一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列及其應用的製作方法

2023-06-10 02:44:26

專利名稱：：一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬於生物防治
技術領域：
，特別是涉及一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列及其應用。
背景技術：
：蟲害是世界農作物減產的一個重要因素，平均每年因此損失糧食總產量的10%，直接經濟損失達數十億美元。我國水稻、玉米和棉花的種植面積分別為2837萬、2544萬、569萬公頃(2006，中國農業信息網)，主要的害蟲有水稻螟蟲、玉米螟蟲和棉鈴蟲等，嚴重威脅著這些重要的糧食和經濟作物的安全生產。過去幾十年的防治主要依賴化學農藥，在為農業生產做出巨大貢獻的同時，化學農藥卻造成了環境汙染、人畜中毒、生態失衡等嚴重後果。在這些巨大的代價面前，全球都在尋找和開闢新的病蟲害防治策略和技術。蘇雲金芽胞桿菌(^"ci//^/mn'"g/em^簡稱Bt)是一種分布極其廣泛的革蘭氏陽性細菌。它在形成芽胞的同時，能產生蛋白性質的伴胞晶體(parasporalcrystal),對鱗翅目(Lepid叩tera)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、直翅目(Orthoptera)、食毛目(Mallophaga)等多種昆蟲，以及線蟲、蟎類和原生動物具有特異性的殺蟲活性(Schnepf,E.etal.，1998，Mz'croWo/.爿"dMo/ecw/flr及'o/ogyieWew，62(3):775-806)。這種殺蟲晶體蛋白(InsecticidalCrystalProteins,ICPs)又稱5-內毒素(Delta-endotoxin)，在昆蟲中腸首先溶解，成為原毒素，之後被腸道蛋白酶降解為具有專一活性的毒素，與中腸上特異的受體進行結合(Craig，2007，M/cra&o/.Mo/.歷o/.71(2):255-281)，導致對人畜無害，不汙染環境，因而Bt在害蟲的生物防治中得到了廣泛應用。目前人們己經克隆了415多種編碼殺蟲晶體蛋白的Bt殺蟲基因，它們分屬180種模式基因(可參見http:〃www.biols.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/list,html)。1987年，Vaeck等人首次將Bt殺蟲晶體蛋白基因轉入菸草，開創了人類利用轉基因技術防治害蟲的先河(Vaeck，etal,1987，iVa加re,328:33-37)。但是在轉基因研究中人們發現將來源於Bt的殺蟲蛋白基因直接轉入植物，存在著表達產物不穩定、表達量少的缺陷(vanAarssen，etal，1995，P/a"fMo/編，28:513-524)。具體問題包括1)天然Bt基因高含AT，超過60%，在植物體內這樣的基因表達的mRNA極易被植物降解；2)天然Bt基因中存在類似真核基因的內含子切點、轉錄終止子序列，從而造成轉錄不完整、mRNA異常剪切等；3)天然Bt基因中使用的密碼子與植物存在較大差異，會造成蛋白翻譯效率降低；4)天然Bt基因作為原核生物來源的基因，其結構與植物等真核生物差異顯著，如真核生物含有5'-UTR序列，3'末端的polyA尾序列。因此，這些關鍵問題的解決是實現Bt基因在植物中高效、穩定表達的重要保證。隨著這些技術的改進和完善，自1996年來的十二年內，轉基因抗蟲玉米、馬鈴薯、水稻等作物相繼研製成功，並逐步進入應用階段(JamesC，ISAAABriefs,2007)。中國農業科學院植物保護研究所獲得的co;L^基因(國家發明專利ZL20041000998.9)，對棉鈴蟲、小菜蛾、玉米螟、水稻二化螟等重要的鱗翅目害蟲具有高毒力。本發明對該基因進行了密碼子優化，這樣一方面使改造的基因在常見作物中能高效穩定表達，增強殺蟲效果，獲得實用性更強的轉基因抗蟲植物；另一方面將豐富轉基因抗蟲植物中殺蟲基因的種類，增強國際競爭力。
發明內容針對上述領域的不足，本發明提供一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，利用植物偏好的密碼子序列對，使co;L^基因的表達量增多，提高轉基因植物的抗蟲能力。一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，其特徵在於編碼區具有與SeqNo.2相似性達81%，且與SeqNo.2編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。所述具有的核苷酸序列如SeqNo.3所示。所述人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，如SeqNo.4所示。所述具有的核苷酸序列與SeqNo.3相似性為93%，且與SeqNo.3編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。所述具有的核苷酸序列如SeqNo.7所示。所述人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，如SeqNo.5所示。包含上述基因序列的植物表達載體。所述植物表達載體為pUbi-mAh，其結構如圖1所示。所述植物表達載體為pCAMBIASlAh,其結構如圖3所示。所述植物表達載體為pCAMBIAUbi-mrAh，其結構如圖5所示。上述植物表達載體的應用。所述應用是指將pUbi-mAh轉化到玉米中，所述轉化指基因槍法、花粉管通道法。所述應用是指將pCAMBIASlAh轉化菸草和甘藍，所述轉化指農桿菌介導的遺傳轉化。所述應用指將pCAMBIAUbi-mrAh轉化水稻。一種轉基因植物，其特徵在於該植物轉化的外源基因為上述任一基因序列。一種轉基因微生物，其特徵在於該微生物轉化的外源基因為上述任一基因序列。所述轉基因植物在表達具有SeqNo.l所示胺基酸序列的對鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應用。所述轉基因微生物在表達具有S叫No.l所示胺基酸序列的對鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應用。本發明根據CrylAh的胺基酸序列(SEQNO.l)，在保證胺基酸序列不變的前提下，首先採用植物偏好的密碼子對07L4/z基因的l-2001bp的序列(SEQN0.2)進行人工優化改造，剔除植物稀有密碼子，並調整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近(表l)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，並去除了髮夾結構和常用限制性酶切位點，為了在起始密碼子處形成一個WcoI(CCATGG)，在第一個起始密碼子後加入了一個胺基酸(甘氨酸，GGA)，得到人工改造的基因序列，如SEQN0.3所示，該序列與crj;L4/1基因l-2001bp的同源性為86.18%(圖21)，而G+C含量由原來的37%提高到了48%，此人工改造的基因序列能更高效穩定地在大多數植物中表達。