一種豬肺炎支原體多重組抗原elisa檢測試劑盒的製作方法

2023-06-09 13:49:51

專利名稱：一種豬肺炎支原體多重組抗原elisa檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種動物傳染病檢測用試劑盒，屬於獸用生物製品領域。
背景技術：
豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine, Mps又稱豬氣喘病)的主要病原，也是豬呼吸道疾病綜合症的ー種重要的原發性病原。Mhp主要感染豬呼吸道，本身致病カ不強，臨床症狀主要以咳嗽和氣喘為主，病變特徵主要是肺的尖葉、心葉、中間葉和隔葉前緣呈「肉樣」或「蝦肉樣」實變。Mhp感染機體後主要與呼吸道內壁的纖毛黏附，引起纖毛細胞病變和凋亡，導致纖毛斷裂和脫落，引起機體發病，並且會嚴重影響豬的生長發育和飼料轉化率，或者破壞黏膜-纖毛屏障，容易繼發其他致病菌的感染(特別是對青年豬)，提高致死率，因而給養豬業造成巨大的經濟損失。目前豬支原體肺炎的主要防治措施是疫苗和藥物，但由於缺乏有效的藥物，且疫苗免疫後僅能減輕患豬臨床症狀的發生，降低死亡率，不能抵禦機體對Mhp強毒的感染。因此，建立ー種敏感、穩定的檢測方法對本病的檢測和監控及流行病學調查具有重要的意義。目前，豬肺炎支原體的診斷技術主要有以下四種臨床檢查、細菌學檢查、分子生物學檢查和血清學檢查。支原體體外培養比較複雜，Mhp的分離培養具有一定的難度，並且時間較長，容易漏檢，不適合於臨床應用。已有研究報導，通過PCR擴增特異性片段的方法來檢測，具有較好的效果，但通過呼吸道採集樣品，勢必會對豬只造成不同程度的影響，且PCR法有一定的技術要求，儀器設備要求較高，價格昂貴，不易於在生產實際中推廣應用。血清學檢測則可避免以上缺點。國內外建立了多種血清學檢測方法如免疫瓊擴、間接血凝等，免疫瓊擴、間接血凝試驗雖操作簡單，但存在敏感性不高的問題。ELISA方法操作簡單，敏感性高，特異性好，可作為檢測的有效手段，並可在基層得到廣泛應用。目前，國內外均有相關研究報導，國外雖已研製成了 ELISA檢測試劑盒，但檢出率低，且價格較為昂貴。因此，建立一種適用的、特異性好的、穩定性高的Mhp ELISA檢測手段是目前有效控制該病發生的關鍵。本病全球性分布，國外遠領先於國內。Mhp與其他支原體之間存在嚴重的交叉反應，從而給Mhp的鑑別診斷帶來了困難。目前，關於Mhp診斷方法，國內報導甚少，而國外研究較多。常用的ELISA方法，但由於交叉反應等影響，未能達到理想的效果。通過研究Mhp中特異性蛋白而建立診斷方法是目前研究的焦點。由於Mhp缺乏細胞壁，所以菌體的主要抗原物質存在於莢膜和細胞膜。莢膜中含有多種粘附蛋白和粘附相關蛋白等膜分子；細胞膜成分的2/3為蛋白質，分布於細胞膜的內外層，1/3為脂類，分布於細胞膜的中層。豬肺炎支原體的抗原組成成分主要是蛋白質與脂質兩類。脂質包括糖脂和脂多糖，它們都是半抗原，與蛋白質結合後具有抗原性。國內外學者已對豬肺炎支原體多種抗原蛋白進行了研究，其中包括乳糖脫氫酶P36蛋白、膜蛋白P46、熱休克蛋白DnaK以及黏附素蛋白P97。這些蛋白均特異性好，且分別是豬肺炎支原體感染早中晩期誘導產生抗體的蛋白之一，是已知抗原蛋白中用於檢測用抗原較為理想的蛋白。體外表達蛋白經鎳柱親合層析純化後作為抗原，建立間接ELISA檢測方法，並優化ELISA的反應條件形成檢測試劑盒，該試劑盒具有高特異性,高穩定性。試劑盒主要供實驗室研究和臨床診斷使用。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供ー種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，為實驗室和臨床檢測豬肺炎支原體抗體提供快速、準確、簡便的檢測工具。為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案如下ー種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，試劑盒中設有多重組抗原包被的ELISA板，酶結合物工作液，陽性對照血清，陰性對照血清，樣品稀釋液，ニ抗稀釋液，IOX濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液；其中所述的多重組抗原為豬肺炎支原體蛋 白P36、豬肺炎支原體蛋白P46、豬肺炎支原體蛋白P97R1和豬肺炎支原體蛋白DnaK。