能在簡單節桿菌中複製並表達甾體類化合物a環1,2位脫氫酶基因的質粒的構建方法及應用的製作方法

2023-06-10 02:46:46

專利名稱：能在簡單節桿菌中複製並表達甾體類化合物a環1,2位脫氫酶基因的質粒的構建方法及應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程和微生物發酵領域，涉及一種能在簡單節桿菌中複製並高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因(KsdD)的質粒。
背景技術：
留體類藥物具有重要的生理活性，在臨床上有廣泛的應用，是僅次於抗生素的第二大類藥物。醋酸可的松位Cl，2位上導入雙鍵後成醋酸潑尼松，抗炎作用能夠提高3-4倍，並且減少由鈉滯留而帶來的副作用。目前，留體藥物生產中常用的方法有化學合成和微生物轉化兩種，化學方法進行Cl，2位脫氫一般採用二氧化硒法，該方法常使產品中帶有少量難以除盡對人體有害的硒，然而微生物轉化法具有成本低、對環境溫和等優點，越來越受到人們的重視。 簡單節桿菌(Arthrobacter Simplex)的Cl, 2位脫氫反應是工業生產醋酸潑尼松及其同系物最有價值的一種反應，也是採用發酵法工業生產留類藥物的典型代表。目前甾體微生物轉化主要研究的領域主要在以下幾個方面:提高水不溶性底物的溶解度，細胞和酶的固定化以利於酶的重複利用，發展經濟有效的產物連續回收方式等用來提高產量。但是，尋找、篩選更優良菌種來提高轉化率才是更加長期有效的方法。目前國內在這步反應中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上進行深入的探索，尚無基因工程菌研發成功。這也限制了國內留體藥物生產的進一步發展。隨著分子生物學的發展和人們對留體代謝機制研究的深入，基因工程在留體藥物生產中必將得到廣泛的應用。本發明所用的簡單節桿菌是一種模式Cl，2位脫氫微生物，由於其發酵工業背景清楚，操作技術成熟等特點，已經廣泛用於醋酸可的松Cl，2位脫氫等領域。Choi等(1995，Journal of bacteriology 1779 (5),4152-4156)描述了簡單節桿菌(ArthrobacterSimplex)菌株中Cl，2位脫氫基因(KsdD)的基因序列、成功的將此基因異源表達於鏈黴菌並研究了此酶的性質，但並未對簡單節桿菌本身進行分子改造。簡單節桿菌本身的遺傳背景不清楚，沒有相關的能在簡單節桿菌中複製表達的質粒被報導。通過檢索，尚未發現與本專利申請相關的專利公開文獻。

發明內容
本發明目的在於克服現有技術的不足之處，提供一種製備時環境溫和、易於操作、生產成本低、能在簡單節桿菌裡複製並且高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒。本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種能在簡單節桿菌(Arthrobacter Simplex)中複製並表達甾體類化合物A環
I,2位脫氫酶基因的質粒的構建方法，具體步驟如下:⑴以簡單節桿菌基因組為模板進行PCR，所需要的引物如下:
P3:5/ - CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3' EcoRI ；P4:5/ - CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3' HindIII ；反應體系為50 μ L，配比如下:
IOxbuffer5μ ；
dNTP5μ ；
上遊引物Pl2|iL;
下遊引物P22(iL;
AS1.94 基因組2pL;
Taq 酶0.2μΙ^;
ddH2033恥；PCR程序如下:95°C預變性 5min ;94°C 變性 45s;63°C 退火 45s;72°C 延伸 lmin30s ;30 個循環後72°C延伸IOmin ;4°C保存；再通過瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收得到目的基因片段；⑵構建游離表達載體pXJM19- ksdD將目的基因通過EcoRI和HindIII雙酶切連接在載體pXJM19多克隆位點上，得到重組載體PXJM19- ksdD，所用連接酶為T4 DNA連接酶，連接體系為20 μ ，連接體系如下:目的基因:載體的摩爾濃度之比為3: f 9:1，加入0.2ul連接酶混勻後，在16 °(:下，過夜反應；經轉化、驗證構建成功後，即得能在簡單節桿菌中複製並高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒。如上所述的構建方法構建得到的質粒在構建高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌中的應用。而且，所述的構建高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌的步驟如下:將凍存的簡單節桿菌感受態細胞在冰上溶化後，取按感受態細胞:質料μ L:ng為1:3的比例加入質粒pXJM19- ksdD，混合均勻，使用高壓脈衝電擊轉化電擊該細胞混合物，電擊參數設置為:15kV/cm，25 μ F，電脈衝結束後，迅速將細胞懸液轉移到室溫復甦培養基中，振蕩培養疒9 h，復甦培養基連續稀釋後取150 μ L塗布於含40 yg/mL氯黴素的LB瓊脂平板上，在培養箱培養24-30小時，在抗性板上長出的菌落，即為高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌。而且，所述的復甦培養基的配方如下:含有濃度為10-15 mg/mL山梨醇的LB培養基。而且，所述的簡單節桿菌工程菌在一次性投料的生物轉化方面中的應用。本發明的優點和積極效果如下:1、本發明質粒能在簡單節桿菌裡複製並且高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因，該質粒製備時環境溫和、易於操作、生產成本低，而且，本發明質粒PXJM19- KsdD在簡單節桿菌中拷貝數較高並且能穩定存在，本發明質粒為進一步利用質粒PXJM19通過分子手段改良簡單節桿菌提供了依據，具有重要的實用意義。2、本發明質粒構建的工程菌在含酵母提取物(5%_8%)、磷酸鹽(1.5%_3%)、玉米漿(10%-15%)和葡萄糖(8%-12%)等營養成分的基礎上，通過恆溫通氣攪拌發酵，在留體化合物濃度不高於7%(m/V)時，採用一次加投留體化合物底物，在4(T50小時內生物脫氫轉化率能夠達到90%以上；在留體化合物濃度高於7%時，採用連續補加留體化合物底物的情況下，在55飛5小時內生物脫氫轉化率能夠達到95%以上。與原始菌不同時間段轉化醋酸可的松能力的比較，重組菌最終轉化率提高了 11.5 %，說明本發明質粒可以應用於構建高效表達甾體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌和一次性投料的生物轉化方面中。


圖1為本發明中游離表達載體pXJM19- ksdD的構建過程圖；圖2為本發明中含有空質粒PXJM19重組簡單節桿菌提取質粒HindIII單切驗證圖，I為提取質粒單切驗證結果，M為marker.；圖3為本發明pXJM19- ksdD質粒的重組菌轉化子圖；圖4為本發明所構建菌株與原始菌不同時間段轉化醋酸可的松能力的比較，重組菌最終轉化率提高了 11.5%左右。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發明的 保護範圍。本發明所使用的質粒大腸桿菌-穀氨酸棒狀桿菌穿梭表達載體PXJM19(Construction and application of newCorynebacterium glutamicumvectors, 1999,Biotechnology techniques 13 (6)， 437-441);本發明所使用宿主菌為簡單節桿菌(Arthrobacter Simplex),保藏編號為ACCC12070，可用於留體化合物生物脫氫。本發明在分析穿梭表達載體PXJM19能在簡單節桿菌裡複製的基礎上,進一步驗證了該質粒能在簡單節桿菌中高效表達，並成功的實現了 pXJM19_KsdD重組表達載體在簡單節桿菌中的高效表達。一種能在簡單節桿菌中複製並高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒的構建及檢測步驟的總體思路如下:—、驗證質粒pXJM19能在簡單節桿菌裡穩定複製；二、驗證質粒pXJM19能在簡單節桿菌裡高效表達；三、構建表達載體pXJM19_KsdD，將此表達質粒pXJM19- KsdD電轉進簡單節桿菌中得到一株高效用於留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌株；四、測定重組菌在留體化合物濃度不高於7%(m/V)時，採用一次加投留體化合物底物的轉化能力；五、測定在留體化合物濃度高於7%時，採用連續補加留體化合物底物的情況下，重組菌的轉化能力。