在上述人工改造的基因序列的5'端添加了如SeqNo.6所示的Q序列和Kozak序歹ij(GallieDRetal，1987，iVwc/e/cA7'A及^，15:3257-3273;KozakM，1984，A^c/e/c爿"論i^，12(2):857-872)，Q序列是衍生於植物病毒衣殼蛋白質基因編碼區的翻譯增強序列，(Richardsetal,五^J歷oc/^w1987,84:513-519)。Kozak序列是促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的編碼核糖體結合蛋白質的序列(Kozaketal，Wwc/ez'c爿ci^i^1984,12:857-872)，能提高wo^L^基因在普通植物中的表達水平，在3'端添加了polyA序列(MunroeD，1990，il必/Ce〃祝o/,10:3441-3455)，並設計了幾個連續的終止密碼子，以確保翻譯的準確終止，然後在3'端與5'端分別引入了S"mHI和K/wI位點，以便於後續克隆，最終確定本發明人工設計的Btcr少L4/基因序列即wctjL4/基因，如SEQN0.4所示。對本發明根據水稻基因的密碼子偏好性與其它植物的密碼子偏好性有一定的差異，及CrylAh的胺基酸序列(SEQNO.l)，保證胺基酸序列不變的前提下，在本發明SEQN0.3的序列基礎上進一歩改造，採用水稻偏好的密碼子對SEQN0.3的序列進行人工優化改造。調整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與水稻中的使用頻率接近(表2)，得到適合於在水稻中高效表達的改造基因序列，如SEQN0.7所示，為了後續基因操作方便，在人工合成的基因兩邊加上了適當的酶切位點，最後確定進一步改造的mcr;;L^基因即,c77/屈基因的核苷酸序列，如SEQN0.5所示。本步驟中改造得到2001bp序列SEQIDNO.7與SEQN0.3的相似性為93。/。(圖23)，是在SEQN0.3基礎上稍微的改動，與c7"/2基因SEQIDN02相似性只有81%(圖22),而G+C含量由原來的37%提高到了51%，但保證了其編碼的胺基酸不變的情況下使其在水稻中能更高效率地表達。將本發明人工設計的基因序列進行人工合成並插入到合適的克隆載體中，獲得植物表達載體。將本發明中獲得的基因序列即wctjL^基因克隆到質粒骨架pGEM-7Zf(+)(為常用質粒，可在美國Promega公司購買到)中得到植物表達載體pUbi-mAh(圖l)，該載體的多克隆位點中連有啟動子序列為玉米泛素蛋白ubiquitin啟動子，和NOS終止子，及moyL4/2基因，該質粒可以通過直接轉化法轉化植物，在植物中表達外源基因。用於驅動基因表達的啟動子並不限於ubiqiiitin啟動子，可以是來源於水稻的actin啟動子、來源於花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子等。為了在轉化玉米中利於將轉基因愈傷組織篩選出來，可在該載體種連入抗生素篩選基因，本發明在pUbi-mAh連入潮黴素篩選基因，構建得到pUbi-mAh-hpt質粒。篩選標記基因不限於潮黴素篩選標記基因，可以選擇來自土壤吸水鏈黴菌(5^印Mw少c^/y^myco^o^的kw基因和來自S.討n'cfoc/zrawog柳ey的基因，也可以選擇耐草甘膦的編碼EPSP合酶的ara^基因。通過如圖3所示的流程構建了含有本發明的wcr;;"/2基因的表達載體pCAMBIASlAh，該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農桿菌中表達，可以通過農桿菌轉化植物，在植物中表達外源基因。將本發明獲得的mrcr;;L^基因按照圖5所示的步驟構建，得到植物表達載體pCAMBIAUbi-mrAh，該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農桿菌中表達，通過農桿菌轉化植物，特別是適合於在水稻中表達/wro^4/7基因。將包含本發明人工合成的基因序列的植物表達載體，應用到植物轉基因工程中，使植物獲得對鞘翅目害蟲的抗性，從而達到植物保護的目的。將本發明中的植物表達載體pUbi-mAh基因槍法和花粉管通道法，轉化到玉米中，對獲得的陽性轉基因玉米植株接種玉米螟，結果表明，在檢測的175株陽性植株中有60株表現抗性，按照國際玉米螟協作組制定的九級分類標準，此60株的抗性皆為1級或者2級(圖10);將植物表達載體pCAMBIASlAh通過農桿菌介導轉化到菸草，對菸草陽性植株的葉片接種棉鈴蟲，由於mco;L4/7基因表達的BtCrylAh的毒害作用，陽性被測植株都表現了較高的殺蟲毒性(圖14)，棉鈴蟲的矯正死亡率在90%以上。轉化得到的甘藍也同樣明顯獲得抗性(圖15)。將pCAMBIAUbi-mrAh通過農桿菌介導轉化水稻，將對獲得的轉基因水稻在田間人工接蟲，用毛筆輕輕蘸取二齡二化螟，接種於分櫱期水稻葉片，每株接二化螟50頭，一月後觀察結果。轉基因水稻的對二化螟的殺蟲效果見圖20，轉基因水稻對二化螟有抗蟲性，而非轉基因水稻被二化螟為害，有些植株已經枯死。將含有本發明中獲得的基因序列的重組質粒轉化大腸桿菌，結果顯示附07"/基因在能夠在大腸桿菌中表達。並對提取出的蛋白進行生物活性測定，結果表明，moyL^基因表達的蛋白對小菜蛾與棉鈴蟲均有較高的致死效應(表3)。mrcr;;L^基因表達的蛋白對水稻二化螟有較高的致死效應(表4)。因此可利用轉化了本發明的改造基因的微生物生產對鱗翅目害蟲有毒力的蛋白，由於本發明的改造基因在植物中能高效表達，因此也可利用轉該基因的植物生產對鱗翅目害蟲有毒力的蛋白，這些毒力蛋白可以應用於生產中的害蟲防治。本發明通過對cT7L4/z基因的人工改造，使該基因更適於在植物中表達，將本發明獲得的基因序列建植物表達載體，轉化各種農作物，可以提高玉米、棉花、水稻、蔬菜、林木等植物抗對鱗翅目害蟲的能力。圖說明圖1為pUbi-mAh質粒構建圖。圖2為質粒pUbi-mAh酶切鑑定圖，M為X/歷力din+五coRImarker,從上到下依次為21227，5148，4973，4268，3530，2027，1904，1584，1375，947，831，564bp;泳道1和泳道3為未酶切的pUbi-mAh載體；泳道2為5awHI+A:/7"I酶切pUmG2質粒回收後的載體片段；泳道4為5amHI+^pnl酶切驗證pUbi-mAh載體。圖3為pCAMBIASlAh質粒構建圖。圖4為pCAMBIASlAh質粒酶切鑑定圖，M為D15000+2000marker,從上到下依次為15000，10000，7500，5000，2500，2000，1000，750，500，250，100bp;泳道1為iZ/mffll/EcoRI酶切pCAMBIASlAh質粒；泳道2為Wol酶切pCAMBIASlAh質粒；泳道3為TVcoI酶切pCAMBIASlAh質粒。圖5為pCAMBIAUbi-mrAh質粒構建圖。