其中，本發明所述的豬肺炎支原體蛋白P36、P46、P97R1和DnaK按如下方法獲得I、豬肺炎支原體蛋白P36按專利ZL200910027160. 4的方法獲得。 2、豬肺炎支原體蛋白P46按文獻豬肺炎支原體P46基因的克隆及表達，江蘇農業學報，2008，24(3) : 288-292的方法獲得。3、豬肺炎支原體蛋白P97R1按專利ZL200910027159. I的方法獲得。4、豬肺炎支原體蛋白DnaK按文獻豬肺炎支原體DnaK基因的表達及ELISA方法建立，金陵科技學院學報，2011，27 (4) : 79-84的方法獲得。上述豬肺炎支原體蛋白P36和P97R1用分子篩層析發純化後使用，豬肺炎支原體蛋白P46和DnaK經Ni柱純化後使用。其中，所述的多重組抗原包被的ELISA板按如下方法製備得到使用pH9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被液，將豬肺炎支原體蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作為抗原分別以O. 5-2 μ g/ml、5_10 μ g/ml、5_10 μ g/ml和5-10 μ g/ml的包被濃度等體積混合,進行包板，每個樣孔100 μ L混合抗原，置溼盒，37°C孵育lh，4°c過夜，甩幹包被液，用PBST洗滌3次，3-5min/次，加入封閉液10g/L酪蛋白PBST，200 μ I/孔，置溼盒，37°C孵育lh，甩幹，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育Ih，甩幹後抽空封裝，置2-8°C保存。其中，所述的酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG抗體。按其使用說明的推薦稀釋倍數進行驗證試驗，按試驗結果進行矯正，酶標ニ抗直接加在ニ抗稀釋液中，ニ抗稀釋液為氯化鈉 8. 0g, KH2PO4 O. 3g，Na2HPO4. 12H20 5. 33g，KC10. 2g 加 ddH20 至900ml，加入IOg酪蛋白充分溶解後，調整pH至7. 2-7. 4，加入O. 5mL Tween-20和O. 1-0. 5g硫柳汞，加ddH20定容至1000mL。其中，所述的陽性對照血清為豬肺炎支原體間接血凝和IDEXX公司的ELISA檢測試劑盒檢測為陽性的豬血清；所述的陰性對照血清為豬肺炎支原體間接血凝和IDEXX公司的ELISA檢測試劑盒檢測為陰性的豬血清。其中，所述的樣品稀釋液和ニ抗稀釋液按如下方法製備得到氯化鈉8.0g，KH2PO4O. 3g,Na2HPO4. 12H205. 33g,KC10. 2g加 ddH20至 900ml，加入 IOg酪蛋白後充分溶解後，調整 pH 至 7. 2-7. 4，加入 0. 5mL/L Tween-20 和 0. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL0
其中，所述的IOX濃縮洗滌液為10XPBST，含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的10 X PBS。其中，所述的顯色液A按如下方法配製Na2HP0414. 6g，檸檬酸9. 33g，過氧化氫脲
O.52g，加ddH20至1000ml，調至pH5. O 5. 4 ;所述的顯色液B按如下方法配製TMB200mg，無水こ醇100ml，加ddH20定容至1000ml。顯色液A與B按如下方法配製工作液底物液A與B液I: I (V: V)混合使用，混勻。其中，所述的終止液為2mol/L的硫酸溶液。有益效果本發明具有下列突出的優點I)高特異性因豬肺炎支原體與豬鼻支原體等具有免疫交叉，因此全菌特異性差，本發明使用的4個蛋白均為豬肺炎支原體的特異性蛋白，與豬鼻支原體等其他病原無交 叉，保證了 ELISA的高度特異性。2)高靈敏度豬肺炎支原體4個蛋白的組合提高了 ELISA的靈敏度，其靈敏度高於IDEXX的豬肺炎支原體抗體ELISA檢測試劑盒和單蛋白的ELISA。3)簡單快速僅需要移液器和酶標儀進行加樣和讀數，操作僅需約2. 5h。本發明的檢測體系快速、方便、高特異性、高靈敏度地檢測到豬肺炎支原體抗體，不需要複雜儀器，為獸醫安全衛生的檢測提供了新的手段，能較好的滿足目前對豬場養殖現場檢測的迫切需要，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。


