一種抗重金屬汞離子抗體及其應用的製作方法

2023-06-09 11:54:06

專利名稱：：一種抗重金屬汞離子抗體及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗重金屬汞離子抗體及其應用。
背景技術：
：近年來，重金屬汙染事件層出不窮、愈演愈烈，人類賴以生存的空氣、土壤、蔬菜和動物均受到了重金屬等毒物的汙染。環境汙染和飼料藥物添加劑的濫用，造成畜禽產品重金屬殘留不同程度超標(逄瑞玥.我國畜禽產品質量安全存在的問題及應對策略.黑龍江糧食，2007，(4):20-22)。作物中積累的重金屬離子通過食物鏈的生物放大作用進入人畜體內，威脅人畜健康(郎明林，張玉秀，柴團耀.基因工程改良植物重金屬抗性與富集能力的研究進展.生物工程學報，2004，20(2)157-164)0汞是蓄積作用較強的元素，主要在動物體內蓄積。湖泊、沼澤中的水生植物、水產品易蓄積大量的汞。後期，農業上使用含汞殺蟎劑以來，汞對土壤、自然水系和大氣的汙染日益嚴重。汞汙染在世界的某些地方，已成為大眾健康的公害(梅光泉.重金屬廢水的危害及治理.微量元素與健康研究，2004，21(4)54-56)。快速靈敏地檢測食物中的重金屬含量是保障食品安全的基礎，傳統檢測重金屬殘留的分析方法包括原子吸收光譜分析(AtomicAbsorptionSpectroscopy,AAS)和電感華禹合等離子發身寸光譜(InductivelyCoupledPlasmaAtomicEmissionSpectroscopy,ICP-AES)^^^njHW(BontideanI，LloydJR,HobmanJL,etal.Bacterialmetal-resistanceproteinsandtheiruseinbiosensorsforthedetectionofbioavailableheavymetals.JInorgBiochemy，2000，79(1-4)-.225-229.)0但昂貴的儀器、專業的分析人員及複雜的樣品前處理限制了這些方法的應用。檢測必須在具備大型分析儀器的重點實驗室內進行，無法用於現場檢測，而且受到費用高、處理量有限和檢測時間長等限制(劉功良，王菊芳.重金屬離子的免疫檢測研究進展.生物工程學報，2006，22(6):877-881)。傳統的重金屬檢測方法不適合蔬菜、水果等保鮮期短、利潤低和需大通量檢測的樣品。對重金屬的常規性檢測方法已經有很多種，有些也已經是非常成熟的技術，但因為重金屬離子存在的範圍很廣，根據檢測精度、方便程度和檢測成本，每種技術都有它們的局限性，同時還需合適的場所，因此都不利於在生產中推廣應用。建立更快速、更經濟的免疫分析法檢測汞離子是生產及經濟發展的需要。
發明內容本發明的目的是提供一種抗重金屬汞離子抗體及其應用本發明提供的抗重金屬汞離子抗體為雜交瘤細胞株H2H5CCTCCN2.C200948分泌的單克隆抗體。雜交瘤細胞株H2H5CCTCCNs.C200948也屬於本發明保護的範圍，已於2009年7月8日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武漢大學)，保藏登記號為CCTCCNa·C200948。雜交瘤細胞株H2H5CCTCCN2.C200948或其分泌的單克隆抗體在汞離子免疫檢測中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明提供的雜交瘤細胞株H2H5CCTCCN2.C200948分泌的單克隆抗體為特異性單克隆抗體。其製備過程因Hg2+離子太小以至於不能引起免疫反應，所以用螯合劑(二乙烯三胺五乙酸，DTPA)將金屬離子與載體蛋白(匙孔血藍蛋白，KLH)連接起來。成功合成、鑑定汞複合物抗原後，免疫BALB/c小鼠，通過細胞融合獲得了穩定分泌抗體的雜交瘤細胞。