圖6為pCAMBIAUbi-mrAh質粒酶切鑑定圖，泳道M為LamdaDNAAEco1301Marker,依次為19329，7743,6223,4254,3472,26卯，1882,1489，925,421，71bp;泳道1為///^/111酶切pCAMBIAUbi-mrAh質粒；泳道2為歷"dm+五coRI酶切pCAMBIAUbi-mrAh質粒。圖7pET-lAhp質粒酶切鑑定及PCR檢測圖，泳道M為LamdaDNA/五co1301Marker,依次為19329，7743,6223,4254，3472,2690,1882,1489,925,421,71bp;泳道1為BamHI酶切pET-lAhp質粒；泳道2為SawHI+Sa/1酶切pET-lAhp質粒；泳道3為PCR檢測擴增的陽性條帶；泳道4為PCR檢測陰性對照。圖8mc7L4/在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE檢測圖，泳道l、2、3在上清表達的mCrylAh蛋白；泳道4為沉澱中表達的mCrylAh蛋白；泳道5為大分子量蛋白Marker,從上到下依次為200、116、97.4、66.2、45kD。圖9為金標試紙條檢測結果，泳道l為陽性蛋白檢測結果；泳道2為非轉基因玉米蛋白檢測結果；泳道3-ll為轉基因玉米蛋白檢測結果。箭頭所指為陽性條帶。圖10為玉米植株生物活性檢測結果，A為轉基因玉米植株接蟲20天後結果；B為非轉基因植株接蟲20天後結果；C為轉基因植株接蟲40天後結果；D為非轉基因植株接蟲40天後結果。圖11為轉基因玉米的PCR檢測結果，泳道l為100bpladder;泳道2為非轉基因陰性對照；泳道3為陽性對照泳道4-8為轉基因玉米樣品。圖12為轉基因玉米的Westernblot檢測結果，泳道l-6為轉基因玉米樣品；CK-為陰性對照；CK+為陽性對照圖13為轉wojL4/2基因抗蟲菸草的PCR檢測結果，泳道M為500bpLadder,從上到下依次為2000，1000，卯0，800，700，600，500，400，300，200bp;泳道1為陰性對照；泳道2為陽性對照；泳道3-11為轉化菸草植株。圖14為轉基因菸草的抗蟲性檢測結果，左圖非轉化植株，右圖轉基因植株圖15為獲得的轉化甘藍植株，左上具柄子葉，左下由具柄子葉獲得的轉化植株；右上下胚軸，右下由下胚軸獲得的轉化植株圖16轉化甘藍的PCR檢測結果，泳道M為DNAMarker,從上到下一次為900，800，700，600，500bp;泳道N為陰性對照；泳道P為陽性對照；泳道1-10為轉化甘藍植株。圖17轉基因甘藍的金標試紙條檢測結果。圖18轉wc77L4/z基因水稻的PCR檢測結果，泳道M為LamdaDNA/Eco1301Marker,依次為19329，7743,6223，4254,3472,2690,1882，1489,925，421,71bp;泳道1、CK為陰性對照；泳道2為陽性對照；泳道3-13為轉化水稻植株。圖19轉ww7L4/2基因水稻的Westernblot檢!則結果，泳道P為陽性對照；泳道CK為陰性對照；泳道l-4為轉基因水稻植株。圖20轉基因水稻對水稻二化螟的生物活性檢測結果。圖21SeqNo.2與SeqNo.3相似性比對圖。圖22SeqNo.2與SeqNo.7相似性比對圖。圖23SeqNo.3與SeqNo.7相似性比對圖。具體實施方法實施例l用於普通植物轉化的cij!4/i基因的改造合成本發明根據c/^L4/;基因(中國專利，專利號200410009918.9)的胺基酸序列(SEQNO.l)，在保證胺基酸序列不變的前提下，首先採用植物優化密碼子對co;L4A基因的l-2001bp序列(SEQN0.2)進行人工優化改造。儘量避免使用植物稀有密碼子，並調整了密碼子的使用頻率(表l)，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與植物中的使用頻率接近(表l)。在此基礎上，去除DNA序列中存在的典型的造成植物基因轉錄本不穩定的富含AT序列，並去除了髮夾結構和常用限制性酶切位點，為了在起始密碼子處形成一個(CCATGG),在第一個起始密碼子後加入了一個胺基酸(甘氨酸，GGA)，得到核苷酸序列為SEQN0.3。該序列與cryL^基因同源性只有86.18%，而G+C含量由原來的37%提高到了48%。密碼子在植物、c^"/基因和/nc/7/^z基因中的使用頻率見表1。除了上述發明的殺蟲蛋白質CrylAh的DNA編碼序列外，為了提高該序列在受體生物中的表達水平，在其5'端添加了Q序列和Kozak序列，如SeqNo.6。Q序列是衍生於植物病毒衣殼蛋白質基因編碼區的翻譯增強序列，Q序列由68bp組成，富集TTAAC序列，5，端有一個UAUUUUUACAACAA序列以及4個UUAC序列，這些序列在蛋白質合成的翻譯過程中構成核糖體和rRNA結合位點(Richardsetal，￡wJ歷oc/zew1987,84:513-519)。Kozak序列是促進外源基因在植物細胞內翻譯過程的編碼核糖體結合蛋'白質的序列(Kozaketal，M^/e/c^"&i^1984，12:857-872)。另外，在編碼序列3'端設計了幾個連續的終止密碼子，以確保翻譯的準確終止。為了克隆方便，在上述序列兩端引入分別引入了5a柳HI和A:;wI，最終確定人工設計基因mc^L4/2基因，如SEQN0.4所示。化學合成SEQN0.4序列，並克隆到常用T-載體pTeasy上，獲得質粒pTeasy-mcrylAh。表l密碼子在植物、蘇雲金芽孢桿菌和改造基因中的使用頻率比較formulaseeoriginaldocumentpage9tableseeoriginaldocumentpage10tableseeoriginaldocumentpage11實施例2、用於水稻轉化的co^4A基因的改造合成本發明根據水稻基因的密碼子偏好性對mcT_yL^基因進行了植物用密碼子優化。根據ma7L4/基因的胺基酸序列(SEQN0.3)，在保證胺基酸序列不變的前提下，採用水稻偏好密碼子對SEQN0.3進行人工優化改造。調整密碼子的使用頻率，使CrylAh蛋白的密碼子使用頻率與水稻基因的使用頻率接近。最後確定進一步改造的mcr;;L4/2基因即mroy"/基因的核苷酸序列為SEQIDNO.7所示，為了後續基因操作方便，在人工合成的基因兩邊加上了SawHI位點。最後確定進一步改造的mcr;;L^基因即7wro;L4/2基因的核苷酸序列，如SEQN0.5所示。SEQN0.7與SEQN0.2同源性只有81%,而G+C含量由原來的37%提高到了51%。密碼子在普通植物、在普通栽培稻、在秈稻和/wro;L4/1基因中的使用頻率見表2。twwjM;基因克隆到常用T-載體pTeasy上，獲得質粒pTeasy-mrcrylAh。表2密碼子在普通植物、水稻和改造基因中的使用頻率比較tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13實施例3、附co^4A基因及附/r/j」L4A基因在大腸桿菌中的表達以pTeasy-mcrylAh質粒為摸板，用特異性引物擴增2Kb的PCR產物，回收純化，用^附HI、S"/I消化後，與同樣處理的pET-21b質粒(常用質粒，可以在大腸桿菌中誘導表達外源基因，可以在Novagen公司購買)連接，轉化co//JM110，通過酶切分析及PCR鑑定(圖7)，篩選出陽性重組子，把所獲得的重組表達載體質粒命名為pET-lAhp。