一種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌及其應用的製作方法

2023-06-09 16:07:51

一種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌，其分類命名為產朊假絲酵母（Candida?utilis），菌株號為TKZY-05，已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.7521，保藏日期為2013年04月26日。本發明還公開了上述產朊假絲酵母菌的應用。本發明的產朊假絲酵母菌TKZY-05菌體RNA含量可達到菌體乾重的17%，比出發菌株的RNA產量提高了10%。該菌株經過10代以上傳代，生產核糖核酸的性能保持穩定。
【專利說明】—種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物【技術領域】，涉及一種高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌及其應用。
【背景技術】
[0002]核糖核酸(Ribonucleic acid,簡稱RNA)是一類極為重要的生物大分子物質,屬於兩大類核酸之一。RNA及其降解物在農業生產、飼料工業等行業都有著重要的作用。近些年研究表明，RNA的降解產物核苷酸能提高植物根系吸收能力、促進代謝、加強CO2的固定能力、促進光合作用，其可提高種子內含物的轉化效率、出苗率以及促進植物根系的生長。適期施用核苷酸，能使農作物早熟、優質、增產，因此核苷酸可作為植物生長調節劑用於農作物的生產。由於核苷酸可提高動物對細菌、真菌感染的抵抗力、增加免疫力等作用，在水產和畜牧生產中核苷酸可明顯提高飼料利用率，具有促進動物生長和改善肉質的明顯作用。核苷酸在植物生長調節劑和飼料添加劑領域的應用將是一個嶄新的巨大的市場，具有廣闊的應用。
[0003]目前，工業上都是通過微生物發酵法生產RNA。20世紀60年代，日本開始研究通過培養富含RNA的酵母來生產RNA，經過不斷改進培養方法，目前酵母發酵生產RNA的工藝已相當成熟。盛建國等(食品工業科技，2007，28 (I) =140-142)分別以原糖液、糖化液和廢糖蜜作為碳源培養熱帶假絲酵母K-79株，發現以原糖液為碳源時RNA含量最高為8.6%。在一些發酵液和其他生產廢液、廢渣中通常有一些富含RNA的菌體，如從啤酒酵母和味精生產廢液中的菌體中可提取RNA產品。
[0004]離子注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用於對微生物菌種的誘變育種，並取得了良好效果。
[0005]本發明擬通過離子束誘變技術對產朊假絲酵母菌株進行篩選，以得到傳代穩定，高含核糖核酸的菌株。

【發明內容】

[0006]本發明所要解決的技術問題是提供一株高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌。
[0007]本發明還要解決的技術問題是提供上述產朊假絲酵母菌的應用。
[0008]為解決上述 技術問題，本發明採用的技術方案如下:
[0009]一種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌，其分類命名為產朊假絲酵母(Candida utilis),菌株號為TKZY-05,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC N0.7521，保藏日期為2013年04月26日。該菌株是通過對土壤篩選到的產朊假絲酵母菌進行低能離子束注入，然後將誘變後的菌株轉接於平板培養基中培養，挑選單菌落轉接於麥芽汁斜面培養，後經含碳源、氮源、無機鹽和水的液體種子培養基和發酵培養基培養從而篩選出的核糖核酸高產菌。
[0010]CGMCC N0.7521菌株具有下述性質:
[0011]1、菌落形態學特徵:
[0012]細胞呈圓形、橢圓形或臘腸形，大小為(3.5~4.5) μπιΧ (7~13)μπι。液體培養不產醭，管底有菌體沉澱。在麥芽汁瓊脂培養基上，菌落乳白色，平滑，有或無光澤，邊緣整齊或菌絲狀。在加蓋片的玉米粉瓊脂培養基上，形成原始假菌絲或不發達的假菌絲，或無假菌絲。
[0013]2、生理與生化特性:
[0014]菌株典型的兼性厭氧型單細胞真菌。在有氧的情況下，它進行有氧呼吸，排出二氧化碳；而在缺氧的條件下，其進行無氧呼吸，分解有機物(主要是葡萄糖)，產生酒精和水；該菌的最佳生長溫度為32°C，最適pH值為4.0。
[0015]3、營養特徵:
[0016]該菌能利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖，不發酵麥芽糖、半乳糖、乳糖和蜜二糖。不分解脂肪，能同化硝酸鹽。
[0017]上述產朊假絲酵母菌在發酵生產核糖核酸中的應用。
[0018]具體應用方法為，將產朊假絲酵母菌CGMCC N0.7521先經種子培養，再經發酵培養，製備核糖核酸。
