禽流感和傳染性囊病混合病毒樣顆粒、製備方法和應用的製作方法

2023-06-10 01:19:41

專利名稱：禽流感和傳染性囊病混合病毒樣顆粒、製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及禽流感和傳染性囊病混合病毒樣顆粒，及其製備和應用。
背景技術：
禽流感(Avian Influenza, Al)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類(家禽和野禽)的一種感染和/或疾病症候群，發生在雞、鴨、鵝、鴿子等禽類和鳥類身上，但主要侵害火雞和雞，哺乳動物如豬、馬、海豹、人等也可感染。根據禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)株的致病性、禽的種類、環境、飼養管理條件以及並發疾病等因素，感染後的禽只表現為無症狀感染、輕度的上呼吸道症狀、產蛋量下降到急性的致病性死亡等多種形式， 直接影響雞體的健康及其產品質量，是現代化養禽業難以對付的重要禽類呼吸道傳染病之一，與馬立克氏病、傳染性法氏囊病、白血病、網狀內皮增生症等一樣，也是嚴重威脅家禽的重要免疫抑制病。被世界動物衛生組織列為A類動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。自從1955年證實了 1878年義大利暴發的雞瘟是由A型流感病毒引起的流感以來到2001年，全球共報導了 19起高致病性禽流感疫情，其中火雞發生5起，雞14起。進入本世紀以來，高致病性禽流感疫情也不斷發生。2001年中國香港發生H5W亞型流感；2003 年初，歐洲大陸相繼暴發禽流感，2003年2月荷蘭發生H7N7亞型、2003年4月比利時發生 H7N7亞型、2003年5月德國發生H7N7亞型禽流感。2003年末2004年初，亞洲各國相繼暴發禽流感，疫情共涉及10個國家或地區。2003年12月，韓國發生禽流感，2004年1月，日本、越南、臺灣、泰國、柬埔賽、印度尼西亞、巴基斯坦、寮國和中國等國家和地區先後發生禽流感，其中日本、臺灣發生了 H5N2亞型禽流感，其他國家和地區發生了 H5W亞型禽流感。這些疫情的暴發，不但給亞洲各國養禽業造成毀滅性打擊，而且嚴重影響到人民的身體健康， 越南、泰國等國家先後發生了禽流感感染人類，造成死亡的嚴重後果。2004年2月，禽流感又在美洲大陸發生，其中美國發生了 H7N7禽流感，4月份加拿大也發生了禽流感。目前，高致病性禽流感特別是H5W禽流感還在亞洲和北美部分國家和地區蔓延。我國目前流行的高致病性禽流感主要是H5m亞型禽流感。目前國內生產的用於預防禽流感的疫苗大部份是採用傳統的雞胚法培養增殖活病毒，經化學試劑滅活後生產成疫苗。這種技術又分為兩類不同的製備法一是直接用野生型病毒感染雞胚製備，另一類是先採用反向遺傳技術改造野生病毒的遺傳性，然後用「拯救」改造的新病毒來感染雞胚，增殖病毒，生產疫苗。這些流感疫苗製備技術有其優點，但亦存在著很大的缺陷。尤其是流感感毒的與眾不同特性，例如高頻率突變，雙重及多重亞型病毒之間遺傳物質重組及抗原漂移等—— 使這些疫苗的長期安全性及有效性受到了極大挑戰，甚至產生了 「無效疫苗」，難以應付新的突變型流感病毒的傳染。除此以外，這些疫苗製劑還存在著以下不足(1)生產周期長 從獲得新的亞型病毒株到疫苗生產上市，耗時5-8個月，難以遏制新的疫情大爆發。(2)生產條件高為預防人為的汙染環境及生產的活病毒的洩漏擴散，整套生產必須按規定在生物安全三級實驗室條件下進行，病毒的滅活必須保證完全，徹底。(3)無法區別被免疫過的雞隻與受病毒感染的雞隻。傳染性囊病病毒(IBDV)屬於雙RNA病毒科(Birnaviridae)禽雙RNA病毒屬 (Avibirnavirus)，它是雞傳染性囊病的病原。目前普遍認為IBDV具有4種成熟蛋白質 VPU VP2、VP3 和 VP4，分子量分別為 90kDa、37_40kDa、32_35kDa 和 24_30kDa。其中 VP2 和 VP3是主要的結構蛋白，分別佔病毒總蛋白的51%和40%。VP2分子量約為40kDa，它含有血清型特異性的能誘導中和抗體的抗原決定簇，是病毒的主要宿主保護性免疫原(Hudson et al，1986)。病毒樣顆粒(VLP)是含有某種病毒的一個或多個主要結構蛋白，在體外表達系統中自動組裝成的不包含病毒核酸的空心顆粒，它的形態和大小與真實的病毒粒子相同或相似，所以能有效的誘導機體免疫系統產生免疫保護反應，作為一種新型疫苗顯示出了良好的應用前景。