重樓薯蕷類皂苷的製備方法及其抗腫瘤藥物製劑的製作方法
2023-06-09 14:22:56 2
專利名稱：重樓薯蕷類皂苷的製備方法及其抗腫瘤藥物製劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及屬於中草藥活性成分的製備及應用技術領域，特別是涉及一種重樓薯 蕷類皂苷的製備方法及其抗腫瘤藥物製劑。
背景技術：
重樓(Rhizoma paridis)，又稱七葉一枝花，是一種百合科重樓屬植物，以蚤休之 名首載於《神農本草經》，在中藥的應用中已有上千年的歷史，並且在抗癌的中藥配方中經 常用到。重樓總皂苷是重樓多重藥理作用的主要有效成分，具有抗菌消炎、止痛鎮定和抗腫 瘤之功效。其主要活性成分留體皂苷中以薯蕷類皂苷的含量最高。薯蕷類皂苷即皂苷元為 薯蕷皂苷元，與配糖基為葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖中的一種或幾種以直鏈或支鏈形式組合 而成。近年來重樓中活性成分的製備及其抗腫瘤活性已受到眾多研究者的廣泛關注重 樓中有效成分皂苷對動物移植性腫瘤818Q、S37, EAC、ARS、L759等有明顯的抑制作用；重樓總 皂苷對H22動物移植性腫瘤生長具有影響，重樓總皂苷350mg/kg ig及10、5mg/kg ig均能 明顯抑制腫瘤細胞的生長；重樓中單體皂苷I和IV對小鼠淋巴白血病(L1210)具有細胞毒 作用等。但迄今為止尚未見到重樓薯蕷類皂苷的製備工藝以及抗腫瘤生物活性方面的研究 見諸報導。
發明內容
為了解決上述問題，本發明的目的在於提供一種方法簡單且適於工業化生產的重 樓薯蕷類皂苷的製備方法。本發明的另一個目的在於提供一種以上述重樓薯蕷類皂苷作為活性成分而製成 的抗腫瘤藥物製劑。為了達到上述目的，本發明提供的重樓薯蕷類皂苷的製備方法包括按順序進行的 下列步驟1)將重樓粉碎至顆粒狀，然後加入60%-90%的乙醇溶液，重樓與60%-90%乙醇 溶液的加入比為Ig 3-20ml，加熱回流提取1-3次，每次1-3小時，合併提取液並濃縮至每 毫升濃縮液相當於Ig生藥；2)將上述濃縮液用水或-40%的乙醇溶液稀釋1-20倍，然後將上述稀釋液通 過皂苷吸附型大孔吸附樹脂柱進行吸附，之後用水或-40%的乙醇溶液洗脫，再依次用 40% -60%,70% -90%的乙醇溶液洗脫，收集用70% -90%乙醇溶液洗脫後的洗脫液並濃 縮至相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；3)在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中加入為其重量1-3倍的矽膠並混合均勻，減壓幹 燥得拌樣矽膠；4)將上述拌樣矽膠裝入為其重量20-50倍的矽膠柱中，然後用由乙酸乙酯、二氯 甲烷中的任意一種、甲醇和乙醇中的任意一種及水而製成的混合溶劑進行洗脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含重樓薯蕷類皂苷成分的洗脫液，減壓濃縮、乾燥、粉碎，即 得粉末狀重樓薯蕷類皂苷。所述的皂苷吸附型大孔吸附樹脂為DlOl型、SP型或AB-8型。所述的重樓與皂苷吸附型大孔吸附樹脂的重量比為3 1-10 1，皂苷吸附型大 孔吸附樹脂柱的柱徑與柱高之比為1:4-1: 8。所述的步驟4)的混合溶劑中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一種、甲醇和乙醇中的 任意一種和水的體積比為72 76 18 20 4。所述的粉末狀重樓薯蕷類皂苷能夠製備成臨床上常用的固體口服製劑或液體口 服製劑。本發明提供的以上述重樓薯蕷類皂苷作為活性成分而製成的抗腫瘤藥物製劑是 由40% -60%的重樓薯蕷類皂苷和60% -40%的常用藥用輔料組成。藥用輔料為常規的藥 物賦形劑，如稀釋劑、溶劑、崩解劑、矯味劑和防腐劑等。