圖1P36蛋白檢測不同免疫組。圖2P46檢測不同免疫組。圖3P97R1檢測不同免疫組。圖4DnaK檢測不同免疫組。圖5多種抗原共同檢測不同免疫組。圖6IDEXX試劑盒檢測不同免疫組。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、エ藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I :ー種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，試劑盒中設有I、多重組抗原包被的ELISA板豬肺炎支原體蛋白P46和DnaK按文獻豬肺炎支原體P46基因的克隆及表達，江蘇農業學報，2008，24(3) : 288-292和豬肺炎支原體DnaK基因的表達及ELISA方法建立，金陵科技學院學報，2011，27 (4) : 79-84的方法構建豬肺炎支原體P46和DnaK的表達菌，將菌接入到LB (Amp+/Kan+)液體培養基，震蕩培養至OD值為O. 6-1. O時加入IPTG (終濃度為ImM)進行誘導表達5h。同時設未誘導的菌、誘導的空載體菌作為對照進行SDS-PAGE電泳。離心取上清液，用裂解緩衝液洗滌一次後，用裂解緩衝液懸浮。凍融數次後，超聲波裂解置於冰浴中的樣品，直至樣品不再粘稠。超聲時間不要太長，避免樣品溫度升高；若DNA沒有被切斷，細菌提取物就會粘稠並堵塞柱子，降低流速。14000g離心20min除去碎片，為防止堵塞樹脂。採用Protino Ni-TED 2000 PackedColumns試劑盒進行親和層析分離純化目的蛋白，檢測純化效果。採用BCA方法檢測蛋白濃度。採用不同濃度的重組抗原對ELISA酶標板進行包被，以確定最適包板的抗原濃度。豬肺炎支原體蛋白P36 和 P97R1 按專利 ZL200910027160.4 和 ZL 200910027159. I的方法獲得。採用DEAE纖維素等分子篩層析分離純化目的蛋白，檢測純化效果。採用BCA方法檢測蛋白濃度。採用不同濃度的重組抗原對ELISA酶標板進行包被，以確定最適包板的抗原濃度。重組抗原的最適包板濃度，是將提純後的重組抗原，通過10X、20X、40X、80X、160X和320倍稀釋後分別包板，然後分別進行ELISA測定陰、陽性對照，用陰、陽性對照所測定的OD值得比值(P/N)和表達抗原稀釋倍數劃曲線圖，選用曲線的拐點(P/N下降開始加 快)的稀釋倍數的前一個稀釋倍數作為重組抗原的最適包板濃度。所述的多重組抗原包被的ELISA板按如下方法製備得到使用pH9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被液，將豬肺炎支原體蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作為抗原分別以O. 5-2 μ g/ml、5_10 μ g/ml、5_10 μ g/ml和5_10 μ g/ml的包被濃度等體積混合,進行包板，姆個樣孔100 μ L混合抗原，置溼盒，37°C孵育lh，4°C過夜，甩幹包被液，用PBST洗滌3次，3_5min/次。加入封閉液10g/L酪蛋白PBST，200y I/孔，置溼盒，37°C孵育lh，甩幹，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育Ih，甩幹後抽空封裝，置2-8°C保存。2、酶結合物工作液所述的酶結合物工作液為市售商品化辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG。按其使用說明的推薦稀釋倍數進行驗證試驗，按試驗結果進行矯正。