左心房內血栓形成，血栓一旦脫落，則可順血流堵在腦血管，引起腦組織壞死(腦栓塞)或外周血管(如下肢動脈、腎動脈)栓塞；下肢深靜脈血栓形成可脫落堵塞肺動脈(肺栓塞)，引起急性右心衰竭，嚴重者導致病人死亡。
血栓栓塞性疾病主要包括動脈粥樣血栓形成(心肌梗死和腦梗死)和靜脈血栓栓塞(肺栓塞和深靜脈血栓形成)，血栓栓塞的危害為血栓栓塞導致器官衰竭或功能障礙、致殘、喪失工作能力，甚至死亡。血栓栓塞性疾病臨床非常常見，嚴重危害大眾生命和健康。如房顫病人每年發生腦部血栓栓塞的危險約為5％左右，房顫導致的血栓佔腦梗塞的10％-15％，房顫後腦卒中具有更高的致死率和致殘率。血栓栓塞性疾病給人類帶來的危害已經得到全世界的關注。
臨床上對血栓栓塞性疾病較常用的治療方法主要有三種第一，外科手術，這是去除血栓最迅速直接的方法，開始於20世紀30年代的法國，50年代流行於美國，這種方法條件複雜，費用昂貴，目前已經較少使用。第二，保守療法，即給患者長期服用阿司匹林、肝素和水蛭素等藥物。第三，溶栓療法，即服用或注射溶栓劑使血管開通，血栓栓塞性疾病的溶栓、抗栓療法為新鮮血栓中的纖維蛋白成分可以被溶栓藥物溶解，使堵塞的血管再通，恢復器官和組織供血，改善器官功能。這是目前使用的主要方法，致死的危險性比保守療法降低了10％-50％。
隨著溶栓劑的推廣使用，血栓栓塞性病人的死亡率明顯下降。溶栓劑的研究開發相當活躍，但是，在臨床上使用的溶栓藥均在不同程度上存在一定的缺陷；或毒性較強、副作用大；或在體內半衰期短，藥效難以發揮；或來源緊缺、價格昂貴。
所以，研究人員除了致力於溶栓劑開發的同時，也在尋找天然的較具優勢和發展前途的溶栓物質，微生物是溶栓藥物的重要來源，如細菌、真菌、放線菌和藻類。董明盛等人通過平板稀釋分離從豆豉中分離到產纖溶酶高活力菌株，菌種鑑定為枯草芽孢桿菌。韓潤林等人從一種海洋細菌中分離到了一株枯草桿菌(HL-986)，王駿等從鏈黴菌(Streptomyces sp)Y405發酵液中分離純化得到一種纖溶蛋白酶SW1。
篩選產酶性能優良的菌種，摸索出成熟的工藝條件，對以後大規模生產至關重要。本發明自行設計篩選纖溶酶產生菌的篩選模型，以發酵食品蝦醬為菌源，以纖維蛋白為主要基質的平板為篩子，採用液體培養基富集培養、以纖維蛋白平板初篩和搖瓶復篩的篩選方法，同時進行纖溶活性測定，得到發酵液的酶活為588.4u/ml以上(以尿激酶為標準)發明內容本發明目的是提供一種生產纖維蛋白溶解酶的菌株。
本發明所述生產纖維蛋白溶解酶的菌株芽孢桿菌，最初來源於發酵食品蝦醬，樣品經液體培養基富集培養後，採用纖維蛋白平板法進行初篩，根據溶圈的直徑與菌落直徑比值初步定性半定量地確定纖溶活性的高低，篩選到產生纖維蛋白溶解能力相對較高的菌株。然後進行搖瓶復篩，對發酵液的纖維蛋白溶解活性進行定量分析，最終得到生產纖維蛋白溶解酶的菌株，並進行菌株的分離與鑑定。
酶活定義以同具有溶栓能力的尿激酶為標準，pH 7.5，37℃條件下.1分鐘內使1ml豬血纖維蛋白酶原在275nm的吸光度增加1的酶量定義為一個尿激酶酶活單位。
本發明的纖維蛋白溶解酶菌株，其分類命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM205071。
用該菌株生產纖維蛋白溶解酶的方法為種子培養種子培養基以g/100ml計為蛋白腖1，葡萄糖1，酵母膏0.5，Na2HPO4·12H2O 1.2，MgSO4·7H2O0.03，調pH 7.2，121℃滅菌20min，培養條件為搖床轉速180rpm，培養溫度37℃，培養時間16～18小時。
液體發酵培養液體發酵培養基以g/100ml計為蛋白腖1～2.5，葡萄糖1～2.5，Na2HPO4·12H2O 1～2.5，NaH2PO4·2H2O 0.13，MgSO4·7H2O 0.1，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03，121℃滅菌20min，調pH 7.2；種子培養基按體積百分5％接入25升發酵罐(裝液量15升)液體發酵培養基中，培養條件為攪拌速度180rpm，控制通風量0～12h為9L/min，12～24h為10.5L/min，24～36h為12L/min；培養溫度35～40℃；培養時間35～40小時。
本發明的有益效果芽孢桿菌CCTCC NOM 205071(Bacillus sp.nov.SK006)最初來源於發酵食品蝦醬，是無人體寄生性的高度安全的菌類，通過細菌進行液體發酵生產成本低，可行性強，可用於大規模生產，直接製成膠囊、衝劑、口服液或口服含片，或作為功能性食品配料用於保健食品或普通食品中。本發明改進了以往的纖溶酶產生菌的篩選方法，採用液體培養基富集培養、以纖維蛋白為主要基質的平板初篩和搖瓶復篩的篩選方法，同時進行纖溶活性測定，得到發酵液的酶活為588.4u/ml以上(以尿激酶為標準)。