用極限稀釋法亞克隆，通過ELISA篩選，最終獲得了穩定分泌抗汞離子抗體的細胞株(H2H5)。小鼠腹腔注射1X107H2H5細胞株製備腹水，腹水抗體效價在151200以上。經鑑定雜交瘤為IgGl亞類，輕鏈為kappa型且分泌抗體穩定性較好。雜交瘤細胞株H2H5CCTCCNo.C200948分泌的單克隆抗體為汞離子殘留免疫學檢測方法的建立提供了技術基礎，對提高風險評估工作的效率和質量，保障食品安全有重要現實意義。本發明的金屬汞離子螯合物的單克隆抗體的獲得，為汞離子殘留免疫學檢測方法的建立打下了基礎。可以利用上述單克隆抗體，研究和建立重金屬的免疫學檢測方法。並利用其快速、廉價、靈敏和特異性強的優點，發展便於現場檢測的便攜方法，從而適用於農畜產品的抽樣檢測及進出口通關的快速檢驗。對提高風險評估工作的效率和質量，保障食品安全有重要現實意義。圖1為小鼠五免後的差異率；圖2為陽性雜交瘤細胞的篩選圖3為H2H5第二次克隆後細胞上清抗體效價圖4為雜交瘤H2H5染色體核型的鑑定圖5為H2H5腹水型單克隆抗體的檢測圖6為和H2H5分泌抗體亞型圖7為H2H5分泌抗體的穩定性具體實施例方式實施例1、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的製備及鑑定一、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的製備1、抗原的製備與鑑定Hg-DTPA-KLH稱取5.65mg二乙烯三胺五乙酸(DTPA)加入ImLpH9.73的HEPES緩衝液中形成A液，轉入反應器，再加入濃度為3.46mol/L的Hg(NO3)2IOμL，室溫下反應30min後同時加入0.4mLpH9.73的HEPES緩衝液和1.7mL濃度為5.9g/L的匙孔血藍蛋白(KLH)，調節pH至9.0，室溫下攪拌反應12h。偶聯反應後，用預處理的CentriconYM-30超濾管對蛋白質複合物進行分離純化，除去沒有參與反應的Hg2+、螯合劑DTPA和Hg-DTPA複合物。Hg-DTPA-OVA的合成方法同上，用雞卵白蛋白(OVA(ovalbumin)替代匙孔血藍蛋白(KLH)，DTPA-OVA的合成方法同上用超純水代替金屬離子即可。超濾後用BCA試劑盒測定複合物蛋白濃度(RobertC.BlakeII，Andrey4R.Pavlov,MehrabanKhosraviani,etal.Blake.NovelMonoclonalAntibodieswithSpecificityforChelatedUranium(VI)!IsolationandBindingProperties.BioconjugateChem，2004，15(5):1125_1136)。參照國標GB/T17141-1997，用石墨爐原子吸收光譜法檢測超濾後的上清，濾過液及HEPES液中Hg2+濃度(KhosravianiΜ,PavlovAR,FlowersGC,etal.Detectionofheavymetalsbyimmunoassay!optimizationandvalidationofarapid,portableassayforioniccadmium.EnvironSciTtechnoy,1998,32(1)137-142)。結果表明，超濾後用BCA試劑盒測定蛋白濃度，繪製標準曲線後，據公式y=0.0008X+0.0065(R2=0.9995)y表示0D57(1，χ表示蛋白濃度(mg/L)計算出上清中完全抗原Hg-DTPA-KLH蛋白濃度為4.615g/L，濾過液中蛋白濃度為0.Olg/L。用石墨爐原子吸收光譜法檢測Hg2+結果Hg-DTPA-KLH，DTPA-KLH，HEPES溶液中汞離子的溶度分別為208mg/Kg，Omg/Kg,Omg/Kg。