所述的抗腫瘤藥物製劑為臨床上常用的固體口服製劑或液體口服製劑，比如片 劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、滴丸或口服液。本發明提供的重樓薯蕷類皂苷的製備方法及其抗腫瘤藥物製劑具有如下有益效 果1、本製備方法是利用醇提的方法從重樓中提取重樓薯蕷類皂苷，並利用樹脂 填料和矽膠色譜柱的結合來有效去除重樓中的糖、蛋白質及胺基酸等雜質，提取率高達 82%-88%，所以有效成分的含量高，並且工藝簡單，質量可控，因此適於工業化生產。2、提取物重樓薯蕷類皂苷成分明確，抗腫瘤作用明顯，並且能夠直接製成或與常 用輔料配合而製成抗腫瘤藥物製劑。
圖1為本發明實驗中繪製的腹水瘤小鼠生存率曲線圖。
具體實施例方式以下結合實施例詳述本發明，實施例僅用於說明，但不能限制本發明的範圍。實施例1 將Ikg重樓粉碎至顆粒狀，然後加入4升75%的乙醇溶液，加熱回流提取3次，每 次3小時，合併提取液並濃縮至IL ；將上述濃縮液用水稀釋10倍，然後將上述稀釋液通過 DlOl型大孔吸附樹脂柱進行吸附，重樓與大孔吸附樹脂的重量比為5 1，大孔吸附樹脂 樹脂柱的柱徑與柱高之比為1 8;然後依次用10升30%的乙醇溶液、8升50%的乙醇溶 液和12升80%的乙醇溶液進行洗脫，收集用80%乙醇溶液進行洗脫後的洗脫液並濃縮至 相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中加入2倍量重 的矽膠並混合均勻，減壓乾燥，得拌樣矽膠；將上述拌樣矽膠裝入為其重量30倍的矽膠柱 中，用二氯甲烷、甲醇和水的體積比為74 18 4的混合溶劑進行洗脫，用矽膠G板對洗 脫液在線進行檢測，收集含有重樓薯蕷類皂苷的洗脫液，減壓濃縮、乾燥、粉碎，即得15g棕 黃色粉末狀重樓薯蕷類皂苷，經實驗測定上述重樓薯蕷類皂苷包含了重樓中的全部薯蕷類 皂苷，其中 Formosanin 不低於 26%,Graci 11 in 不低於 14%,Polyphyllin D 不低於 38%,
4Dioscin含量不低於2%，上述這些成分的總量不低於80%實施例2 將Ikg重樓粉碎至顆粒狀，然後加入4升80%的乙醇溶液，加熱回流提取3次，每 次2小時，合併提取液並濃縮至IL ；將上述濃縮液用20%的乙醇溶液稀釋8倍，然後將上 述稀釋液通過SP825型大孔吸附樹脂柱進行吸附，重樓與大孔吸附樹脂的重量比為4 1 ； 大孔吸附樹脂樹脂柱的柱徑與柱高之比為1 7，之後依次用10升25%的乙醇溶液、7升 55%的乙醇溶液和12升75%的乙醇溶液進行洗脫，收集用75%乙醇溶液進行洗脫後的洗 脫液並濃縮至相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中 加入3倍量重的矽膠並混合均勻，減壓乾燥，得拌樣矽膠；將上述拌樣矽膠裝入為其重量40 倍的矽膠柱中，用乙酸乙酯、甲醇和水的體積比為76 20 4的混合溶劑中的下層溶劑 進行洗脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含有重樓薯蕷類皂苷的洗脫液，減壓濃 縮、乾燥、粉碎，即得15g棕黃色粉末狀重樓薯蕷類皂苷，經實驗測定上述重樓薯蕷類皂苷 包含了重樓中的全部薯蕷類皂苷，其中Formosanin不低於26%，Gracillin不低於14%， Polyphyllin D不低於38%，Dioscin含量不低於2%，上述這些成分的總量不低於80%.