典型的H5N1AIV粒子呈球形或橢圓形，直徑80 120nm，H5N1流感病毒的基因組8個基因片段共編碼11種蛋白，病毒的外殼是一層由脂質及脂蛋白構成的膜，包裹著病毒的遺傳物質及核蛋白。共有4種蛋白質，屬於病毒主要結構蛋白，它們是基質蛋白M1， 形成病毒外殼的主體蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣殼，參與病毒粒子形成；紅細胞凝集素HA，病毒外殼表面膜上的主要糖蛋白，共有16個亞型。是誘發宿主機體產生抗體的主要抗原體。神經氨酸苷酶NA，亦是病毒外殼表面膜上的一種糖蛋白，共有9個亞型，同樣是誘發抗體產生的主要抗原體。流感病毒的表面膜蛋白HA和NA是引起機體產生免疫應答的主要誘發物，而基質蛋白Ml是形成病毒外殼的主體，亦可作為組織型免疫應答的誘發物。有關的研究證明，基質蛋白Ml的正確表達，是保證病毒外殼形成的重要環節，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒實體從宿主細胞表面剝離下來，形成病毒顆粒，因此禽流感病毒的結構蛋白Ml、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和Ml等3個主要結構蛋白同時表達就可以自動組裝成空心的沒有病毒基因組的病毒樣顆粒。另外研究證明流感病毒的保守蛋白一NP 蛋白可有效刺激CTL (細胞毒T淋巴細胞)反應，抑制病毒感染，在病毒樣顆粒中加入NP蛋白將會在一定程度上提高這種新型疫苗的細胞免疫水平。禽流感病毒和傳染性囊病病毒在雞體內互為影響，同時感染會加重病情。故有必要提供一種二價疫苗同時預防H5m禽流感和傳染性囊病。

發明內容
本發明的目的之一在於提供一種疫苗，該疫苗能夠同時預防H5m禽流感和傳染
性囊病。本發明的目的是通過以下內容實現的。本發明提供一種混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區和膜內區；所述傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5』端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。本發明還提供一種禽流感和傳染性囊病二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發明還提供一種製備所述混合病毒樣顆粒的方法。利用包含所述融合膜蛋白的混合病毒樣顆粒構成的疫苗，可同時預防H5W禽流感和傳染性囊病，並具有明顯的優點和效果(1)H5N1禽流感和傳染性囊病VLP 二價疫苗能引起機體免疫系統產生強型應答， 免疫力強，持續時間長，能同時預防H5m禽流感和傳染性囊病。(2)由於病毒樣顆粒不含病毒基因組，這種空殼結構的VLP在免疫動物體內就不會發生病毒基因與宿主染色體基因整合，而且整個生產過程不接觸活的有感染力的病毒， 因此非常安全，對於流感病毒和傳染性囊病病毒兩種病毒來說，都無病毒擴散之虞。(3)和一般的基因工程亞單位疫苗比較，因為病毒樣顆粒更接近天然病毒的形態和大小，能刺激機體產生更好的免疫反應，免疫效果更好。(4)可區別出被人工免疫了的動物與被病毒感染的動物。病毒樣顆粒不含流感病毒NS、PB1、PB2等蛋白，因此進行血清測試時，用VLP疫苗免疫的動物，將不會產生特異性抗 NS或PB的抗體，可以區分是否為野毒感染。對於傳染性囊病來說，用VP2蛋白之外的任何病毒結構蛋白如VP3等作為檢測抗原，都可以區分是否為野毒感染。下面結合附圖和具體實施方式
進一步詳細描述本發明，但本發明不局限於這些實施方式，任何在本發明基本精神上的改進或替代，仍屬於本發明權利要求書中所要求保護的範圍。


圖1是用各自特異性引物？0 擴增出的撤仏)、嫩仏)^103)、呢(、￥/撤((1)基因片段的電泳圖片。圖2是重組昆蟲杆狀病毒表達質粒rBacmid-HA(/V/HA)_NA、rBacmid-Ml、 rBacmid-NP 示意圖。圖3是病毒樣顆粒western blot結果。圖4是病毒樣顆粒中的Ml蛋白和VP2蛋白的間接免疫螢光結果。A、Ml抗體為 RBITC標記顯示橙色螢光，C、VP2抗體為FITC標記顯示綠色螢光，B、D為陰性對照。圖5A是蔗糖密度梯度離心純化後的病毒樣顆粒在電子顯微鏡下的圖象，圖5B是放大圖。