如果抗原未合成成功，游離的Hg2+或Hg-DTPA會隨著超濾而被過濾掉，超濾後的上清中不會含有Hg2+，而我們從超濾後的上清中檢測出了Hg2+且含量較高，證明抗原合成成功。2、小鼠的免疫及融合小鼠的選擇小鼠的免疫免疫BALB/c小鼠(購於中國軍事醫學科學院實驗動物中心)五隻，首免時，免疫抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻後乳化Ih2h(PalmariniΜ,MurgiaC,FanH.SplicedandprematurelypolyadenylatedJaagsiektesheepretrovirus(JSRV)-specificRNAsfrominfectedortransfectedcells.Virology,2002，294(1):180-188)，每隻BABL/c小鼠皮下多點注射200μg抗原。三周後第二次免疫，相同劑量抗原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化後免疫，以後每隔兩周免疫一次，方法同第二次免疫。第三次免疫及以後每次免疫後7d，尾靜脈採血，分離血清，測定血清的效價和產生抗體的特異性。融合小鼠的選擇用間接ELISA法選擇融合小鼠，方法如下①包被用HBS(10mmol/L,pH7.4)分別稀釋Hg-DTPA-OVA和DTPA-0VA，並以相同的濃度5mg/L分別包被到96孔酶標板上，50μL/孔，4°C過夜或37°C孵化2h；②封閉:PBST(1LPBST組分=NaCl8g,KCl0.2g,NaHPO412H203.63g,KH2PO4O.24g,Tween20500μL，pH7.3)洗滌5次，拍幹，按100μL/孔加3%BSA,37°C封閉Ih；③一抗一抗=PBST洗滌5次，分別加入相同稀釋比的上述五次免疫後的小鼠血清，以未免疫BALB/c小鼠(購於中國軍事醫學科學院實驗動物中心)的血清作陰性對照，50μL/孔，37°C孵化Ih;④酶標二抗洗滌同步驟③，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG/IgM(混合物)15000稀釋後，50yL/孔，37°C孵育Ih；⑤顯色洗滌同上，加入顯色液TMB，50μL/孔，37°C孵育15min；⑥終止反應按50μL/孔加IN鹽酸終止反應；⑦酶標儀上測OD450值，以空白孔調零。按公式計算差異率Differnce(OD450ofHg-DTPA-OVA-OD45tlofDTPA-0VA)/OD450ofDTPA-0VAX100%。結果如圖1所示，五免後檢測小鼠血清中抗體效價後，計算各小鼠的差異率的結果顯示1號小鼠差異率最高。幾隻小鼠同時產生了抗DTPA和Hg-DTPA的抗體，但是1號小鼠抗Hg-DTPA的抗體水平最高且差異率最大，說明1號小鼠產生針對Hg2+的抗體特異性最強，所以選1號小鼠用於融合(圖1)。3、細胞融合、陽性融合孔的篩選及陽性融合細胞的克隆選擇步驟2所述的1號小鼠進行細胞融合，融合前3d加強免疫小鼠。融合前Id製備飼養細胞(BABL/c小鼠腹腔巨噬細胞)，將細胞濃度調至1X105/mL,按0.ImL/孔加到96孔細胞培養板內，備用。取強免疫1號小鼠脾細胞及處於對數生長期的SP2/0骨髓瘤細胞株(購自中國醫學科學院腫瘤研究所)以61細胞數量比混合，用50%(質量百分含量)PEG1450研究所贈送(美國sigma公司購買)溶液介導融合，將融合後的細胞加入到含飼養細胞的培養板中，0.ImL/孔，37°C，5%CO2培養箱培養(李鳳奎，王純耀主編.實驗動物與動物實驗方法學.鄭州鄭州大學出版社.2007377)。待細胞長滿孔底的1/3後，用間接ELISA法檢測融合孔上清，方法同步驟2中的融合小鼠的選擇，一抗是細胞上清，用未融合孔做陰性對照。用極限稀釋法克隆陽性細胞，細胞上清的檢測方法同陽性融合孔的篩選。