將重組質粒pET-lAhp轉化到大腸桿菌BL21中，150rpm，18'C誘導目的蛋白表達，超聲破碎，離心，分別取上清與沉澱進行SDS-PAGE(8%)分析(圖8)。wc7;y"/1基因能夠在大腸桿菌中表達。同樣的步驟使wrcr;;L4/2基因在大腸桿菌中表達。實施例4、mCrylAh蛋白生物活性的測定(1)對小菜蛾(i3x_y/oWe//a)的室內殺蟲活性測定蛋白用無菌水稀釋，用清水作為陰性對照。將新鮮甘藍葉片清洗，晾乾；分別在蛋白液中浸潤10s，取出，晾乾，放入廣口瓶中(每片葉柄裹無菌水浸溼的脫脂棉進行葉片保鮮)；每瓶接蟲20頭(每個處理20頭蟲，三次重複)，蟲齡23齡。放入25。C光照培養箱培養，分別於72hrs後進行調查。(2)對棉鈴蟲(//.flrw&era)的室內殺蟲活性測定稱取IOg人工飼料置於滅菌培養皿中，加入lml待測樣品稀釋液，充分混勻，分裝於經消毒(5%福馬林浸泡)的24孔細胞培養板中。用毛筆輕輕接入棉鈴蟲1-2齡幼蟲，每孔一頭，每處理重複三次，放置25'C光照培養箱中，培養七天調査死、活蟲數。生物活性測定結果見表3。表3mCrylAh蛋白生物活性測定結果tableseeoriginaldocumentpage13實施例5、用於水稻轉化的附rc77L^基因表達產物殺蟲活性測定水稻二化螟室內殺蟲活性測定稱取30克人工飼料放置於培養皿中，分別加入1ml不同含量的待測樣品(m^L4/z基因在大腸桿菌的表達產物)，充分混勻，分裝於經滅菌的試管當中，用毛筆輕輕接入初孵幼蟲，每管10頭，每次重複5次，放置25。C光照培養箱中，96小時調查結果，計算LC50。表4mrCiylAh蛋白對水稻二化螟殺蟲結果tableseeoriginaldocumentpage14實施例6、轉化玉米植物表達載體的構建用5awffl和酶切質粒實施例1中獲得的pTeasy-mcrylAh(中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存)回收2.0Kb片段，用同樣的內切酶酶切質粒pUmG2(中國農業科學院生物技術研究所農業微生物基因工程實驗室保存)，回收5.4Kb片段，連接，構建完成質粒pUbi-mAh，質粒構建圖見圖l，質粒酶切鑑定圖見圖2。質粒pUmG2的結構描述如下質粒骨架為pGEM-7Zf(+)(該質粒為常用質粒，可在美國Promega公司購買到)，多克隆位點中連有啟動子序列為玉米泛素蛋白ubiquitin啟動子(ChristensenAHetal，1992，Pto加Mo/別o/，18(4):675-89)，mG2基因和《os終止子；質粒pUbi-mAh的結構描述如下質粒骨架為pGEM-7Zf(+)(該質粒為常用質粒，可在美國Promega公司購買到)，多克隆位點中連有啟動子序列為玉米泛素蛋白ubiquitin啟動子(ChristensenAHetal，1992，戶/aWM0/歷0/，18(4):675-89)，本發明獲得的may"h基因和mw終止子，該質粒可以在植物中表達外源基因。用於驅動基因表達的啟動子並不限於ubiquitin啟動子，可以是來源於水稻的actin啟動子、來源於花椰菜花葉病毒的CaMV35S啟動子等。為了在轉化玉米中利於將轉基因愈傷組織篩選出來，利用/f/MdlII酶切質粒p-Hyg(含有表達潮黴素磷酸轉移酶基因，對潮黴素有抗性，該質粒在中國農業科學院生物技術研究所保存)，連入用同樣酶切的質粒pUbi-mAh，構建得到pUbi-mAh-hpt質粒。作為篩選標記基因的不限於潮黴素篩選標記基因，可以選擇來自土壤吸水鏈黴菌CSfrepto附yc"/ygrascop/cM9的Zw基因禾口來自S.v/n'ctoc/y-o附oge"ay的p欲基因，也可以選擇耐草甘膦的編碼EPSP合酶的wo4基因。實施例7、花粉管通道轉化玉米和轉基因植株篩選玉米轉化用花粉管通道法(周光宇.從生物學角度探討遠緣雜交的理論.1987，11(2):16-20)。大量提取質粒pUi-mAh，質粒DNA提取採用QiagenPlasmidKit(tip-100)試劑盒，方法同試劑盒說明書。在玉米授粉前一天對玉米雄穗和雌穗套袋隔離，授粉時，收集雄穗的花粉，均勻的散布於雌穗花絲上，套好紙袋，並在植株上掛上標記牌，詳細標明玉米品種、授粉方式、授粉時間等信息。於授粉後1620h左右進行花粉管導入，DNA濃度為150250ng4iL，每穗滴入約200nLDNA，即每穗DNA滴注量為3050嗎；重新套好紙袋，並在標記牌上詳細標明導入時間、導入基因種類與濃度、總計導入量等信息；待導入玉米穗自然結實後收穫；於次年播種檢測。田間播種花粉管轉化的玉米種子，待植株生長到4-5葉期，取適量玉米葉片，提取葉片蛋白，用BT-CrylAb/Ac金標免疫檢測試劑盒檢測葉片蛋白，轉基因植株會顯現陽性條帶(圖9)，轉基因植株佔檢測植株的1.8%。實施例8、基因槍轉化玉米剝離授粉後1012天的玉米幼胚，在含有24mg/L2，4-D的N6培養基上誘導胚性愈傷組織。取狀態良好繼代培養的胚性愈傷組織，放入含有N6培養基的直徑6cm的培養皿中，用由金粉包裹質粒的子彈進行轟擊，每皿轟擊一次。子彈的處理方法取50^1金粉懸浮液放入500pl離心管中，加入5pl質粒DNA溶液(l叫/ul)，混勻後加入5pl2.5MCaCl2溶液和20^10.1M的亞精胺,在室溫下放置10分鐘，短暫離心，棄去上清，重懸於70°/。乙醇，低速Vortex,保持懸浮狀態。待轟擊後的玉米材料暗培養過夜，然後轉移到N6培養基，然後轉移到含有20mg/L潮黴素的N6培養基含(2mg/L2，4-D)上進行篩選。2~3周後選擇能夠正常生長的愈傷組織轉移到20mg/L潮黴素的N6培養基含(2mg/L2，4-D)上繼續篩選。將抗性愈傷組織轉入含有60g/L蔗糖的N6培養基(含減半的2，4-D)上，培養兩周，誘導形成胚狀體。將發育好的胚狀體轉移到不含激素的N6培養基上萌發生長。當小植株長到l~2cm長時，轉移到三角瓶中繼續培養。34葉期且根系發達時，將小苗移入小花盆，外罩塑膠袋保溫保溼，移入溫室栽培5-7天，去掉塑膠袋後，再培養一周，移入大花盆，直至開花結實。實施例9、轉化植株的生物活性檢測和分子檢測待轉基因植株種植長到七八葉期時，人工接蟲玉米螟將即將孵化的玉米螟卵接種到玉米的心葉中和葉腋處，接蟲量在100頭左右，5天後第二次接蟲，接蟲量同第一次，20天後統計玉米為害情況。通過生物活性檢測結果表明，在檢測的175株陽性植株有60株植株表現高抗，按國際玉米螟協作組制定的九級分類標準，60株植株均為1級或2級(圖IO)。提取抗性玉米的基因組DNA，取l嗎基因組DNA做模板，引物序列如下1Ahl:5'-GACTTGACCGAAGGCATTAGC-3'1Ah2:5'-TTGTTGTTCTGTGGTGGGATC-3'PCR擴增的反應條件為94°C，5分鐘，l個循環；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個循環，電泳結果如圖ll所示。