一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法
2023-06-10 01:14:41 1
專利名稱：一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法，特別涉及一種採用通過菌種發酵和離子交換法製備重組改構人腫瘤壞死因子的方法。
背景技術：
腫瘤壞死因子(TNF)主要是由巨嗜細胞產生的一種非糖基化可溶性多功能細胞因子，由157個胺基酸組成。其主要生物學活性是能夠較為特異地殺傷多種腫瘤細胞。Sermenzatto G(British Jomnal ofCancer，1990；60354)對腫瘤壞死因子的生物學效應進行了詳細的描述。但是，臨床試驗表明，天然人腫瘤壞死因子存在嚴重的毒副反應，無法達到治癒腫瘤的目的。
將天然TNF的1-7位胺基酸缺失，Pro8Ser9Asp10用ArgLysArg取代，同時將Leu157用Phe取代，得到一種新型改構人腫瘤壞死因子(rmhTNF)。此突變體提高了其抗腫瘤活性，降低了毒副作用，可以應用於臨床。
重組改構人腫瘤壞死因子一般以可溶性蛋白的形式存在於胞漿中，而胞漿中細菌蛋白的成分複雜，故從大腸桿菌中分離純化rmhTNF的方法較困難。目前可見報導的純化工藝通常包括破菌、離心、鹽析、超濾、凝膠過濾、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和親和層析等一系列複雜步驟，但都存在步驟煩雜、純化得率低、生產難以放大等缺點，不能滿足臨床應用的需要。
發明內容
本發明需要解決的技術問題是公開一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法，以克服現有技術存在的上述缺陷。
本發明的方法包括如下步驟(1)採用常規的方法進行裂菌將採用常規方法發酵培養所獲得的誘導表達菌，懸浮於5～8倍體積的pH為8～9的緩衝溶液中(25％sucrose，10mmol/L Tris.HCl，1mmol/L EDTA)，按0.3～0.4mg/克菌體加入固體溶菌酶，0～6℃攪拌10～40分鐘；按3～7mg/克菌體加入脫氧膽酸鈉，攪拌，加MgCl2至終濃度為6～10M，再加入Dnase，混勻後離心分離，上清用30～70％飽和度的硫酸銨鹽析沉澱0.5～1.5小時，離心分離，收集上清，加入10～30mmol/L Tris.HCl，pH為8～9，0.1～2mmol/LEDTA透析，換液數次，此即為TNF粗製品；(2)Q-sepharose陰離子交換層析將步驟(1)的TNF粗製品，以30～40ml/min流速上樣於用pH為8～9，優選pH為8.5的緩衝溶液(10～30mmol/L Tris.HCl，0.1～2mmol/L EDTA)平衡的Q-sepharose陰離子交換柱，用平衡緩衝液淋洗至樣品光吸收值至基線，用0～0.5MNaCl溶液線性洗脫，將目的峰產物用10～30mmol/L pH為7.0～8.0，優選pH為7.5的磷酸緩衝液透析，換液數次，獲得目的峰透析液；所述及的Q-sepharose陰離子交換樹脂為Amersham Bioscience.公司生產的一種瓊脂糖凝膠；(3)SP-sepharose陽離子交換層析將步驟(2)的目的峰透析液以15～20ml/min流速上樣於SP-sepharose陽離子交換柱，用平衡緩衝液淋洗至樣品光吸收值至基線，用0～1M NaCl溶液線性洗脫，收集目的峰產物，即為本發明的重組改構人腫瘤壞死因子。所述及的SP-sepharose陽離子交換樹脂為Amersham Bioscience.公司生產的一種瓊脂糖凝膠；採用此生產工藝，單批生產300～400g菌體，可以獲得800～1200mg的rmhTNF蛋白，純度達到95％以上，比活達2～4×108IU/mg，活性回收率為80％以上，原液各項指標符合質量標準，取得良好的生產結果。與以往的生產方法比較，本項目的工藝路線簡單，原液質量合格，工藝放大容易，操作周期短，因而優勢十分明顯。
圖1為Q-sepharose層析洗脫峰曲線。
圖2為SP-sepharose層析洗脫峰曲線。
圖3為rmhTNF SDS-PAGE電泳圖，1為標準品2為樣品液。
圖4為rmhTNF純度測定(HPLC)。
具體實施例方式
實施例1Q-sepharose陰離子交換層析陰離子交換基質Q-sepharose裝柱φ10cm×20cm，用20mmol/L Tris.HCl，pH8.5，1mmol/L EDTA緩衝液平衡，以35ml/min流速將TNF粗製品上樣，用平衡緩衝液淋洗2柱體積至樣品光吸收值至基線，用0.5M NaCl線性洗脫(見圖1)，將目的峰對20mmol/L pH7.5磷酸緩衝液透析，換液3次。
SP-sepharose陽離子交換層析陽離子交換基質SP-sepharose裝柱φ5cm×15cm，以18ml/min流速將Q-sepharose目的峰透析液上樣，用平衡緩衝液淋洗2柱體積至樣品光吸收值至基線，用1M NaCl線性洗脫(見圖2)，收集目的峰產物。
結果採用此生產工藝，單批可以獲得1200mg的rmhTNF蛋白，純度達到97.8％，比活達3.6×108IU/mg，活性回收率為86％，原液各項指標符合質量標準。
電泳圖如圖3，rmhTNF純度測定(HPLC)如圖4。
權利要求
1.一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法，其特徵在於，包括如下步驟(1)採用常規的方法對發酵培養所獲得的誘導表達菌進行裂菌獲得TNF粗製品；(2)將步驟(1)的TNF粗製品，上樣於用pH為8～9的緩衝溶液平衡的Q-sepharose陰離子交換柱，用平衡緩衝液淋洗至樣品光吸收值至基線，用NaCl溶液線性洗脫，將目的峰產物用pH為7～8磷酸緩衝液透析，獲得目的峰透析液；(3)將步驟(2)的目的峰透析液上樣於SP-sepharose陽離子交換柱，用平衡緩衝液淋洗至樣品光吸收值至基線，用NaCl溶液線性洗脫，收集目的峰產物，即為本發明的重組改構人腫瘤壞死因子。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將步驟(1)的TNF粗製品，以30～40ml/min流速上樣於Q-sepharose陰離子交換柱。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將步驟(2)的目的峰透析液以15～20ml/min流速上樣於陽離子交換柱。
4.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於，所述及的Q-sepharose陰離子交換樹脂為一種瓊脂糖凝膠。
5.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於，所述及的SP-sepharose陽離子交換樹脂為一種瓊脂糖凝膠。
6.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於，用0～1M NaCl線性洗脫。
全文摘要
本發明公開了一種重組改構人腫瘤壞死因子的生產方法，特別涉及一種採用通過菌種發酵和離子交換法製備重組改構人腫瘤壞死因子的方法。包括如下步驟採用常規的方法進行裂菌，用Q－sepharose陰離子交換層析，用SP－sepharose陽離子交換層析。採用此生產工藝，單批生產300～400g菌體，可以獲得800～1200mg的nrhTNF蛋白，純度達到95％以上，比活達2～4×10
文檔編號C12P21/00GK1566357SQ0312926
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月16日 優先權日2003年6月16日
發明者張玫萍, 曹緯 申請人:上海賽達生物藥業股份有限公司