[0019]其中，所述的種子培養，液體種子培養基配方如下:溶劑水，碳源I~300g/L，氮源I~100g/L,無機鹽0.01~100g`/L。優選的配方是,溶劑水,碳源10~60g/L,氮源10~30g/L,無機鹽0.1~10g/L。更優選的配方是,溶劑水,碳源10~60g/L,氮源10~30g/L,無機鹽0.6~1.6g/L。
[0020]其中，所述的發酵培養，液體發酵培養基配方如下:溶劑水，碳源I~500g/L，氮源I~10g/L,磷酸0.1~5ml/L,無機鹽0.01~10g/L。優選的配方是，溶劑水，碳源10~60g/L,氮源2~5g/L,磷酸0.66~2ml/L,無機鹽0.55~2.4g/L。更優選的配方是,溶劑水，碳源30~47g/L,氮源3~4g/L,磷酸1.3~2ml/L,無機鹽I~1.5g/L。
[0021]其中，所述的碳源選自糖蜜、葡萄糖、甘油、麥芽糖和蔗糖中的任意一種或多種。
[0022]其中，所述的氮源選自蛋白腖、酵母膏、玉米漿、尿素和硫酸銨中的任意一種或多種。
[0023]其中，所述無機鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的任意一種或多種。
[0024]其中，所述液體發酵培養基的初始pH為2.5~9.5。優選的pH為4~6 ;進一步優選的pH為4~5。該pH調節可採用氨水進行。
[0025]其中，發酵培養的溫度為29~40°C，優選為30~33°C ;發酵培養的時間為12~20小時，優選為16~18小時。
[0026]發酵培養前按照體積比為I~30:100，優選為8~12:100的接種量接種。
[0027]本發明的有益效果包括:
[0028]1.與傳統的輻射法及化學誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩定、易於獲得理想新品種等特點。
[0029]2.本發明的核糖核酸高產菌產朊假絲酵母菌TKZY-05 (CGMCC N0.7521)能夠利用多種碳源和氮源發酵生產核糖核酸，操作方便簡單。具有高產性狀穩定的特點，該菌株經過10代以上傳代，生產核糖核酸的性能保持穩定。
【具體實施方式】
[0030]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的內容僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0031]實施例1:
[0032]以從實驗室分離得到的產核糖核酸的菌株為出發菌株，將經N+離子束誘變(低能離子注入機靶室內真空度為2X10 —4，注入能量為50kev，劑量為5 X 1013ions.cm—2.s-1)後的孢子懸浮液經無菌水稀釋100倍後，取0.1ml塗布於麥芽汁平板培養基上30°C下培養3天，從中挑選單菌落在麥芽汁斜面培養3天。轉接一環於裝有30mL液體種子培養基(糖蜜 30g/L，硫酸銨 10g/L，酵母膏 20g/L，氯化鉀 1.5g/L，NaCl0.lg/L，ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，於32°C下IlOrpm搖床培養24小時。再轉接IOmL於裝有IOOmL液體發酵培養基(糖蜜45g/L，(NH4) 2S043g/L, H3PO40.7ml/L, MgSO40.5g/L，FeSO40.05g/L，用氨水將培養基 pH 調節為4.0)的500mL搖瓶中，於32°C下240rpm搖床發酵培養16小時。經過初篩，得到100株比出發菌株產量高的突變株。用同樣的條件下進行復篩，最終得到產量最高的菌株TKZY-05，菌體RNA含量可達到菌體乾重的13.5%，比原始菌株的7%提高了 6.5%。 [0033]實施例2:
[0034]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉接一環於裝有30mL液體種子培養基(糖蜜IOg/L，硫酸銨 5g/L，酵母膏 10g/L，氯化鉀 0.lg/L, NaCl0.5g/L，ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，於33°C下IlOrpm搖床培養24小時。轉接8mL於裝有IOOmL液體發酵培養基(糖蜜50g/L，(NH4)2SO4L 5g/L, H3PO40.8ml/L,MgSO40.2g/L，FeS042.0g/L，用氨水將培養基 pH 調節為 5.0)的500mL搖瓶中，於30°C下240rpm搖床發酵培養16小時。菌體RNA含量可達到菌體乾重的 17%。
[0035]實施例3:
[0036]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉接一環於裝有30mL液體種子培養基(葡萄糖15g/L，硫酸銨 15g/L，玉米漿 30g/L，氯化鉀 6g/L，NaC18g/L, ρΗ6.0)的 500mL 搖瓶中，於 31°C下IlOrpm搖床培養24小時。轉接IOmL於裝有IOOmL液體發酵培養基(麥芽糖40g/L，(NH4) 2S043g/L, H3PO4ImVL, MgSO40.8g/L，FeSO4L 6g/L，用氨水將培養基 pH 調節為 5.0)的500mL搖瓶中，於32°C下240rpm搖床發酵培養17小時。菌體RNA含量可達到菌體乾重的15%。
[0037]實施例4:
[0038]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉接一環於裝有30mL液體種子培養基(甘油40g/L，硫酸銨 30g/L，尿素 20g/L，氯化鉀 10g/L, NaC15g/L, ρΗ4.0)的 500mL 搖瓶中，於 30°C下IlOrpm搖床培養24小時。轉接12mL於裝有IOOmL液體發酵培養基(蔗糖30g/L，(NH4) 2S044g/L，H3PO4L 5ml/L，MgSO4L 5g/L，FeSO40.8g/L，用氨水將培養基 pH 調節為 4.0)的500mL搖瓶中，於32°C下240rpm搖床發酵培養18小時。菌體RNA含量可達到菌體乾重的 17.5%ο[0039]實施例5:
[0040]將菌株TKZY-05從麥芽汁斜面轉接一環於裝有30mL液體種子培養基(麥芽糖40g/L，硫酸銨 30g/L，蛋白腖 30g/L,氯化鉀 10g/L, NaC15g/L, ρΗ6.0)的 500mL 搖瓶中，於33°C下IIOrpm搖床培養24小時。轉接12mL於裝有IOOmL液體發酵培養基(葡萄糖IOg/L，(NH4) 2S045g/L, H3P042ml/L, MgS042g/L, FeSO40.2g/L，用氨水將培養基 pH 調節為 5.0)的500mL搖瓶中，於33°C下240rpm搖床發酵培養18小時。菌體RNA含量可達到菌體乾重的15%。
[0041]實施例6:
[0042]將菌株TKZY-05連續傳10代以上，在實施例2的培養條件下進行發酵培養，生產核糖核酸。結果表明(見表1，2和3)，連續10代以上遺傳培養，菌株TKZY-05生產核糖核酸的性能穩定。
[0043]表1連續傳I~5代的菌株TKZY-05的生產核糖核酸性能
[0044]
【權利要求】
1.一種用於發酵高產核糖核酸的產朊假絲酵母菌，其分類命名為產朊假絲酵母(Candida utilis),菌株號為TKZY-05,已保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7521，保藏日期為2013年04月26日。
2.權利要求1所述的產朊假絲酵母菌在發酵生產核糖核酸中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於，將產朊假絲酵母菌CGMCCN0.7521先經種子培養，再經發酵培養，製備核糖核酸。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的種子培養，其中，液體種子培養基配方如下:溶劑水，碳源I~300g/L,氮源I~100g/L,無機鹽0.01~100g/L。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的發酵培養，其中，液體發酵培養基配方如下:溶劑水，碳源I~500g/L,氮源I~10g/L,磷酸0.1~5ml/L,無機鹽0.01~10g/L。
6.根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於，所述的碳源選自糖蜜、葡萄糖、甘油、麥芽糖和蔗糖中的任意一種或多種。
7.根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於，所述的氮源選自蛋白腖、酵母膏、玉米漿、尿素和硫酸銨中的任意一種或多種。
8.根據權利要求4或5所述的應用，其特徵在於，所述無機鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、鐵鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的任意一種或多種。
9.根據權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述液體發酵培養基的初始pH為2.5~9.5。`
10.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於，發酵培養的溫度為29~40°C，發酵培養的時間為12~20小時。
【文檔編號】C12N1/16GK103820338SQ201410058491
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月20日 優先權日:2014年2月20日
【發明者】陳曉春, 黃小權, 蔡家棟, 張磊, 盛兵, 湯亦文, 陳勇 申請人:南京同凱兆業生物技術有限責任公司