提取玉米的葉片可溶性蛋白，50嗎蛋白10%SDS-PAGE電泳，將電泳轉移至PVDF膜上，轉化方法參見Bio-Rad說明書，用3%BSA封閉，用h1000的CrylAh蛋白的多克隆抗體作為一抗，用鹼性磷酸酶標記的二抗以1:10000(Sigma公司購買)雜交，顯色後可見轉基因植株有陽性條帶，證明BtCrylAh蛋白在玉米中表達(圖12)。利用基因槍轉化玉米，獲得轉基因抗蟲玉米的轉化率為1.5%。實施例10、轉mcijL4A基因抗蟲菸草的獲得首先構建植物表達載體，載體骨架是雙元載體pCAMBIA2301(該質粒為常用質粒，CAMBIA機構可以提供)，基因的表達盒由CaMV35S啟動子、本發明獲得的wtrj;L4/z基因和NOS終止子(一段DNA序列，含有基因表達的終止信號)。最終得到質粒命名為pCAMBIASlAh。對質粒進行酶切鑑定，結果如圖3所示；構建圖譜見圖4。構建步驟用歷"dIII、五coRI雙酶切質粒pUC19(該載體為常用載體，可在美國Promega公司購買到)和pBI121(該載體為常用載體，GenBank登錄號為AF485783。見ChenPY,etal，2003，Mol.Breed,11:287-293.。申請人的生物實驗室可向公眾發放)，將pBI121上的組成型表達啟動子CaMV35S、GUS基因和NOS終止子連接到pUC19上，構成pUC19-SGN。用5"mHI、￡coRI酶切pUC19-SGN，回收大片段，同時用BamHI、￡coRI酶切實施例6中獲得的載體pUbi-mAh，回收wc^L4/2基因和NOS終止子，約2.4kb的片段。兩個片段進行連接，構建成載體pUCSlAh。然後用歷"dIII、五coRI雙酶切質粒pCAMBIA2301(該質粒為常用質粒，CAMBIA機構可以提供)回收大片段，同時州'"dIII、￡coRI雙酶切質粒pUCSlAh，回收約3.1kb的片段，將兩個片段連接，可以得到載體pCAMBIASlAh(圖3)，質粒酶切鑑定結果見圖4。該載體為雙元載體，可以在大腸桿菌和農桿菌中表達，可以通過農桿菌轉化植物，在植物中表達外源基因。採用凍融直接轉化法，將構建好的質粒pCAMBIASlAh轉入根癌農桿菌LBA4404。轉化子在卡那黴素100pg/ml和鏈黴素125pg/ml的雙抗性YEB培養基的平板上篩選。隨機選取轉化得到的克隆，少量提取質粒DNA進行PCR擴增驗證，證明質粒已轉入農桿菌。菸草轉化採用葉盤法(HorschRB，1986，ProcNatlAcadSciUSA.83(8):2571-5)，轉化外植體取培養的菸草無菌苗頂部幼嫩葉片。共培養三天後，轉至分化培養基(MS培養基+I00pg/mlKn+50(^g/mlCb+3mg/ml6-BA+0.2mg/mlNAA)進行見光分化，2周後，在葉片邊緣有綠色愈傷點出現，而大部分轉化體則可以直接分化出抗性芽，抗性芽長到2-3cm時，移至生根培養基(MS培養基+100嗎/mlKn+500ng/mlCb)生根，約2周後可生出細嫩小根，逐漸成苗。提取轉化菸草的基因組DNA，取1嗎基因組DNA做模板，引物序列如下AHF:5'-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCCAH2R1:5'-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGTPCR擴增的反應條件為94°C，7分鐘，1個循環；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個循環，電泳結果如圖13所示。轉基因菸草佔轉化菸草的陽性率為26%。選取七葉期菸草的第二、第三、第四片葉子作為生測對象；將脫脂棉球把葉柄包裹，置於放有滅過菌濾紙的平皿中，並滴加ddH2O50(HU於棉球上；接蟲初孵棉鈴蟲ll頭接於每片葉片上；實驗共選三株進行檢測，每株選取三片葉子，各三個重複)。編號封口，將平皿放於鋪有溼紗布的筐中，並將四周蓋上溼紗布，置於28'C培養室中；每天注意觀察，保持紗布溼度和室內溫度；三天後統計試蟲死亡數，計算死亡率。圖14即為接蟲後三天的結果，可以看出非轉化植株葉片已造成許多缺刻，還可以看到試蟲的糞便，而轉基因植株葉片在被咬成小空洞之後，由於BtCrylAh的毒害作用，試蟲死亡，可以看到幼蟲的屍體。對各樣品的死蟲數進行了統計，並計算得出了各個樣品的對照死亡率，各個樣品都表現出了較高的殺蟲毒性，校正死亡率在卯％以上。實施例11、轉柳c/jL4A基因抗蟲甘藍的獲得採用直接凍融轉化法，將構建好的質粒pCAMBIASlAh轉入根癌農桿菌LBA4404。轉化子在卡那黴素100pg/ml和鏈黴素125pg/ml的雙抗性YEB培養基的平板上篩選。隨機選取轉化得到的克隆，少量提取質粒DNA進行PCR擴增驗證，證明質粒已轉入農桿菌。甘藍轉化採用下胚軸和具柄子葉作為轉化外植體，轉化方法見文獻(張七仙等，2001，農業生物技術學報，9(1):72-76)。共培養2天後，轉至篩選培養基(MS培養基+10(Hig/LKn+500昭/LCb+0.02mg/LNAA+0.2mg/L2，4一D)進行篩選，10d後轉入分化培養基，見光分化，2周後，在葉片邊緣有綠色愈傷點出現，而大部分轉化體則可以直接分化出抗性芽，抗性芽長到2-3cm時，移至生根培養基(MS培養基+100嗎/LKn+500昭/LCb+0.15mg/LNAA+20mg/Lsugar)生根，約2周後可生出細嫩小根，逐漸成苗(圖15)。提取轉化甘藍的基因組DNA，取1嗎基因組DNA做模板，引物序列如下AHF:5'-GCTCTAGAGCCATCGATTGAGCCATGTTTCCAH2R1:5'-GTCAAAATTCAACAGCTGATCAATGTGGTAGTCAGTPCR擴增的反應條件為94°C，7分鐘，1個循環；94°C，1分鐘，56°C，1分鐘，72°C，2分鐘，30個循環，電泳結果如圖16所示。取適量甘藍葉片，提取葉片蛋白，用BT-CrylAb/Ac金標免疫檢測試劑盒檢測葉片蛋白，轉基因植株會顯現陽性條帶(圖17)。檢測結果顯示甘藍的平均轉化率為1.5%。實施例12、轉mre/^L4A基因抗蟲水稻的獲得用fi，HI酶切質粒實施例2中獲得的pT-mrcrylAh(中國農業科學院植物保護研究所生物技術組保存，含有SEQNO.5序列的mrcrylAh基因)，回收2.0Kb片段，用Klenow酶補平，用S側HI和《;wl酶切質粒pUbi-mAh(本專利中質粒，中國農業科學院生物技術研究所農業微生物基因工程實驗室保存)，回收5.4Kb片段，用Klenow酶補平，兩個片段連接，構建完成質粒pUbi-mrAh。然後用歷"dIII、五coRI雙酶切質粒pCAMBIA3301(該質粒為常用質粒，CAMBIA機構可以提供)回收大片段，同時預"din、feoRl雙酶切質粒pUbi-mrAh，回收約4.4kb的片段，將兩個片段連接，可以得到載體pCAMBIAUbi-mrAh。質粒構建圖譜見圖5，質粒酶切鑑定結果見圖6。將含有pCAMBIAUbi-mrAh質粒的農桿菌克隆接種於含有卡那黴素100嗎/ml和鏈黴素125昭/ml的YEB液體培養基中，28'C振蕩培養至OD600為0.6-0.8，在4。