具體實施例方式本發明以Bac-to-Bac 昆蟲杆狀病毒表達系統為基礎，利用H5W禽流感病毒的基質蛋白Ml、表面膜蛋HA和NA蛋白(以及任選地，核蛋白NP)，共同自動組裝構建出H5W禽流感病毒的病毒樣顆粒(VLP)。在此基礎上，構建H5W禽流感病毒與傳染性囊病病毒的二價 VLP。首先，將傳染性囊病病毒的主要表面抗原基因VP2的大部分膜外域替換H5W禽流感病毒的HA蛋白基因的一部分膜外域，二者構成融合基因(V/HA)，VP2基因位於融合基因 V/HA的5』端，替換大致相等長度的HA基因的5』端序列，以保障融合基因V/HA的長度與 HA基因長度大致相等。
然後，按照形成流感病毒樣顆粒的方法，將H5W禽流感病毒的基質蛋白Ml、核蛋白NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表達傳染性囊病病毒VP2和流感病毒HA的融合蛋白V/HA的基因，構建於昆蟲杆狀病毒的載體質粒內，並使其重組入昆蟲杆狀病毒的遺傳物質DNA內，利用宿主昆蟲細胞表達這些外源蛋白，自動組裝成不含禽流感病毒遺傳物質的病毒樣顆粒，病毒樣顆粒形成後將釋放入細胞培養液中。這樣形成的VLP既具有H5W禽流感病毒的主要表面抗原，又具有傳染性囊病病毒的主要表面抗原VP2，為H5W禽流感病毒與傳染性囊病病毒二價VLP。需要指出的是，有研究表明，不同的膜蛋白在細胞內表達後會被轉運到細胞膜的不同微區域，在細胞膜上的分布主要取決於膜蛋白的跨膜區和膜內域。未經改造的VP2和 HA蛋白有可能在表達後分布於細胞膜的不同微區域，因而當未經改造的VP2和HA蛋白同時表達時，他們有可能同時整合到同一 VLP，但他們在VLP中的含量和比例有很大差異。本發明將VP2蛋白的部分膜外域融合到缺失部分膜外域的HA上，這樣V/HA融合蛋白和HA蛋白含有同樣的HA的部分膜外域，跨膜區和膜內域；這樣保證V/HA融合蛋白和HA蛋白分布在同一細胞膜的微區域；因此在VLP的形成過程中，V/HA融合蛋白和HA蛋白非常可能地被一樣有效地整合到VLP上，他們在VLP中的含量和比例得到保證。另外，流感病毒的結構蛋白作為二價VLP的骨架是因為我們發現流感病毒VLP高產、穩定；同時HA蛋白的整合到VLP是高效的；這樣可以保證在VLP的表面有足夠的HA蛋白，可以作為有效的疫苗使用。實施列1 :M1、NP、HA、NA和融合基因V/HA的擴增(1) H5N1亞型禽流感病毒RNA抽提和RT-PCR按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取試劑盒的使用說明書(方法)進行。分別取250 μ L禽流感病毒H5m亞型毒株感染尿囊液和750 μ L TRIzol LS，加入1.5mL 微量離心管內，用吸管吹打充分混勻，室溫放置IOmin ；加入200 μ L氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置5分鐘後，4°C下12000rpm離心15min ；取上清於一新的滅菌1. 5mL離心管內，加入 500 μ L異丙醇，充分混勻，室溫放置lOmin，在4°C下12000rpm離心IOmin ；傾去上清，沉澱中加入70%的乙醇750 μ L，輕輕混勻，洗滌一次，4°C下12000rpm離心15min，棄去上清，風乾；加入10 μ L用DEPC水處理的無RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉澱)，直接用於RT-PCR 或_80°C保存備用。參照TaKaRa的AMV反轉錄酶的使用說明進行，在20 μ L反應體系中分別加入以下組分:RNA :3μ L ；5XRTbuffer :4μ L ；dNTP :4μ L ；RNA 酶抑制劑0. 5μ L ；引物 UP :1 μ L ；引物 DN :1 μ L ；AMV :2 μ L ；DEPC 水補至 20 μ L。混勻後，室溫放置 10min，42°C保溫lh，冰浴2min，RT產物直接用於PCR擴增或_20°C保存。(2) Ml、NP、HA、NA 基因的 PCR 擴增來源於(1)的RT-PCR產物可用於Ml、NP、HA、NA基因的擴增。