如推薦稀釋倍數為10000-100000,則使用5000、10000、15000、20000和250000的工作濃度加入到ニ抗稀釋液中，分別進行ELISA測定，測定陰、陽性對照血清，用明、陽性對照血清所測定的OD值得比值(P/N)和ニ抗稀釋倍數劃曲線圖，選用曲線的拐點(P/N下降開始加快)的稀釋倍數作為ニ抗的最適使用濃度。按照以下配方配製ニ抗稀釋液氯化鈉8. 0g, KH2PO4O. 3g,Na2PO4 · 12Η205· 33g，KC10. 2g，加ddH20至900mL,加入IOg酪蛋白充分溶解後，調整至7. 2-7. 4，加入O. 1-0. 5g硫柳汞，加入O. 5ml吐溫20，加ddH20定容至IOOOmL03、陽性對照血清臨床解剖後肺臟有明顯的豬肺炎支原體病變的豬，取其血清，同時通過間接血凝和IDEXX的RLISA檢測試劑盒檢測為陽性，用樣品稀釋液進行40倍稀釋即為標準陽性血清。4、陰性對照血清取臨床通過間接血凝和IDEXX的ELISA檢測試劑盒檢測為陰性，同時作臨床解剖後肺臟無任何豬肺炎支原體病變的豬，取其血清，用樣品稀釋液進行40倍稀釋即為標準陰性血清。5、樣品稀釋液和ニ抗稀釋液所述的樣品稀釋液和ニ抗稀釋液按如下方法製備得到氯化鈉8. 0g, KH2PO4O. 3g，Na2HPO4. 12H205. 33g，KC10. 2g加ddH20至900ml，加入IOg酪蛋白後充分溶解後，調整pH至7. 2-7. 4，加入 O. 5mL/L Tween-20 和 O. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL06、10X濃縮洗滌液所述的IOX濃縮洗滌液為10XPBST (即含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的10 X PBS )。7、顯色液 A :所述的顯色液A按如下方法配製Na2HP0414. 6g，檸檬酸9. 33g，過氧化氫脲O. 52g，加 ddH20 至 1000ml，調至 ρΗ5· O 5. 4 ;8、顯色液 B:
所述的顯色液B按如下方法配製TMB200mg,無水こ醇100ml,加ddH20定容至IOOOml。顯色液A與B按如下方法配製工作液底物液A與B液I: I (V: V)混合使用，混勻。9、終止液；所述的終止液為2mol/L的硫酸溶液。實施例2 I試劑盒檢測操作程序實驗前的準備將10 X洗滌液加入ddH20稀釋成洗滌工作液(IX)。將待檢樣品用稀釋液進行40倍稀釋。( I)在重組抗原包被板上分別設定兩個陽性對照和陰性對照孔，並加入相應的對照血清樣品(已稀釋)，每孔100 μ L ; (2)將待檢樣品加入檢測樣孔中，100 u L甸孔，直室溫60min ；(3)甩去各樣孔中的液體，用IX洗滌液，每孔300 μ L，洗滌3-5次，甩幹；(4)加入酶標ニ抗工作液，100 μ L每孔，室溫30min後重複步驟3 ；(5)加入顯色工作液100 μ L，室溫避光顯色IOmin ；(6)向姆個樣孔加入終止液50 μ L終止顯色,在450nm下測定其OD45tl值。2結果判斷公式S/P=(樣品OD45tl值-陰性對照OD450值)/ (陽性對照OD450值-陰性對照OD450值)當陽性對照OD45tl/陰性對照OD450彡3. O時試驗成立，血清樣品S/P彡O. 4，則判為陽性，S/P ( O. 3判為陰性，介於二者之間為可疑。實施例3 I血清樣品豬鼻支原體陽性血清、豬絮狀支原體陽性血清、豬圓環病毒陽性血清、副豬嗜血桿菌4型陽性血清、副豬嗜血桿菌5型陽性血清、豬肺炎支原體陽性血清、豬肺炎支原體陰性血清。2檢測方法按照實施例I和2進行P36、P46、P97、DnaK混合蛋白包被試劑盒的製備和檢測。3 結果用豬鼻支原體陽性血清、豬絮狀支原體陽性血清、豬圓環病毒陽性血清、副豬嗜血桿菌4型陽性血清、副豬嗜血桿菌5型陽性血清、豬肺炎支原體陽性血清、豬肺炎支原體陰性血清對本發明的試劑盒的特異性進行檢測結果見表I。表I豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒
權利要求
1.一種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，試劑盒中設有多重組抗原包被的ELISA板，酶結合物工作液，陽性對照血清，陰性對照血清，樣品稀釋液，二抗稀釋液，IOX濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液；其中所述的多重組抗原為豬肺炎支原體蛋白P36、豬肺炎支原體蛋白P46、豬肺炎支原體蛋白P97R1和豬肺炎支原體蛋白DnaK。