實施例3 將Ikg重樓粉碎至顆粒狀，然後加入3升85%的乙醇溶液，加熱回流提取3次，每 次3小時，合併提取液並濃縮至IL ；將上述濃縮液用25%的乙醇溶液稀釋7倍，然後將上 述稀釋液通過AB-8型大孔吸附樹脂柱進行吸附，重樓與大孔吸附樹脂的重量比為3 1 ； 大孔吸附樹脂樹脂柱的柱徑與柱高之比為1 6，之後依次用10升30%的乙醇溶液、8升 50 %的乙醇溶液和12升80 %的乙醇溶液進行洗脫，收集用80 %乙醇溶液進行洗脫後的洗 脫液並濃縮至相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中 加入3倍量重的矽膠並混合均勻，減壓乾燥，得拌樣矽膠；將上述拌樣矽膠裝入為其重量30 倍的矽膠柱中，用二氯甲烷、乙醇和水的體積比為74 18 4的混合溶劑中的下層溶劑 進行洗脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含有重樓薯蕷類皂苷的洗脫液，減壓濃 縮、乾燥、粉碎，即得15g棕黃色粉末狀重樓薯蕷類皂苷，經實驗測定上述重樓薯蕷類皂苷 包含了重樓中的全部薯蕷類皂苷，其中Formosanin不低於26%，Gracillin不低於14%， PolyphyllinD不低於38%，Dioscin含量不低於2%，上述這些成分的總量不低於80%。實施例4 將Ikg重樓粉碎至顆粒狀，然後加入6升70%的乙醇溶液，加熱回流提取2次，每 次2小時，合併提取液並濃縮至IL ；將上述濃縮液用30%的乙醇溶液稀釋8倍，然後將上述 稀釋液通過DlOl型大孔吸附樹脂柱進行吸附，重樓與大孔吸附樹脂的重量比為6 1;大 孔吸附樹脂樹脂柱的柱徑與柱高之比為1 8，之後依次用10升35%的乙醇溶液、6升50% 的乙醇溶液和12升85%的乙醇溶液進行洗脫，收集用85%乙醇溶液進行洗脫後的洗脫液 並濃縮至相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中加入 2倍量重的矽膠並混合均勻，減壓乾燥，得拌樣矽膠；將上述拌樣矽膠裝入為其重量40倍的 矽膠柱中，用乙酸乙酯、乙醇和水的體積比為74 20 4的混合溶劑中的下層溶劑進行洗 脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含有重樓薯蕷類皂苷的洗脫液，減壓濃縮、幹 燥、粉碎，即得15g棕黃色粉末狀重樓薯蕷類皂苷，經實驗測定上述重樓薯蕷類皂苷包含了 重樓中的全部薯蕷類皂苷，Formosanin不低於26%，Gracillin不低於14%，PolyphyllinD不低於38%，Dioscin含量不低於2%，上述這些成分的總量不低於80%。實施例5 將Ikg重樓粉碎至顆粒狀，然後加入4升90%的乙醇溶液，加熱回流提取3次，每 次3小時，合併提取液並濃縮至IL ；將上述濃縮液用10%的乙醇溶液稀釋9倍，然後將上 述稀釋液通過SP825型大孔吸附樹脂柱進行吸附，重樓與大孔吸附樹脂的重量比為7 1 ； 大孔吸附樹脂樹脂柱的柱徑與柱高之比為1 9，之後依次用10升40%的乙醇溶液、5升 60 %的乙醇溶液和12升85 %的乙醇溶液進行洗脫，收集用85 %乙醇溶液進行洗脫後的洗 脫液並濃縮至相對密度為1. 2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中 加入3倍量重的矽膠並混合均勻，減壓乾燥，得拌樣矽膠；將上述拌樣矽膠裝入為其重量30 倍的矽膠柱中，用二氯甲烷、甲醇和水的體積比為76 20 4的混合溶劑中的下層溶劑 進行洗脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含有重樓薯蕷類皂苷的洗脫液，減壓濃 縮、乾燥、粉碎，即得15g棕黃色粉末狀重樓薯蕷類皂苷，經實驗測定上述重樓薯蕷類皂苷 包含了重樓中的全部薯蕷類皂苷，其中Formosanin不低於26%，Gracillin不低於14%， Polyphyllin D不低於38%，Dioscin含量不低於2%，上述這些成分的總量不低於80%.實施例6 將上述實施例中製成的16g重樓薯蕷類皂苷與24g微晶纖維素混合均勻，然後加 入交聯聚維酮1.2g，用乙醇水溶液製成軟材，過20目篩制顆粒，60°C下乾燥1小時，整粒，之 後加入Ig硬脂酸鎂，混勻，壓片，即可製得100片重樓薯蕷類皂苷抗腫瘤片劑。