根據HA基因序列(SEQ ID NO 1)設計的1對引物，用於擴增HA基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點，位於PlO啟動子下，引物序列如下HA Xho I 5' -GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3，(SEQ ID NO 11)HA Nco I :5』 -GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 12)根據NA基因序列(SEQ ID NO 3)設計的1對引物，用於擴增NA基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點位於Pph啟動子下，這2個引物序列分別是
NA Sal I :5，-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3，(SEQ ID NO 13)NA Hind III :5，-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3，(SEQ ID NO 14)根據Ml基因序列(SEQ ID NO 5)設計的1對引物，用於擴增Ml基因，其兩端分別加上了 Ml I和Hind III的酶切位點，位於Pph啟動子下，這2個引物序列分別是Ml Sal I :5，-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3，(SEQ ID NO 15)Ml Hind III :5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，(SEQ ID NO 16)根據NP基因序列(SEQ ID NO 7)設計的1對引物，用於擴增NP基因，其兩端分別加上了 Bio I和Nco I/酶切位點，位於PlO啟動子下，引物序列如下NP Xho I ,5' -AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3，(SEQ ID NO 17)NP Nco I :5』 -CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 18)(3)融合基因V/HA的合成V/HA基因的核酸序列見SEQ ID NO 9 ；V/HA蛋白質的胺基酸序列見SEQ ID NO 10。融合基因根據其核酸序列合成。融合基因V/HA包含傳染性囊病病毒的主要表面抗原 VP2基因5，端的1-200胺基酸和H5W的HA基因的3，端185-568(共384)胺基酸。融合基因V/HA編碼584胺基酸，其基因序列如SEQ ID N0:9所示。融合基因V/HA由人工合成。 根據融合基因V/HA的序列(SEQ ID N0:9)，設計的1對引物，用於擴增融合基因V/HA，其兩端分別加上了》ιο I和SphI酶切位點，位於PlO啟動子下，引物序列如下V/HA EcoR I :5，-CCGGAATTCATGTCTGCAACAGCCAACA-3，(SEQ ID NO 19)V/HA Hind III :5，-CCCAAGCTTTTAAATGCAAATTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 20)採用M1、NP、HA、NA、V/HA各自特異性引物，將反轉錄的產物或合成的DNA片斷直接用作PCR擴增M1、NP、HA、NA、V/HA基因的模板。PCR反應條件為94°C預變性3min，94°C變性 40S，56°C退火90s，72°C延伸90s，循環30次，最後延伸lOmin，PCR產物用1. 5%瓊脂糖凝膠 (含0. 5ug/ml溴化乙錠，EB)電泳檢測。PCR擴增的HA基因的長度約1. 7Kb (圖la)，NA基因的長度約1. 35Kb (圖la)，Ml基因的長度約0. 75Kb (圖lb)，NP基因的長度約為1. 5Kb (圖 Ic)，融合基因V/HA的長度約為1. 7Kb (圖Id)。所有的PCR產物樣品經電泳凝膠抽提後，獲得純化的M1、NP、HA、NA、V/HA基因DNA片段，經限制性內切酶Biol/Nco I (消化HA片段)、 &il/HindIII (消化 NA 片段)，)(ho I/Nco I (消化 NP 片段)、Sal I/Hind 111(消化 Ml 片段)、EcoR I和Hind III (消化V/HA片斷)37°C分別消化後，再進一步純化，以備下一步構建重組質粒用。