陽性融合孔的篩選的結果表明，10天後96孔細胞培養板中長出肉眼可見的雜交瘤細胞團，待細胞長滿孔底的1/3取細胞上清檢測抗體效價，結果顯示雜交瘤H2H5、3D12、H1H8、2A11抗體效價都大於陰性對照的2.1倍，判定為陽性雜交瘤，且H2H5的差異率比2A1U3D12的差異率大四株細胞上清與Hg-DTPA-OVA反應OD45tl值均高於與DTPA-OVA反應OD450值，其中H2H5差異較大(圖2)，說明這兩株細胞分泌的抗體針對Hg2+離子的特異性較強，H2H5進行亞克隆。4、陽性融合細胞的亞克隆化H2H5經過兩次亞克隆化後細胞分泌的抗體的效價有所升高，獲得穩定的分泌抗Hg2+單克隆抗體的細胞株，說明亞克隆較成功，還可以看出H2H5分泌的抗體對金屬Hg2+的特異性較H1H8的強(圖3)。H2H5已於2009年7月8日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為湖北省武漢市武漢大學)，H2H5保藏登記號為CCTCCNa.C200948。二、分泌抗重金屬汞離子抗體的雜交瘤的鑑定1、雜交瘤染色體核型的鑑定參照文獻(司徒鎮強主編.細胞培養.西安世界圖書出版社.2007242)所述的方法進行雜交瘤染色體核型的鑑定，具體方法為取對數生長期雜交瘤細胞株H2H5用終濃度為0.05mg/L0.lmg/L的秋水仙素處理4h6h，收集細胞後用低滲KCL溶液處理30min,固定液固定，滴加細胞懸液到4°C預冷的載玻片上，室溫自然乾燥，Giemsa染色，經光學顯微鏡觀察，挑選細胞形態完整染色體分散均勻的細胞計數。每株計數5個細胞，記錄染色體數目並算出平均值。雜交瘤細胞染色體核型分析結果表明，SP2/0細胞的染色體數目平均為68條，脾細胞染色體數目平均為40條，而雜交瘤細胞的染色體數目均在100以上(圖4)，高於兩親本細胞的染色體數目，說明這兩株雜交瘤細胞是SP2/0細胞和脾細胞的雜交產物。2、腹水型單克隆抗體的製備取8周齡10周齡的雌性BABL/c小鼠，腹腔注射石蠟油0.5mL/只，1周2周後分別腹腔注射ιχIO6個雜交瘤H2H5和HIH8，接種細胞7dIOd後密切觀察動物的健康狀況與腹水徵象，抽取腹水。室溫放置30min後，4°C放置1.5h2h後12000r/min，離心2min，取上清-20°C保存備檢。梯度稀釋腹水型抗體後檢測小鼠腹水效價，檢測方法同步驟一種的步驟2所述的融合小鼠的選擇，一抗是稀釋後的腹水。取得細胞株H2H5腹水型抗體後檢測得出H2H5的效價大於151200(圖5)。3、抗汞離子抗體亞型的鑑定取出正在培養的雜交瘤H2H5和HIH8細胞上清，按150稀釋後，按照鼠單抗亞型鑑定試劑盒ISOStripTMMonoclonalAntibodyIsotypingKit說明書操作，取稀釋液0.15mL加入試劑盒小管中，室溫放置lmin。待其自然溶解後，輕輕混勻。然後將試劑條插到小管底部，大約5min後，當最前端條帶在兩對「+」中間出現時，即可見與雜交瘤細胞株所分泌的抗體亞類和輕鏈類型對應的指示條帶所在位置，從而確定抗體亞型。結果表明，當最前端條帶出現在兩對「+」中間時，抗體亞類和輕鏈指示條帶分別在Gl,k位置，即細胞株H2H5所分泌的抗體為IgGl亞類，輕鏈為kappa型(圖6)。4、雜交瘤分泌抗體穩定性的測定將雜交瘤細胞株凍存後，過一段時間再復甦並且連續培養後測抗體效價。檢測方法同步驟一的步驟3中陽性融合孔的篩選，用Hg-DTPA-OVA包被酶標板，二抗用辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG。經檢測顯示細胞株H2H5分泌抗金屬Hg2+單克隆抗體的水平未見明顯下降(圖7)，表明抗體的穩定性較好，同時可證明亞克隆較成功。效價稍有波動，可能是由於取細胞上清備檢時間間隔不同以及每次檢測之間的誤差所致，屬正常。