2.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的多重組抗原包被的ELISA板按如下方法製備得到使用pH9. 6的碳酸鹽緩衝液作為包被液，將豬肺炎支原體蛋白P36、P46、P97R1和DnaK作為抗原分別以O. 5-2 μ g/ml,5-10 μ g/ml>5-10 μ g/ml和5_10 μ g/ml的包被濃度等體積混合,進行包板,每個樣孔100 μ L混合抗原，置溼盒，37°C孵育Ih，4°C過夜，甩幹包被液，用PBST洗滌3次， 3_5min/次，加入封閉液10g/L酪蛋白PBS，200l·! I/孔，置溼盒，37°C孵育lh，甩幹，加50g/L蔗糖水溶液37°C孵育lh，甩幹後抽空封裝，置2-8°C保存。
3.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG抗體。
4.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的陽性對照血清為豬肺炎支原體間接血凝和IDEXX公司的ELISA檢測試劑盒檢測為陽性的豬血清；所述的陰性對照血清為豬肺炎支原體間接血凝和IDEXX公司的ELISA檢測試劑盒檢測為陰性的豬血清。
5.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的樣品稀釋液和二抗稀釋液均按如下方法製備得到氯化鈉8. 0g, KH2PO4 O. 3g，Na2HPO4. 12H20 5. 33g，KCl O. 2g加ddH20至900ml，加入IOg酪蛋白後充分溶解後，調整pH至 7. 2-7. 4，加入 O. 5mL Tween-20 和 O. 1-0. 5g 硫柳汞，加 ddH20 定容至 IOOOmL0
6.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的IOX濃縮洗滌液為10XPBST，即含有5mL/L Tween-20和O. 1-0. 5g/L硫柳汞的IOXPBSo
7.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的顯色液A按如下方法配製Na2HP04 14. 6g,朽1檬酸9. 33g,過氧化氫脲O. 52g,加ddH20至1000ml,調至pH5. O 5. 4 ;所述的顯色液B按如下方法配製TMB200mg,無水乙醇100ml,加ddH20定容至IOOOml ;顯色液A與B按如下方法配製工作液底物液A與B液I: I (V: V)混合使用，混勻。
8.根據權利要求I所述的豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，其特徵在於，所述的終止液為2mol/L的硫酸溶液。
全文摘要
本發明屬於衛生檢驗領域，公開了一種豬肺炎支原體多重組抗原ELISA檢測試劑盒，試劑盒中設有多重組抗原包被的ELISA板，酶結合物工作液，陽性對照血清，陰性對照血清，樣品稀釋液，二抗稀釋液，10×濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液；其中所述的多重組抗原為豬肺炎支原體蛋白P36、豬肺炎支原體蛋白P46、豬肺炎支原體蛋白P97R1和豬肺炎支原體蛋白DnaK。經檢測驗證，本發明試劑盒特異性強、敏感性高、具有良好的重複性和可操作性，可應用於豬肺炎支原體抗體的實驗室研究和臨床檢測，易於大範圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
文檔編號G01N33/68GK102735851SQ201210244908
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月13日 優先權日2012年7月13日
發明者馮志新, 劉茂軍, 杜改梅, 熊祺琰, 白方方, 邵國青, 韋豔娜 申請人:江蘇省農業科學院