實施例7 將上述實施例中製成的20g重樓薯蕷類皂苷與IOg乳糖和IOg糊精混合均勻，然 後加入3%交聯聚維酮1. 5g，用3%聚維酮乙醇水溶液製成顆粒，60°C下乾燥1小時，整粒， 之後加入Ig滑石粉，混勻，填充膠囊，即可製得150粒重樓薯蕷類皂苷抗腫瘤膠囊劑。實施例8 將上述實施例中製成的15g重樓薯蕷類皂苷與IOg聚乙二醇-6000混合均勻，加 熱使其熔融，然後移至滴丸滴罐中，將藥液滴至6 8°C的液體石蠟中，除油，即可製得300 粒重樓薯蕷類皂苷抗腫瘤滴丸。利用本發明提供的製備方法製成的重樓薯蕷類皂苷具有治療惡性實體瘤的作用， 其藥理作用可通過以下藥效學實驗得以驗證。一、重樓薯蕷類皂苷對腫瘤細胞體外增殖的抑制作用(1)實驗材料細胞株小鼠肺腺癌細胞株LA795，人肺腺癌細胞株A549，人結腸癌細胞株CaCo-2，人肝癌 細胞株BEL7402，人肝癌細胞株H印G2，人宮頸癌細胞Hela，人表皮癌A431，人急性髓性白血 病細胞HL-60，人腎腺癌細胞株A498，皆由中國協和醫科大學基礎醫學研究所提供。試劑重樓皂苷標準品皆由本發明申請人提取分離得到(純度>95%)。順鉬注射用粉 針劑由齊魯製藥有限公司生產，分子量為300。儀器細胞培養箱、酶標儀
(2)實驗方法將對數生長期細胞用胰酶消化後配製成一定濃度的細胞懸液(其中，LA795細胞 為 3 X IO4 個 /mL, A549 細胞為 2 X IO4 個 /mL, CaCo-2 細胞為 5 X IO4 個 /mL, BEL7402 細胞為 2X103f/mL，!fepG2 細胞為 1 X IO5 個/mL，Hela 細胞為 5 X IO4 個/mL，A431 細胞為 IXlO5 個/mL，HL-60細胞為2X IO5個/mL，A498細胞為1 X IO4個/mL)，接種於96孔酶標板，每 孔200 μ L。24h後換不含血清的培養液使細胞同步化生長，每孔200 μ L。24h後(第三天) 加入含不同濃度皂苷(二甲基亞碸作為溶劑，終濃度 Α549 > Hela > CaCo-2 > HL-60 > A498 > A431 > HepG2 > BEL7402。結果表明重樓薯蕷類皂苷 在體外對腫瘤細胞的生長具有明顯的抑制作用。二、重樓薯蕷類皂苷對小鼠LA795肺腺癌移植性腫瘤抑制率的影響將肺腺癌LA795瘤組織於無菌條件下接種於50隻裸小鼠右側腋窩皮下。用遊標 卡尺測量裸小鼠移植瘤直徑，待腫瘤生長至100-300mm3時，將上述小鼠隨機分為5組，每組 10隻(1)重樓薯蕷類皂苷高劑量組:100mg/kg · bw(bw代表body weight)灌胃；(2)重樓 薯蕷類皂苷中劑量組，60mg/kg*bw灌胃；(3)重樓薯蕷類皂苷低劑量組，30mg/kg*bw灌胃； (4)環磷醯胺組，20mg/kg*bw腹腔注射；(5)生理鹽水組，灌胃。每隻0.2ml，使用測量瘤徑 的方法動態觀察被試物抗腫瘤效應。腫瘤直徑的測量次數為每周2次，給藥前及每次測量 前分別稱鼠重。腫瘤體積(TV)的計算公式為TV= l/2XaXb2(a、b分別表示長寬)。根據測量結果計算出相對腫瘤體積(RTV)，計算公式為RTV = YJY0 (V0即分籠給藥時測量所得 腫瘤體積，Vt為給藥後每一次測量時的腫瘤體積)。抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增 殖率 T/C(% )，計算公式如下:T/C(% ) = Tetv^CetvX 100% (其中 Tetv 治療組 RTV ；Cetv 陰 性對照組RTV)，重樓薯蕷類皂苷對人肺腺癌裸小鼠移植瘤LA795的實驗性治療影響結果見表2。表2重樓薯蕷類皂苷對人肺腺癌裸小鼠移植瘤LA795的實驗性治療影響 與生理鹽水對照組比較*p < 0. 05。