一種能在簡單節桿菌中複製並高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒 pXJM19_KsdD,該質粒的基因序列為:NCBI (GenBank accession N0.AJ133195)。本發明中游離表達載體pXJM19- ksdD的構建過程圖見圖1，本發明質粒pXJM19-KsdD的構建的具體步驟如下:—、質粒pXJM19能否在簡單節桿菌裡穩定複製驗證菌種:簡單節桿菌(保藏編號為ACCC 12070) 質粒:pXJM19所述LB培養基為:蛋白腖10 g/L,酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、葡萄糖10 g/L。所述氯黴素抗性平板為含有40 Ug/mL的氯黴素，1.4%的瓊脂粉的LB固體培養基。質粒pXJM19能在簡單節桿菌內複製的驗證:將穩定期的簡單節桿菌按0.1%的接種量接種於新鮮培養基培養，當0D600值接近
0.3- 0.5時，加入一定濃度的青黴素，使其終濃度為30 iig/mL，繼續振蕩培養lh。隨後迅速將培養物冰上放置至少lOmin，離心收集菌體(2000轉，15min,4° C，用等體積冰預冷的電擊緩衝液(20%甘油+0.5mol/L山梨醇)洗滌3次，將細胞濃縮100倍。最後，將細胞懸液分裝到EP管中，每管60 ii L，凍存於-80° C待用。將凍存的簡單節桿菌感受態細胞在冰上溶化後，取50 ii L加入150ng質粒pXJM19(從E.coliDH5a中製備)混合均勻,然後轉移到冰預冷的電擊杯中。使用高壓脈衝電擊轉化電擊該細胞混合物，電擊參數 設置為:15kV/cm，25 U F電脈衝結束後，迅速將細胞懸液轉移到室溫復甦培養基的EP管中,振蕩培養8h,復甦後培養基連續稀釋後取150 u L塗布於含40 u g/mL氯黴素的LB瓊脂平板上，在培養箱培養24-30小時，能在抗性板上長出菌落，對照組沒長菌落，再通過提取質粒單酶切驗證。酶切反應體積為50 UL，將待酶切的DNA片段、ddH20、10XBuffer混合均勻後，加入2 u LHindIII限制性內切酶，混勻後，37 0C酶切3-4 ho驗證結果如圖2驗證成功,說明質粒pXJM19能在簡單節桿菌中複製。二、質粒pXJM19能在簡單節桿菌內表達的驗證1、卡那抗性基因編碼序列(不含啟動子和終止子)的擴增以質粒PET28為模板進行PCR，再通過瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收得到目的基因片段。所需要的引物如下:Pl:5' - CCGGAATTC ATGAGCCATATTCAACGGGAAAC-3' (EcoRI)；P2:5' -CCCAAGCTTTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAAT -3' (HindIII)；反應體系為50 ii L,配比如下:IOxbufFer5(oL；
ClN rp5mL
上遊引物Pl2]iL;
K遊引物P22|^L；
簡單節桿菌基因組2HL;
Taq 酶0.2(jL；
ddH2033.8(iL。PCR程序如下:95°C預變性 5min;94°C 變性 45s;54°C 退火 45s;72°C 延伸 lmin30s ;30 個循環後72°C延伸IOmin ;4°C保存。DNA片段回收:DNA片段回收採 用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的小量DNA產物純化試劑盒，方法如下:⑴估計PC R反應液或酶切反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液，充分混勻。⑵將上一步所得溶液加入一個吸附柱中，室溫放置2 min，12000 r/min離心30-60s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。⑶向吸附柱中加入700 UL漂洗液，12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中的