具體操作如下製備瓊脂糖凝膠含0. 5ug/ml溴化乙錠，將所有PCR樣品加入凝膠的樣品槽內，設置電壓100V，電泳時間40min在長波紫外燈下，切下含有樣品帶的凝膠條，裝入小塑料離心管中。參照膠回收試劑盒(Qiagen公司產品)說明書，抽提純化 Ml、NP、HA、V/HA和NA基因DNA片段。經限制性內切酶37°C過夜消化後，用膠回收試劑盒 (Qiagen公司產品)，按照說明指導，離心過柱，純化回收酶切消化後的Ml、NP、HA、ΝΑ、V/HA 片段。實施例2 構建表達Ml、NP、HA、ΝΑ、Υ/ΗΑ基因的昆蟲杆狀病毒表達質粒及在昆蟲細胞中合成重組的昆蟲杆狀病毒(1)構建表達Ml和NP基因的重組質粒昆蟲杆狀病毒質粒Pi^astBac anvitrogen公司產品)經限制性內切酶Ml I/Hind III 37°c酶切3小時後，用膠回收試劑盒回收純化酶切後的質粒PFastBac。在T4 DNA連接酶的作用下，酶切後的質粒與酶切後的Ml DNA片段於16°C連接過夜。反應體系如下 10XT4連接緩衝液lml，Ml酶切回收的DNA片段:3ml，酶切PFastBac質粒回收產物lul，T4 DNA連接酶lul，ddH20補至IOul。採用熱休克方法將連接產物轉導入ToplO感受態細胞中加入到於一小塑料離心管中，輕輕混合後將小管置於冰上30min，轉入42°C水浴中熱休克 90s，迅速放回冰上5分鐘，向其中加入200ulLB培養液。37°C搖床培養1小時。取IOOul 菌液塗布於LB固體培養基(含有氨苄和慶大黴素兩種抗生素)上，37°C培養16h，從平板上挑取陽性克隆菌落，進行菌液PCR，抽提質粒後用Ml I /Hind III進行單雙酶切鑑定。DNA 序列測定後，獲得重組質粒PFastBac-Ml。表達NP基因的重組質粒PFastBac-NP的構建方法同上。(2)構建表達HA或V/HA和NA基因的重組質粒昆蟲杆狀病毒表達質粒PFastBac-dual經限制性內切酶Bio I/Nco I酶切後，在 T4DNA連接酶的作用下，將被同樣的內切酶消化後的HA基因DNA片段插入到PlO啟動子的下方，此連接產物隨後經熱體克法轉導入ToplO感受態細胞中，培養、抽提數個陽性克隆菌落的重組質粒DNA，菌液PCR和Bio I/Nco I酶切鑑定及DNA序列測序確定無誤後，挑選其中的1個重組質粒DNA，進行第二次酶切。所用的限制性內切酶為Ml I/Hind III。用同樣的內切酶酶切NA基因DNA片段，並將其插入到重組質粒的另一個啟動子Pph的下方，經轉化、篩選、培養、抽提，獲得二度重組的質粒。DNA測序後，即為所需的重組昆蟲杆狀病毒表達質粒 PFastBac-dual-HA-NA。同時表達融合基因V/HA和NA基因的重組質粒PFastBac-dual-V/HA_NA的構建方法同上。(3)重組昆蟲杆狀病毒基因組的合成及提取將純化的重組PfatBac-Ml、PfatBac-NP、PFastBac-dual-HA-NA 禾口 PFastBac-dual-V/HA-NA質粒分別轉導入特殊的E. coli感受態細胞株DH IOBac細胞中 (美國hvitrogen公司產品)。DHlOBac細胞含有一特殊的大分子質粒Bacmid，其內包含有昆蟲杆狀病毒AcMNPV的全部基因組。一旦重組的表達質粒整合入大分子質粒Bacmid的特別位點後，經3種抗菌素(慶大黴素、四環素和卡那黴素)的篩選及IPIG的誘導和X-Gal 底物反應進行藍白斑篩選，陽性克隆菌落呈白色，而非重組的野生菌落呈蘭色。實驗條件均按照^witrogen公司提供的實驗手冊指導而設定。挑選的陽性克隆置於3ml的LB培養液中(含上述3種抗生素)，經37°C搖床培養M小時，按照實驗手冊標明的大分子質粒 Bacmid小量製備法，提取純化帶有Ml基因、NP基因、HA-NA或V/HA-NA基因的重組大分子質粒 Bacmid。(4)重組昆蟲杆狀病毒的製備將昆蟲細胞株sf9細胞(美國hvitrogen公司產品)培養於無血清的sf_900II 昆蟲細胞培養液中anvitrogen公司產品)，溫度設置為27 °C，根據hvitrogen公司提供的實驗手冊，採用脂質體轉染法，將純化的重組大分子質粒Bacmid與脂質溶液 eellfectin (Invitrogen公司產品)混合，轉染入sf9細胞中，27°C培養4至5天後，收集細胞培養上清液，3000rpm離心10分鐘收集上清液，獲得低滴度的重組昆蟲杆狀病毒，再用此上清液感染新培養的sf-9細胞；3天後收集細胞培養上清液，即為所需的放大培養後的高濃度重組昆蟲杆狀病毒，命名為Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-V/HA_NA。對獲取