三、重樓薯蕷類皂苷對腹水瘤小鼠生存率的影響在無菌條件下取S180腹水瘤細胞懸液，用生理鹽水稀釋、計數，調配成細胞濃度 為IXio7AiL的細胞懸液，在冰浴條件下將上述細胞懸液接種於30隻健康小鼠的腹腔內， 每隻0. 2mL,接種濃度為2X 106/mL。接種3天後將上述30隻小鼠隨機分為3組，每組10 只，開始給藥，每日1次模型組，灌服生理鹽水，每隻0. 2ml ；順鉬組，按2mg/kg -bw腹腔注 射；重樓薯蕷皂苷組，經口給藥，劑量30mg/kg · bw，觀察小鼠的狀態及死亡情況，計數小鼠 的剩餘只數。將上述實驗數據利用統計學方法進行分析(見圖1)，結果表明重樓薯蕷類皂 苷能夠明顯提高腹水瘤小鼠的生存率。
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權利要求
一種重樓薯蕷類皂苷的製備方法，其特徵在於所述的重樓薯蕷類皂苷的製備方法包括按順序進行的下列步驟1)將重樓粉碎至顆粒狀，然後加入60％ 90％的乙醇溶液，重樓與60％ 90％乙醇溶液的加入比為1g∶3 20ml，加熱回流提取1 3次，每次1 3小時，合併提取液並濃縮至每毫升濃縮液相當於1g生藥；2)將上述濃縮液用水或1％ 40％的乙醇溶液稀釋1 20倍，然後將上述稀釋液通過皂苷吸附型大孔吸附樹脂柱進行吸附，之後用水或1％ 40％的乙醇溶液洗脫，再依次用40％ 60％、70％ 90％的乙醇溶液洗脫，收集用70％ 90％乙醇溶液洗脫後的洗脫液並濃縮至相對密度為1.2的重樓薯蕷類皂苷粗品溶液；3)在上述薯蕷類皂苷粗品溶液中加入為其重量1 3倍的矽膠並混合均勻，減壓乾燥得拌樣矽膠；4)將上述拌樣矽膠裝入為其重量20 50倍的矽膠柱中，然後用由乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一種、甲醇和乙醇中的任意一種及水而製成的混合溶劑進行洗脫，用矽膠G板對洗脫液在線進行檢測，收集含重樓薯蕷類皂苷成分的洗脫液，減壓濃縮、乾燥、粉碎，即得粉末狀重樓薯蕷類皂苷。
2.根據權利要求1所述的重樓薯蕷類皂苷的製備方法，其特徵在於所述的皂苷吸附 型大孔吸附樹脂為DlOl型、SP型或AB-8型。
3.根據權利要求1所述的重樓薯蕷類皂苷的製備方法，其特徵在於所述的重樓與皂 苷吸附型大孔吸附樹脂的重量比為3 1-10 1，皂苷吸附型大孔吸附樹脂柱的柱徑與柱 高之比為1:4-1: 8。
4.根據權利要求1所述的重樓薯蕷類皂苷的製備方法，其特徵在於所述的步驟4)的 混合溶劑中乙酸乙酯、二氯甲烷中的任意一種、甲醇和乙醇中的任意一種和水的體積比為 72 76 18 20 4。
5.根據權利要求1所述的重樓薯蕷類皂苷的製備方法，其特徵在於所述的粉末狀重 樓薯蕷類皂苷能夠製備成臨床上常用的固體口服製劑或液體口服製劑。
6.一種以權利要求1所述的重樓薯蕷類皂苷作為活性成分而製成的抗腫瘤藥物製劑， 其特徵在於所述的抗腫瘤藥物製劑是由40% -60%的重樓薯蕷類皂苷和60% -40%的常 用藥用輔料組成。
7.根據權利要求6所述的抗腫瘤藥物製劑，其特徵在於所述的抗腫瘤藥物製劑為臨 床上常用的固體口服製劑或液體口服製劑。
全文摘要
本發明公開了一種重樓薯蕷類皂苷的製備方法及其抗腫瘤藥物製劑。其中重樓薯蕷類皂苷的製備方法是利用醇提的方法從重樓中提取重樓薯蕷類皂苷，並利用樹脂填料和矽膠色譜柱的結合來有效去除重樓中的糖、蛋白質及胺基酸等雜質，提取率高達82％-88％，所以有效成分的含量高，並且工藝簡單，質量可控，因此適於工業化生產。另外，提取物重樓薯蕷類皂苷成分明確，抗腫瘤作用明顯，並且能夠直接製成或與常用輔料配合而製成抗腫瘤藥物製劑，製劑中含有40％-60％的重樓薯蕷類皂苷和60％-40％的常用藥用輔料。
文檔編號A61K36/896GK101904968SQ201010238258
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者楊柳, 滿淑麗, 王潔銀, 高文遠 申請人:天津大學