廢液，將吸附柱放入收集管中。重複此步驟一次。⑷將吸附柱放入收集管中，12000 r/min離心2 min，儘量除去漂洗液。將吸附柱置於室溫放置數分鐘，徹底晾乾，以防殘留的漂洗液影響下一步的實驗。(5)取出吸附柱，放入一個乾淨的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30-50 U L洗脫緩衝液，室溫放置2 min, 12000 r/min離心2 min，收集DNA溶液。-20 °C保存。2、構建游離表達載體將目的基因通過EcoRI和HindIII雙酶切連接在pXJM19多克隆位點上，得到重組載體pXJM19-Km。酶切反應體積為50 u L，將待酶切的DNA片段、ddH20、10XBuffer混合均勻後，加入2 ULHindIII和EcoRI限制性內切酶，混勻後，37 °C酶切3_4 h。所用連接酶為T4 DNA連接酶，連接體系為20 ML，連接體系如下:目的基因:載體(摩爾濃度之比)=3:1-9:1，加入適量0.2ul連接酶混勻，在16 °(:下，過夜反應3、電轉游離表達載體將穩定期的簡單節桿菌按0.1%的接種量接種於新鮮培養基培養，當0D600值接近
0.3- 0.5時，加入一定濃度的青黴素，使其終濃度為30 ii g/mL，繼續振蕩培養lh。隨後迅速將培養物冰上放置至少lOmin，離心收集菌體(2000轉，15min，4° C，用等體積冰預冷的電擊緩衝液(20%甘油+0.5mol/L山梨醇)洗滌3次，將細胞濃縮100倍。最後，將細胞懸液分裝到EP管中，每管60 iiL，凍存於-80° C待用將凍存的簡單節桿菌感受態細胞在冰上溶化後，取50 ii L加入150ng質粒pXJM19-Km (從E.coliDH5a中製備)混合均勻，然後轉移到冰預冷的電擊杯中。使用高壓脈衝電擊轉化電擊該細胞混合物，電擊參數設置為:15kV/cm，25 UF電脈衝結束後，迅速將細胞懸液轉移到室溫復甦培養基的EP管中，振蕩培養8h，復甦後培養基連續稀釋後取150 u L塗布於含40 u g/mL氯黴素的LB瓊脂平板上，在培養箱培養24-30小時，能在抗性板上長出菌落，對照組沒長菌落，再通過提取質粒驗證。質粒提取採用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的質粒小提試劑盒。方法如下:⑴取1-5 mL過夜培養的菌液，加入離心管中，12000 r/min離心I min，儘量吸除上清。⑵向留有菌體沉澱的離心管中加入250 U L溶液I (已加入RNaseA)，使用移液器或渦旋器徹底懸浮細菌沉澱(革蘭氏陽性菌需要加入溶菌酶至終濃度I mg/mL，37 °C溫育30 min)。⑶向離心管中加入250 UL溶液2，溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。⑷向離心管中加入350 u L溶液3，立即溫和的上下翻轉6_8次，充分混勻，即出現白色絮狀沉澱。12000 r/min離心10 min，此時在離心管底部形成沉澱。(5)將上一步收集的上清液用移液器移至吸附柱中，儘量不要吸出沉澱。12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500 UL去蛋白液，12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(7)向吸附柱中加入700 ii L漂洗液，12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中的 廢液，將吸附柱放入收集管中。重複此步驟一次。(8)將吸附柱放入收集管中，12000 r/min離心2 min，儘量除去漂洗液。(9)將吸附柱置於一個乾淨的離心管中，室溫放置數分鐘，徹底晾乾，以防殘留的漂洗液影響下一步的實驗。(W)向吸附膜中間位置懸空滴加60-100 UL洗脫緩衝液，室溫放置2 min, 12000 r/min離心2 min,收集DNA溶液。-20 °C保存。4、質粒pXJM19表達能力的驗證挑取驗證成功的菌株，接種含40 U g/mL氯黴素的LB培養基上，0D600值接近0.3-
0.5時加入一定濃度的IPTG誘導，誘導6h後將菌體塗布於含有不同濃度(50、60、70、90、180,300) u g/mL的卡納黴素的LB瓊脂平板。結果重組菌在平板上長有菌落，而對照組(帶有空質粒的菌種)沒在平板上長有菌落。並且重組菌可在含有180 u g/mL抗生素的平板上生長。這說明質粒PXJM19能在簡單節桿菌裡表達且表達水平較高。三、表達載體pXJM19_KsdD的構建1、各基因的擴增目的基因(ksdD)的擴增首先，以簡單節桿菌基因組為模板進行PCR，再通過瓊脂糖凝膠電泳及切膠回收得到目的基因片段。所需要的引物如下:P3:5' - CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3' (EcoRI)；P4:5' - CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3' (HindIII)；