8的用於放大培養和蛋白表達的重組昆蟲杆狀病毒進行蝕斑實驗，確定病毒的噬斑形成單位 (plaque forming units, PFU)。1)用含10% FBS的Grace氏培養基將Sf9細胞傳代接種到六孔培養板中，細胞密度為約1 X IO6個細胞/ml，每孔加2ml (6孔板)，輕輕混勻室溫使細胞貼壁1小時以上。2)將P3代種毒液用不含FBS的Grace』 s培養基做10倍倍比稀釋待用。3)棄去六孔板中的培養基，用不含血清的培養基清洗細胞3次，然後將上述稀釋好的重組病毒液加入孔中，每個稀釋度做兩個復孔，室溫下感染1小時。4)製備覆蓋液(以下為一塊六孔板的量)7ml 2 X Grace氏培養基+140 μ 1的雙抗+7ml 2%的高壓滅菌瓊脂糖凝膠+1. 4ml FBS,輕輕地混勻，然後將瓶再放置42°C水浴， 病毒感染Ih後吸盡每孔中的病毒液，並快速用上述製備的覆蓋液覆蓋細胞。5)待瓊脂糖凝固後將六孔板用保鮮膜包好並置於27°C培養箱中培養3-5天。6)加入Iml濃度為lmg/ml的中性紅，室溫孵育2小時後吸去染液，觀察到重組病毒形成的近似透明的小點即為空斑。計算統計觀察病毒空斑的形成情況(PFU)。用於放大培養重組杆狀病毒Bac-Ml，Bac-NP, Bac-HA-NA和Bac-V/HA-NA的細胞離心沉澱物，經細胞裂解緩衝液處理後，4°C離心(13，OOOrpm) 10分鐘(或者將細胞在冰浴的情況下進行超聲波破碎)，收集上清液，進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析基質蛋白Ml (或者 NP、HA、V/HA和NA蛋白)是否在昆蟲細胞Sf9中表達。簡單而言，將10 μ 1上清液樣品中加入IOul的2XSDS上樣緩衝液，100°C處理5min後，IOOOOrpm離心5分鐘，將所有20ul的上清樣品加入4%-12%505-聚丙烯醯胺凝膠(11^1廿呢611公司產品)的點樣孔中。設置電泳條件為恆定電壓100V，溫度為4°C，電泳時間約3小時。待指示液溴酚蘭接近凝膠底部時，停止電泳。凝膠置於R型考馬斯亮藍染色液中，搖晃染色1小時，然後置於脫色液中脫色過夜。實施例3 :M1、NP、HA、V/HA和NA基因在共同轉染的懸浮培養的昆蟲細胞sf_9中的表汰將200ml sf-9細胞混合液懸浮培養於1升體積的三角搖瓶中，細胞培養液為無血清的8€-90011(或化￥^1^8611公司的Grace昆蟲培養基)，搖床的搖速為lOOrpm， 溫度恆定於27°C。當細胞濃度達到2X106細胞/ml時，用Bac-Ml、Bac-NP, Bac-HA-NA, Bac-V/HA-NA昆蟲杆狀病毒共同轉染sf9細胞。病毒的MOI比例為3 (Bac-Ml和 Bac-ΝΡ) 1 (Bac-HA-NA) 1 (Bac-V/HA-NA)。轉染的細胞經恆溫搖動培養3天後，收集所有樣品，4°C離心30分鐘，離速為3000rpm，收集上清液。離心下來的細胞沉澱物用細胞裂解液處理後，4°C離心10分鐘，離速10，OOOrpm。保留離心後的上清液。實驗進行的同時構建合成的野生型昆蟲杆狀病毒用於轉染懸浮培養的sf-9細胞，MOI為5。作為設置的陰性對照， 轉染後的細胞培養、樣品的收集及細胞裂解的條件與步驟與上述實驗一樣。收集的所有樣品，用於Western blots分析。其實驗操作如下每個樣品(包括陰性對照)分別取10 μ 1 的細胞裂解抽提液及細胞培養上清液，再各自加入IOul的2XSDS上樣緩衝液。100°C處理5!^11後，將所有2(^1的混合樣品加入4% -12% SDS聚丙烯醯胺凝膠的點樣孔中。設置恆定電壓120V,溫度為4°C，時間3小時，當藍色指示劑溴酚蘭完全靠入凝膠底端時，停止電泳，取出凝膠。剪一張與凝膠相同大小的硝酸纖維素膜(PVDF膜)及兩張濾紙，PVDF膜用甲醇浸泡5分鐘後與凝膠、濾紙一起浸入預冷2小時以上的轉移緩衝液中，按濾紙——凝膠——硝酸纖維素膜——濾紙的順序安裝入轉印夾。將夾中靠近凝膠的一側接負極，恆壓 25V轉移電泳lh。