三、討論由於Hg2+能與動物體內生物分子發生強烈的不可逆的反應，導致動物中毒，因此，可利用特異性的雙功能螯合劑DTPA螯合Hg2+，形成能被動物免疫系統識別的螯合物，但這些重金屬複合物是分子量低於IkD的半抗原，免疫原性低，不足以引起免疫反應(YuHN,JonesRM,BlakeDA.Animmunosensorforautonomousin-linedetectionofheavymetalsvalidation.IntJEnvironAnalChem，2005，85(12-13):817_830)。DTPA除了能螯合金屬離子之外，還能與載體蛋白偶聯，可以成功製備重金屬汞的包被抗原和免疫抗原(DarwishIA,BlakeDA.One-stepcompetitiveimmunoassayforcadmiumionsdevelopmentandvalidationforenviromentalwatersamples.AnalChem,2001,73(8)1889-1895；DarwishIA,BlakeDA.Developmentandvalidationofaone-stepimmunoassayfordeterminationofcadmiuminhumanserum.AnalChem,2002,74(1)52-58)。有多種蛋白質如KLH、BSA、0VA等能作為載體蛋白，但從誘發免疫應答的角度來看，KLH的免疫原性優於BSA、OVA等，因此本研究用KLH作為載體蛋白來免疫小鼠以期產生更強的免疫應答。重金屬Hg2+單克隆抗體製備的關鍵在於重金屬免疫原的製備，所以對免疫原鑑定後再免疫小鼠是成功得到重金屬單克隆抗體的保證。本研究先用BCA法測定了超濾後上清中的重金屬複合物蛋白濃度，然後用石墨爐原子吸收光譜法檢測其中的Hg2+含量，這為之後重金屬Hg2+的單克隆抗體的成功製備提供了可靠的保證。本研究根據差異率(Differenced)篩選融合所用小鼠，Differenced越大，說明產生針對Hg2+的抗體特異性越強，融合篩選得到陽性雜交瘤細胞的機率就越大。本研究成功獲得了抗重金屬Hg2+或Hg-DTPA的單克隆抗體，目前正在純化抗體並對抗體的各項性能進行鑑定。該工作的完成為其它抗重金屬抗體的製備提供了可行的方法，也為重金屬免疫檢測方法的建立及應用(如ELISA方法、免疫膠體金快速診斷法(陳鳳梅，李娟，曲原君，等.免疫膠體金的研究進展及應用.中國獸藥雜誌，2004，38(8)33-35)等)奠定基礎。本發明所獲得的抗體，可用於免疫學檢測技術檢測重金屬，具有檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等優點，可用於現場對重金屬進行靈敏、準確、實時、快速的檢驗分析。免疫分析技術引起人們越來越多的關注，這也是免疫分析技術發展的必然趨勢，也是成本低工業化生產所要求的。權利要求雜交瘤細胞株H2H5CCTCC№.C200948。2.雜交瘤細胞株H2H5CCTCCNs.C200948分泌的單克隆抗體。3.雜交瘤細胞株H2H5CCTCCN2.C200948或其分泌的單克隆抗體在汞離子免疫檢測中的應用。全文摘要本發明公開了一種抗重金屬汞離子抗體及其應用。該抗重金屬汞離子抗體為雜交瘤細胞株H2H5CCTCC№.C200948分泌的單克隆抗體。本發明的金屬汞離子螯合物的單克隆抗體的獲得，為汞離子殘留免疫學檢測方法的建立打下了基礎。可以利用上述單克隆抗體，研究和建立重金屬的免疫學檢測方法。並利用其快速、廉價、靈敏和特異性強的優點，發展便於現場檢測的便攜方法，從而適用於農畜產品的抽樣檢測及進出口通關的快速檢驗。對提高風險評估工作的效率和質量，保障食品安全有重要現實意義。文檔編號C12N5/20GK101948807SQ20101026132公開日2011年1月19日申請日期2010年8月24日優先權日2010年8月24日發明者李霞,楊慧,趙麗申請人:北京市農林科學院