反應體系為50 U L，配比如下:
IOxbuffer5(j.L；
dNTP5|iL；
上遊引物Pl2^L；
K遊引物P22^L；
簡單節桿菌基因組2nL;
Taq 酶0.2jj_L;
ddH2033恥。PCR程序如下:95°C預變性 5min ;94°C 變性 45s;63°C 退火 45s;72°C 延伸 lmin30s ;30 個循環後72°C延伸IOmin ;4°C保存。2、構建游離表達載體pXJM19- ksdD將目的基因通過EcoRI和HindIII雙酶切連接在pXJM19多克隆位點上，酶切反應體積為50 u L，將待酶切的DNA片段、ddH20、10XBuffer混合均勻後，加入2 u LHindIII和EcoRI限制性內切酶，混勻後，37 °C酶切3-4 h。所用連接酶為T4 DNA連接酶，連接體系為20 ML，連接體系如下:目的基因:載體(摩爾濃度之比)=3:1-9:1，加入適量0.2ul連接酶混勻，在16 °(:下，過夜反應。經轉化、驗證構建成功後，即得能在簡單節桿菌中複製並高效表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒。得到重組載體pXJM19- ksdD。3、將穩定期的簡單節桿菌按0.1%的接種量接種於新鮮培養基培養，當0D600值接近0.3- 0.5時，加入一定濃度的青黴素，使其終濃度為30 u g/mL，繼續振蕩培養Ih。隨後迅速將培養物冰上放置至少lOmin，離心收集菌體(2000轉，15min，4° C，用等體積冰預冷的電擊緩衝液(20%甘油+0.5mol/L山梨醇)洗滌3次，將細胞濃縮100倍。最後，將細胞懸液分裝到EP管中，每管60 iiL，凍存於-80° C待用。將凍存的簡單節桿菌感受態細胞在冰上溶化後，取50i! L加入150ng質粒PXJM19-ksdD (從E.coliDH5a中製備)混合均勻，然後轉移到冰預冷的電擊杯中。使用高壓脈衝電擊轉化電擊該細胞混合物，電擊參數設置為:15kV/cm，25 UF電脈衝結束後，迅速將細胞懸液轉移到室溫復甦培養基即(10_15mg/ml )山梨醇的LB培養基的EP管中，振蕩培養8h,復甦後培養基連續稀釋後取150 u L塗布於含40 u g/mL氯黴素的LB瓊脂平板上，在培養箱培養24-30小時，能在抗性板上長出菌落，對照組沒長菌落。如圖3。4、重組轉化子的驗證 挑取其中10株轉化子，提取質粒驗證，1，3，4，5，6，7號菌驗證成功。質粒提取採用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的質粒小提試劑盒。方法如下:⑴取1-5 mL過夜培養的菌液，加入離心管中，12000 r/min離心I min，儘量吸除上清。⑵向留有菌體沉澱的離心管中加入250 U L溶液I (已加入RNaseA)，使用移液器或渦旋器徹底懸浮細菌沉澱(革蘭氏陽性菌需要加入溶菌酶至終濃度I mg/mL，37 °C溫育30 min)。⑶向離心管中加入250 UL溶液2，溫和的上下翻轉6-8次使菌體充分裂解。⑷向離心管中加入350 u L溶液3，立即溫和的上下翻轉6-8次，充分混勻，即出現白色絮狀沉澱。12000 r/min離心10 min，此時在離心管底部形成沉澱。(5)將上一步收集的上清液用移液器移至吸附柱中，儘量不要吸出沉澱。12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中。(6)向吸附柱中加入500 UL去蛋白液，12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中
的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。(7)向吸附柱中加入700 UL漂洗液，12000 r/min離心30-60 S，倒掉收集管中的