用鑷子夾取出硝酸纖維素膜，用PBS-T漂洗液洗滌，而後轉移至5%的脫脂奶粉/PBS溶液中，搖蕩封閉1小時。用PBS-T漂洗液洗滌3次，每次3分鐘；然後將硝酸纖維素膜轉入一塑膠袋中，加入:3ml以1 500稀釋於5%脫脂奶粉/PBS中抗H5W禽流感病毒雞源多克隆抗體(一抗)，置於4°C平緩搖動過夜。翌日，取出纖維素膜，用PBS-T 漂洗液洗滌3次，每次10分鐘，將此硝酸纖維素膜再裝入另一新的塑膠袋中，加入5ml以 1 10000稀釋於5%脫脂奶粉/PBS中的辣根過氧化物酶標記的驢抗雞IgG(二抗)，室溫下搖動溫育lh。棄二抗，PBS-T漂洗纖維素膜3次，每次10分鐘，將漂洗後的硝酸纖維素膜移至一平皿中，加入DAB第五顯色液，可見在各自相對應的分子量位置上，Ml、NP、HA/V/HA 和NA的特異性條帶。說明Ml，NP, HA/V/HA和NA在轉染的懸浮培養的SF-9昆蟲細胞中有效地表達了。_仿丨丨4碰白糊細日H棘僅_申細·。將上述離心收集的細胞上清液裝入13ml的超速離心管內，稱重、平衡、封管後，放入超速離心機(Bechmem公司產品)內，4°C 100, OOOrpm離心1小時，然後取出離心管，小心倒掉上清液，保留離心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4°C冰箱內，溶解M小時。次日，在另一個13ml的超速離心管內，先小心地加入Iml 60%的庶糖溶液，然後依次加入Iml 30%及:3ml 20%的庶糖溶液，最後將5ml的溶解後的樣品液置於其上。精確稱重、平衡後， 封管上超速離心機。4°C 100，OOOrpm離心1小時。取出離心管，分別收集位於20%與30% 及30%與60%濃度交界處的二條帶，即純化的病毒樣顆粒。Weatern blots分析純化濃縮後的病毒樣顆粒樣品。其操作步驟與上述實施例3中Western blots分析一樣，只是將所取的樣品進行了稀釋，即1μ 1的病毒樣顆粒樣品，加入9ul的水，再加入IOul的2XSDS上樣緩衝液。100°C變性5min後，上樣入4% -12%聚丙烯醯氨凝膠樣品槽內，Western blots 結果顯示，從這二條帶所獲得的大分子顆粒，的確是由Ml、NP、HA/V/HA和NA構成的病毒樣顆粒。尤其是從30%與60%濃度交界處取得的似病毒顆粒含量大，特異性條帶濃度深。說明轉染後，病毒樣顆粒在宿主細胞中有效地自我組裝，並釋放入細胞培養上清液中，進一步的間接免疫螢光實驗和電鏡結果證實了這一點(圖4、圖5)。間接免疫螢光實驗操作步驟如下將sf9細胞種到M孔板中，每孔10萬細胞，實施例3的操作步驟，對所種細胞進行感染，感染72小時後，用PBS將細胞洗滌3次，每次5 分鐘，然後加入100%預冷的甲醇-20°固定細胞10分鐘，再加入0.05%的1Triton χ-100 室溫處理10分鐘，加入3%的BSA四度封閉過夜，第二天用PBS將細胞洗滌3次，每次5分鐘，然後向孔中加入RBITC標記的A型流感特異的Ml單克隆抗體，或者FITC標記的抗傳染性囊病VP2的單抗，37°反應1小時，反應結束後用PBS將細胞洗滌3次，每次5分鐘，洗滌結束後在螢光顯微鏡下觀察。用抗Ml的單抗和VP2的單抗進行免疫電鏡觀察，可以看到螢光標記的病毒樣顆粒，其中抗Ml的抗體為RBITC標記，顯示橙色螢光(圖4Α)，抗VP2的抗體為FITC標記，顯示綠色螢光(圖4C)，而對照沒有螢光信號((圖4B、D)。電鏡拍片實驗操作如下將少量的純化濃縮後的似病毒顆粒樣品固定處理後，置於新製備的無負荷的塑膠/碳包被網絡格上，用數滴蒸餾水輕輕衝洗幾次後，加上2%磷鎢酸鈉溶液進行負染色。電子透視顯微鏡下觀察並拍片，如圖5所示，病毒樣顆粒的外觀及體積大小相近。
實施例5 :H5N1禽流感和傳染件囊病二價VLP免疫SPF雞60隻SPF雞購自廣東溫氏食品集團SPF雞場，各組免疫動物具體免疫實施方式見表1。2周齡的SPF雞在免疫後21天翼靜脈採血，常規分離血清。採用IDEXX公司IBD抗體ELISA檢測試劑盒檢測雞血清中IBD抗體，採用血凝抑制試驗(HI)檢測血清中H5W禽流感抗體，參照甘孟侯000 方法進行進行。結果表明，H5W禽流感和傳染性囊病二價VLPs 免疫2周齡SPF雞，免疫雞血清中既有抗H5W禽流感的抗體(表幻，也產生了傳染性囊病病毒的抗體(表3)。表1 H5W豬流感和傳染性囊病二價VLP免疫SPF雞實驗方案