C4000rpm離心10min，倒掉上清,沉澱用100ml的AAM培養液加lmlAS、52ul2，4-D、20ulKT懸浮，即為共培養轉化水稻用的農桿菌懸浮液；將胚性愈傷組織與農桿菌共培養20分鐘；取出水稻愈傷組織，用滅菌濾紙吸乾菌液，放置到鋪有一層濾紙的培養基中，26'C暗培養3天，3天後轉移至篩選培養基(25mg/LBasta)，26°C，光/暗=15小時/9小時，2周後，移至分化培養基，有綠色愈傷點出現，2周後，愈傷點分化成小植株，將小植株切下移至生根培養基生根，根部發育健壯後，移至花盆在土中繼續生長。提取轉化水稻的基因組DNA，取0.5嗎基因組DNA做模板，引物序列如下mrHF:5'-ATGAAGAACAGCATCAAACTCTCmrHR:5'-CGGTATCTGGTAGATGTGGACGGPCR擴增的反應條件為94°C，5分鐘，1個循環；94°C，1分鐘，56'C，1分鐘，72°C，1分鐘30秒，30個循環，PCR檢測結果見圖18。提取水稻葉片蛋白，30嗎蛋白10。/。SDS-PAGE電泳，將電泳轉移至PVDF膜上，轉化方法參見Bio-Rad說明書，用3。/。BSA封閉，用1:1000的Cry1Ah蛋白的多克隆抗體作為一抗，用鹼性磷酸酶標記的二抗以1:10000(Sigma公司購買)雜交，顯色後可見轉基因植株有陽性條帶，證明BtCrylAh蛋白在水稻中表達(圖19)。轉基因水稻的轉化率為1.91%。序列表SeqNO.1基因胺基酸序列1MKNSIKLSELWYFNERK麗FMEIVNNQNQCVPYNCLNNPEIEILEGGRISVGNTPIDIS61LSLTQFLLSEFVPGAGFVLGLIDL賜FVGPSQWDAFLAQVEQL職IAEAVR脂IQE121LEG臓VYRTYATAFAEWEKAPDDPELREALRTQFTATETYISGRISVLKIQTFEVQLLS181VFAQAANLHLSLLRDVVFFGQRWGFSTTTV隨YYNDLTEGISTHDYAVRWYNTGLERVW241GPDSRDWRYNQFRRELTLTVLDIVALFPNYDSRRYPIRTVSQLTREIYTNPVLENFDGS301FRGSAQGIERSIRSraLMDILNSITIYTDAHRGYYYWSGHQIMASPVGFSGPEFTFPLYG361TMGNAAPQQRIVAQLGQGVYRTLSSTFYRRPFNIGINNQQLSVLDGTEFAYGTSSNLPSA421VYRKSGTVDSLDEIPPQNNNVPPRQGFS冊LSHVSMFRSGSSSSVSIIRAPMFSWI冊SA481EFNNIIASDSITQIPAVKGNFLFNGSVISGPGFTGGDLVRLNSSG駆QNRGYIEVPIHF541PSTSTRYRVRVRYASVTPIHLN麗GNSSIFSNTVPATATSLDNLQSSDFGYFESANAFT601SSLGNIVGVRNFSGTAGVIIDRFEFIPVTATLEAEYNLERAQKAVNALFTSTNQLGLKTN661VTDYHIDQVSNLVTCLSDEFCLDEKRELSEKVKHAKRLSDE亂LQDSNFKDINRQPERG721WGGSTGITIQGVDDVFKENYVTLSGTFDECYPTYLYQKIDESKLKAFTRYQLRGYIEDSQ781DLEVYLIRYNAK冊TLNVPGTGSLWPLAVKSPIGRCGEPNRCA朋S冊FSLDIDVGCTDL841NEDLGVWVIFKIKTQDGHAKIGNLEFLEEKLLLGEALARVKKAE歸RDKREKLEWETNI901VYKEAKESVDALFVDSQYNRLQTDTN週I腸DKRV冊I服AYLPELSVIPGVNAAIFE961ELEGLIFTAFSLYDARNVIKNGDFNYGLSCWNVKGHVDVEEQNN冊SVLVIPE呢AEVSQ願EVRVCPGRGYILRVTAYKEGYGEGCVTIHEIEDNTDELKFSNCVEEEVYP麗VTCNDYT1081ATQEEYEGTYTSRNRGYDGAYESNSSVPADYASAY孤AYTDG服DNPCES跳YRDYTP1141LPAGYVTKELEYFPETDKVWIEIGETEGTFIVDSVELLLMEESeqNO.2基因的l-2001bp1ATGMAAACAGTATCAAATTATCAGAACTTTGGTATTTCAATGAA八GAAAATGGAGGTAT61TTTATGGAGATAGTGAATAATCAGMTCAATGCGTGCCTTATAATTGTTTGAATAATCCC121GAAATCGAAATATTAGAAGGCGGAAGAATATCAGTTGGTAATACCCCAATTGATATTTCT181CTTTCGCTTACTCAGTTTCTTTTGAGTGMTTTGTCCCAGGTGCGGGGTTTGTATTAGGA241TTAATTGATTTAATATGGGGATTTGTAGGTCCTTCCCAATGGGACGCATTTCTTGCTCAA301GTGGAACAGTTAATTMCCAAAGAATAGCAGMGCTGTAAGMATACAGCAATTCAGGAA361TTAGAGGGAATGGCACGGGTTTATAGAACCTATGCTACTGCTTTTGCTGAGTGGGAAAAA421GCTCCTGATGACCCAGAGCTAAGAGAAGCACTACGTACACAATTTACAGCAACTGAGACT481TATATAAGTGGAAGMTATCCGTTTTAAAAATTCAMCTTTTGAAGTACAGCTGTTATCA541GTGTTTGCCCMGCTGCAAATTTACATTTATCTTTATTAAGAGACGTTGTGTTTTTTGGG601CAAAGATGGGGTTTTTCAACGACAACCGTAAATAATTACTACAATGATTTAACAGAAGGG661ATTAGTACCTATACAGATTATGCTGTACGCTGGTACMTACGGGATTAGAACGTGTATGG721GGACCGGATTCTAGAGATTGGGTAAGGTATAATCAATTTAGAAGAGAATTAACACTMCT781GTATTAGATATCGTTGCTCTGTTCCCGAATTATGATAGTAGMGATATCCAATTCGMCA841GTTTCCCMTTAACMGAGAMTTTATACAAACCCAGTATTAGAAAATTTTGATGGTAGT901TTTCGAGGCTCGGCTCAGGGCATAGAAAGAAGTATTAGGAGTCCACATTTGATGGATATA961CTTMCAGTATAACCATCTATACGGATGCTCATAGGGGTTATTATTATTGGTCAGGGCAT廳CAAATAATGGCTTCTCCTGTCGGTTTTTCGGGGCCAGAATTCACGTTTCCGCTATATGGA1081ACCATGGGAAATGCAGCTCCACAACAACGTATTGTTGCTCAACTAGGTCAGGGCGTGTAT1141AGAACATTATCCTCTACTTTTTATAGAAGACCTTTTMTATAGGGATAAATAATCAACAA讓CTATCTGTTCTTGACGGGACAGAATTTGCTTATGGMCCTCCTCAMTTTGCCATCCGCT1261GTATACAGAAMAGCGGAACGGTAGATTCG1321GTGCCACCTAGGCAAGGATTTAGTCATCGA1381TCTAGTAGTAGTGTMGTATMTAAGAGCT1441GAATTTAATAATATAATTGCATCGGATAGT1501TTTCTTTTTAATGGTTCTGTAATTTCAGGA1561TTAMTAGTAGTGG楊TAACATTCAGAAT1621CCATCGACATCTACCAGATATCGAGTTCGT1681CTCAACGTTAATTGGGGTAATTCATCCATT1741TCATTAGATAATCTACAATCMGTGATTTT1801TCTTCATTAGGTAATATAGTAGGTGTTAGA1861GACAGATTTGAATTTATTCCAGTTACTGCA簡GCGCAGAAGGCGGTGAATGCGCTGTTTACG1981GTAACGGATTATCATATTGATSeqNO.3ww;;L4/z基因的改造區段1ATG^AAGAACAGCATCAAACTCTCAGAA61TACTTCATGGAGATAGTGAACAACCAGAATmCCCGAAATCGAGATCCTCGAAGGCGGAAGG181TCTCTTTCACTTACTCAGTTCCTTTTGAGC241GGCTTGATCGACTTGM"CTGGGGATTTGTA301CAAGTGGAGCAGTTGATCAACCAGAGGATC361GAACTTGAGGGAATGGCACGGGTTTACAGA421AAGGCTCCTGATGACCCAGAGCTTCGTGM481ACTTACATCAGTGGACGCATCTCCGTTCTC541TCAGTGTTTGCCCAAGCTGCCAACCTCCAC601GGTCAAAGATGGGGTTTCTCCACTACCACC661GGCATTAGCACCTACACCGACTATGCTGTT721TGGGGACCGGATTCTCGTGATTGGGTCAGG781ACTGTGTTGGACATCGTTGCTCTGTTTCCG841ACTGTTTCCCMCTCACACGTGAAATCTAC卯lAGTTTCCGAGGCTCAGCTCAGGGCATAGM961ATACTTAACAGCATCACCATCTATACCGAT1021CACCAAATCATGGCTTCTCCTGTCGGTTTC麵GGAACTATGGGAAATGCAGCTCCACAACAA1141TATAGAACCTTGTCCTCTACTTTCTACCGC1201CAACTCTCTGTTCTTGACGGGACAGAGTTT1261GCTGTGTACAGAAAMGCGGMCTGTAGAT1321AACGTGCCACCAAGGCAAGGCTTTAGCCAT1381GGCTCTAGTAGCAGTGTCAGCATCATAAGA1441GCTGAGTTCAACAACATCATTGCATCGGAT1501AACTTCCTTTTCAATGGTTCTGTCATTTCA1561AGATTGAACAGCAGTGGAAATAACATTCAG1621TTTCCATCCACATCTACCAGATACCGAGTT腿CACCTCAACGTCAACTGGGGTAATTCCTCC1741ACCTCCCTTGACAACCTACAATCTAGCGAC腿ACATCTTCACTTGGTAATATCGTTGGTGTT1861ATAGACAGATTCGAGTTCATTCCCGTTACTCTGGATG嵐TACCACCACAGAATAACMCTTAAGCCATGTTTCAATGTTTCGTTCAGGCCCTATGTTCTCTTGGATACATCGTAGTGCTATTACTCAAATCCCTGCAGTGAAGGGAMCCCAGGATTTACTGGTGGGGACTTAGTTAGAAGAGGGTATATTGAAGTTCCAATTCACTTCGTACGGTATGCTTCTGTAACCCCGATTCACTTTTCCMTACAGTACCAGCTACAGCTACGGGTTATTTTGAMGTGCCAATGCTTTTACAAATTTTAGTGGGACTGCAGGAGTGATMTAACACTCGAGGCTGAATATAATCTGGAAAGATCTACAMCCAACTAGGGCTAAMAC嵐TCTTTGGTATTTCAACGAGAGGAAGTGGAGGCAGTGCGTGCCTTACMTTGCTTGAACMCATCTCCCTTGGTAATACCCCCATTGACATTGAGTTTGTCCCAGGTGCGGGGTTTGTCCTTGCTCCTTCCCAATGGGACGCATTTCTTGCTGCAGAAGCTGTCAGGMCACAGCCATCCAGACCTATGCTACTGCTTTCGCTGAGTGGGAAGCACTTCGTACCCAATTCACCGCAACTGAGAAGATTCAAACTTTCGAAGTACAGCTGTTGTTGTCTTTGCTTAGAGACGTTGTGTTCTTTGTGAACMCTACTACMCGACTTGACCGAACGCTGGTACAATACCGGACTCGAACGTGTTTACAACCAGTTCAGGAGAGAGTTGACCCTCAATTACGATAGTAGGCGCTATCCCATTCGAACAAACCCAGTCTTGGAGAACTTCGATGGTCGTAGCATTAGGAGTCCACACTTGATGGATGCTCATAGGGGTTACTACTACTGGTCAGGTTCAGGTCCAGAGTTTACCTTTCCGCTCTATCGTATTGTTGCCCAACTAGGTCAGGGCGTGAGACCCTTCAACATAGGCATCAACAACCAGGCCTATGGAACCTCCTCCAATTTGCCATCCTCCCTGGATGAGATCCCACCACAGAACMCCGATTGAGCCATGTTTCCATGTTTCGTTCAGCACCTATGTTCTCTTGGATTCATCGTAGTAGCATTACTCAMTCCCTGCTGTGAAGGGAGGACCAGGATTCACTGGTGGGGACTTAGTTAATAGAGGGTACATTGAAGTTCCCATTCACCGTGTTCGGTACGCCTCTGTTACCCCGATTATTTTCTCCAACACAGTTCCAGCTACTGCTTTCGGTTACTTCGAGAGCGCCAACGCCTTCAGAAATTTCAGTGGGACTGCTGGAGTGATCGCAACACTTGAGGCTGAGTACAACCTGGAAagagcccagaaggccgtgaaaatgtcactgactaccacat簡1981SeqNO.4附oyL4ft基因1—aagctttcta^;q5g卿Gl一121181tgccctgtttacctctacaaaccagctagggctcaagacctgatatccatcctatttttacaacaattaccaacaacaacaaacaacmacmcattacmttactatttacmtmccatg§^2413013614214815416016617217818419019611021讓11411201126113211381144115011561162116811741180118611921198120412101cagmctttgagaatcagtggaaggatctctgagcgagttttgtaggtccggatcgcagaacagaacctagtgmgcactttctcaagattccacttgtcccaccgtgaactgttcgctgtcaggtacaattccgaattatctacmmatagaacgtagccgatgctcagtttctcaggaacaacgtataccgcagaccagtttgcctatagattccctgccatcgatttaagagcacccggatagcattttcaggaccttcagaataggagttcgtgtcctccattttgcgacttcgggtgttagmattactgcmctgtttacctcaatagctcgagtatttcaaccgtgccttaccgttggtaattgtcccaggtttcccmtggagctgtcaggtgctactgcttcgtacccaatcaaactttctttgcttagacaactactacgtacaataccccagttcaggcgatagtaggcccagtcttgcattaggagttaggggttactccagagttttgttgcccaacttcmcatatggaacctccggatgagatcgagccatgtttatgttctcttactcaaatcaggattcactagggtacatttcggtacgccctccmcacattacttcgagtttcagtgggacttgaggcttacaaaccaggagatctggtgagaggaagtmttgcttgaacccccattggcggggtttggacgcatttcmcacagccattcgctgagtttcaccgcaagaagtacagcgacgttgtgtmcgacttgagg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AGTACAACCTGGAAAGAGCCCAGAAGGCCG2041TAGGGCTCAAGACCMTGTCACTGACTATCCAGAGCTTCGTGAAGCCCTTCGGACCCAGTGCATCTCGGTGCTCAAGATTCAGACGTTCGCTGCCMTCTCCACTTGTCGTTGCTTCGCGTCTCCACGACCACCGTGAACAACTACTACACCGACTATGCCGTTCGCTGGTACAATACCGGGGATTGGGTCAGGTACAACCAGTTCAGGATTGCGCTGTTTCCGAATTACGATTCGiVGGCCACGGGMATCTACACAAACCCAGTCTTAGCTCAGGGCATAGAACGTAGCATTCGGAGTCCGATCTATACCGATGCGCATAGGGGTTACTCGCCTGTCGGCTTCTCAGGTCCAGAGTTTACAGCTCCGCAGCAACGGATTGTTGCCCMCCTACGTTCTACCGGAGACCCTTCAACATAGACGGGACAGAGTTTGCCTATGGCACCTCCTGCGGAACTGTAGATTCCCTGGATGAGATCCAAGGCTTTAGCCATCGATTGAGCCATGTCTTCAGCATCATAAGAGCACCTATGTTCTCGTTCATTCCATCGGATAGCATTACGCAAATCCGGTCTGTCATTTCAGGACCAGGCTTCACTGGCAATMCATTCAGAATAGAGGGTACATTGCCAGATACCGAGTTCGTGTTCGCTATGCCTGGGGTMTTCCTCCATTTTCTCCAACACAGTACAGTCTAGCGACTTCGGGTACTTCGAGAATATCGTTGGCGTCCGCAATTTCAGTGGGATCATTCCCGTTACTGCAACACTGGAGGCTGTGAATGCCCTGTTTACCTCTACMACCAGCACATTGA207權利要求1、一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，其特徵在於編碼區具有與SeqNo.2相似性達81％，且與SeqNo.2編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。2、根據權利要求l所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列如SeqNo.3所示。3、根據權利要求2所述的基因序列，如SeqNo.4所示。4、根據權利要求2所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列與SeqNo.3相似性為93M，且與SeqNo.3編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。5、根據權利要求4所述的基因序列，所述具有的核苷酸序列如SeqNo.7所示。6、根據權利要求5所述的基因序列，如SeqNo.5所示。7、包含權利要求l-6所述任一基因序列的植物表達載體。8、根據權利要求7所述的植物表達載體pUbi-mAh，其結構如圖l所示。9、根據權利要求7所述的植物表達載體pCAMBIASlAh，其結構如圖3所示。10、根據權利要求7所述的植物表達載體pCAMBIAUbi-mrAh,其結構如圖5所示。11、權利要求7-10所述任一植物表達載體在轉化植物中的應用。12、根據權利要求U所述的應用，是指將pUbi-mAh轉化到玉米中，所述轉化方法指基因槍法、花粉管通道法。13、根據權利要求ll所述的應用，是指將pCAMBIASlAh轉化菸草和甘藍，所述轉化方法指農桿菌介導的遺傳轉化法。14、根據權利要求11所述的應用，是指將pCAMBIAUbi-mrAh轉化水稻，所述轉化方法指農桿菌介導的遺傳轉化法。15、一種轉基因植物，其特徵在於該植物轉化的外源基因為權利要求l-6所述的任一基因序列。16、一種轉基因微生物，其特徵在於該微生物轉化的外源基因為權利要求l-6所述的任一基因序列。17、權利要求15所述的轉基因植物在表達具有SeqNo.l所示胺基酸序列的對鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應用。18、權利要求15所述的轉基因微生物在表達具有SeqNo.l所示胺基酸序列的對鱗翅目害蟲有高毒力蛋白上的應用。全文摘要本發明提供一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列及其在植物保護領域的應用，屬於生物防治
技術領域：
。一種人工合成的對鱗翅目害蟲表達高毒力蛋白的基因序列，其特徵在於編碼區具有與crylAh基因相似性達81％，且與crylAh基因編碼相同胺基酸序列的核苷酸序列。本發明通過調整crylAh基因的核苷酸組成，使其接近植物基因的密碼子頻率而不改變編碼的胺基酸序列，將本發明獲得的基因序列構建到適合的骨架載體中並轉化受體植物，使該基因序列得以在植物中表達，檢測結果顯示，陽性植株因表達了該基因而獲得對鱗翅目害蟲的抗性。文檔編號A01H1/00GK101358190SQ20081011931公開日2009年2月4日申請日期2008年9月3日優先權日2008年9月3日發明者何康來,宋福平,傑張,束長龍,梁革梅,郎志宏,黃大昉申請人:中國農業科學院植物保護研究所