廢液，將吸附柱放入收集管中。重複此步驟一次。⑶將吸附柱放入收集管中，12000 r/min離心2 min，儘量除去漂洗液。(9)將吸附柱置於一個乾淨的離心管中，室溫放置數分鐘，徹底晾乾，以防殘留的漂洗液影響下一步的實驗。(10)向吸附膜中間位置懸空滴加60-100 UL洗脫緩衝液，室溫放置2 min, 12000 r/min離心2 min,收集DNA溶液。-20 °C保存。四、重組菌轉 化醋酸可的松能力的測定為初步測定重組菌轉化醋酸可的松能力的變化情況，將得到的重組菌株和原始菌株分別在在含有酵母提取物(5%-8%)、磷酸鹽(1.5%-3%)、玉米漿(10%-15%)和葡萄糖(8%-12%)，通過恆溫通氣攪拌發酵，在留體化合物(醋酸可的松、含氟皮質激素、4-AD等)濃度不高於7%(m/V)時，採用一次加投留體化合物底物，實驗結果見圖4。在留體化合物濃度高於7%時，採用分次少量補加底物，酒精水的乳濁液的連續緩慢流加的生物轉化方法，在60小時內生物脫氫轉化率能夠達到95%以上。綜上，本實驗室中保藏的大腸桿菌-穀氨酸棒桿菌穿梭表達載體PXJM19能在簡單節桿菌中複製和表達。將A環1，2位脫氫酶基因(KsdD)連接在質粒pXJM19上構建出重組表達質粒後，將此重組質粒PXJM19- KsdD電轉進簡單節桿菌，經篩選得到一株高效用於甾體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌株，實現了 A環1，2位脫氫酶在出發菌中的高水平游離表達。此外，該質粒能在簡單節桿菌中具有良好的遺傳穩定性，且能高效穩定地表達A環1，2位脫氫酶基因。構建的工程菌在含有酵母提取物、磷酸鹽、玉米漿和葡萄糖等營養成分的基礎上，通過恆溫通氣攪拌發酵，在留體化合物濃度不高於7%(m/V)時，採用一次加投甾體化合物底物，在40飛0小時內生物脫氫轉化率能夠達到90%以上；在留體化合物濃度高於7%時，採用連續補加留體化合物底物的情況下，在55飛5小時內生物脫氫轉化率能夠達到95%以上。與原始菌不同時間段轉化醋酸可的松能力的比較，重組菌最終轉化率提高了
11.5 %。
權利要求
1.一種能在簡單節桿菌(Arthrobacter Simplex)中複製並表達留體類化合物A環1，2位脫氫酶基因的質粒的構建方法，其特徵在於:具體步驟如下: ⑴以簡單節桿菌基因組為模板進行PCR，所需要的引物如下:P3:5/ - CCGGAATTC ATGGACTGGGCAGAGGAGTA-3' EcoRI ； P4:5/ - CCCAAGCT TCATCGCGCGTCCTCGG-3' HindIII ； 反應體系為50 μ L,配比如下:
2.如權利要求1所述的構建方法構建得到的質粒在構建高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於:所述的構建高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌的步驟如下: 將凍存的簡單節桿菌感受態細胞在冰上溶化後，取按感受態細胞:質料μ L:ng為1:3的比例加入質粒pXJM19- ksdD,混合均勻，使用高壓脈衝電擊轉化電擊該細胞混合物，電擊參數設置為:15kV/cm，25 μ F，電脈衝結束後，迅速將細胞懸液轉移到室溫復甦培養基中，振蕩培養疒9 h，復甦培養基連續稀釋後取150 μ L塗布於含40 yg/mL氯黴素的LB瓊脂平板上，在培養箱培養24-30小時，在抗性板上長出的菌落，即為高效表達留體化合物A環1，2位脫氫的簡單節桿菌工程菌。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於:所述的復甦培養基的配方如下:含有濃度為10-15 mg/mL山梨醇的LB培養基。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於:所述的簡單節桿菌工程菌在一次性投料的生物轉化方 面中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種能在簡單節桿菌(Arthrobacter Simplex)中複製並高效表達甾體類化合物A環1,2位脫氫酶基因的質粒在構建高效表達甾體化合物A環1,2位脫氫的簡單節桿菌工程菌中的應用。本發明質粒能在簡單節桿菌裡複製並且高效表達甾體類化合物A環1,2位脫氫酶基因，本發明質粒為進一步利用質粒pXJM19通過分子手段改良簡單節桿菌提供了依據，具有重要的實用意義。
文檔編號C12N15/66GK103205450SQ20131008087
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月14日 優先權日2013年3月14日
發明者路福平, 田耀, 張會圖, 劉曉光 申請人:天津科技大學