組別接種材料實驗動物數(只)1VLPs+油佐劑(約1 μ g HA/只)202H5N1滅活病毒+油佐劑(約1 μ g HA/只)203PBS+油佐劑20 表2 H5N1禽流感和傳染性囊病二價VLP免疫SPF雞血清HI檢測結果
分組最後一次免疫21天後HI滴度log2196±26.8±1292±26. 5±13< 4< 2 表3 H5N1禽流感和傳染性囊病二價VLP免疫SPF雞血清IBDV抗體檢測結果
組別樣本數ELISA 滴度(0D450)1201. 036±0. 1522200. 042 土 0. 005
3200.038±0.01權利要求
1.混合病毒樣顆粒，其特徵在於，包含流感病毒的基質蛋白Ml ；流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA ；一個融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區和膜內區；所述傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5』端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。
2.如權利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的神經氨酸苷酶NA。
3.如權利要求1或2所述的混合病毒樣顆粒，其中所述混合病毒樣顆粒還含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如權利要求1所述的混合病毒樣顆粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQID N0:10所
5.禽流感和傳染性囊病二價疫苗，其特徵在於，包含如權利要求1-4所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。
6.製備混合病毒樣顆粒的方法，其特徵在於，所述方法包含以下步驟構建昆蟲杆狀病毒表達載體，其表達載體含有流感病毒的基質蛋白Ml，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，或一個融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區和膜內區；所述含傳染性囊病病毒 VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5』端的大致相同長度的膜外域；用所述構建的昆蟲杆狀病毒表達載體按比例同時感染昆蟲細胞，包裝出混合病毒樣顆粒，其表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。
7.如權利要求6製備混合病毒樣顆粒的方法，其特徵在於，其中所述構建昆蟲杆狀病毒表達載體還含有流感病毒的神經氨酸苷酶NA，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的神經氨酸苷酶NA。
8.如權利要求6或7製備混合病毒樣顆粒的方法，其特徵在於，其中所述構建昆蟲杆狀病毒表達載體還含有流感病毒的核蛋白NP，其包裝出混合病毒樣顆粒含有流感病毒的核蛋白NP。
全文摘要
本發明提供混合病毒樣顆粒包含流感病毒的基質蛋白M1，流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA，一個融合膜蛋白，其包含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要抗原表位的膜外域，流感病毒的紅細胞凝集素HA的跨膜區和膜內區；所述含傳染性囊病病毒VP2蛋白的主要表面抗原的膜外域替換流感病毒的紅細胞凝集素HA的5』端的大致相同長度的膜外域；在所述混合病毒樣顆粒的表面上同時表達流感病毒的表面抗原紅細胞凝集素HA和傳染性囊病病毒的表面抗原VP2蛋白。本發明還提供禽流感和傳染性囊病二價疫苗，包含所述的混合病毒樣顆粒和佐劑。本發明還提供製備混合病毒樣顆粒的方法。
文檔編號A61K39/295GK102373182SQ20101024867
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月9日 優先權日2010年8月9日
發明者劉大才, 曹永長, 薛春宜 申請人:中山大學