生物材料樣品保藏一種生產纖維蛋白溶解酶的菌株，其分類命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM205071，保藏日期為2005年3月22日。
具體實施例方式
實施例1將芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006在下述條件下進行發酵，種子培養種子培養基(以質量體積百分計)蛋白腖1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，Na2HPO4·12H2O 1.2％，MgSO4·7H2O 0.03％，調pH 7.2，121℃滅菌20min，180rpm，37℃培養16～18h。
液體發酵培養液體發酵培養基(以質量體積百分計)蛋白腖1.5％，葡萄糖1.5％，Na2HPO4·12H2O 1.5％，NaH2PO4·2H2O 0.13％，MgSO4·7H2O0.1％，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03％，121℃滅菌20min，調pH7.2；種子培養基按體積百分5％接入25升發酵罐(裝液量15升)液體發酵培養基中，培養條件為攪拌速度180rpm，控制通風量0～12h為9L/min，12～24h為10.5L/min，24～36h為12L/min；培養溫度37℃；培養時間36小時，得到發酵液的酶活為610.6u/ml。(以尿激酶為標準)。
實施例2將芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006在下述條件下進行發酵，種子培養種子培養基(以質量體積百分計)蛋白腖1％，葡萄糖1％，酵母膏0.5％，Na2HPO4·12H2O 1.2％，MgSO4·7H2O 0.03％，調pH7.2，121℃滅菌20min，180rpm，37℃培養16～18h。
液體發酵培養液體發酵培養基(以質量體積百分計)蛋白腖2.5％，葡萄糖2.5％，Na2HPO4·12H2O 2.5％，NaH2PO4·2H2O 0.13％，MgSO4·7H2O0.1％，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03％，121℃滅菌20min，調pH7.2，種子培養基按體積百分5％接入25升發酵罐(裝液量15升)液體發酵培養基中，培養條件為攪拌速度180rpm，控制通風量0～12h為9L/min，12～24h為10.5L/min，24～40h為12L/min；培養溫度40℃；培養時間40小時，得到發酵液的酶活為588.4u/ml。(以尿激酶為標準)。
權利要求
1.一種生產纖維蛋白溶解酶的菌株，其分類命名為芽孢桿菌(Bacillus sp.nov.)SK006，已保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCC NOM205071。
2.一種用權利要求1所述菌株生產纖維蛋白溶解酶的方法，其特徵是菌株CCTCC NOM 205071；種子培養種子培養基以g/100ml計為蛋白腖1，葡萄糖1，酵母膏0.5，Na2HPO4·12H2O 1.2，MgSO4·7H2O 0.03，調pH7.2，121℃滅菌20min，培養條件為搖床轉速180rpm，培養溫度37℃，培養時間16～18小時；液體發酵培養液體發酵培養基以g/100ml計為蛋白腖1～2.5，葡萄糖1～2.5，Na2HPO4·12H2O 1～2.5，NaH2PO4·2H2O 0.13，MgSO4·7H2O 0.1，消泡劑聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.03，121℃滅菌20min，調pH7.2；種子培養基按體積百分5％接入裝液量為15升液體發酵培養基的25升發酵罐中，培養條件為攪拌速度180rpm，控制通風量0～12小時為9L/min，12～24小時為10.5L/min，24～36小時為12L/min；控制培養溫度為35～40℃，培養時間35～40小時。
全文摘要
一種纖維蛋白溶解酶生產菌及生產纖維蛋白溶解酶的方法，屬於食品生物技術領域。本發明從發酵食品蝦醬中篩選出一種能生產具有溶血栓能力酶的菌株，此菌株經中國典型培養物保藏中心鑑定為芽孢桿菌新種，定名為Bacillus sp.nov.SK006，其保藏編號為CCTCC NOM 205071。本發明還提供了用該菌株生產纖維蛋白溶解酶的方法，其育種工作量小，費用低，安全性能可靠，可以進行液體發酵生產，成本低，可用於大規模生產。其發酵產品無毒，可以直接製成膠囊、衝劑、口服液或口服含片，或作為功能性食品配料用於保健食品或普通食品中。
文檔編號C12N9/68GK1782070SQ20051009475
公開日2006年6月7日 申請日期2005年10月9日 優先權日2005年10月9日
發明者江波, 峰芳德, 華穎, 王璋 申請人:江南大學