檢測產生oxa-048碳青黴烯酶的細菌的方法

2023-06-10 04:52:26

檢測產生oxa-048碳青黴烯酶的細菌的方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測和/或特異性鑑別生物學樣品中產生OXA-048型碳青黴烯酶的細菌的方法，所述方法包括如下步驟：a)將可能含有所述細菌的生物學樣品與反應培養基接觸，所述培養基包含用於檢測酶活性的至少一種生色底物及濃度等於或大於150mg/L的替莫西林，優選濃度為200-500mg/L，b)將所述樣品在培養基中保溫以使得細菌生長，及c)檢測相應於產生OXA-48碳青黴烯酶的細菌的菌株。本發明還涉及步驟a)中使用的培養基。
【專利說明】檢測產生0XA-048碳青黴烯酶的細菌的方法
[0001] 本發明涉及微生物學分析領域。更具體地，本發明涉及檢測和/或鑑別產生 0XA-48碳青黴烯酶的細菌的方法。
[0002] 0-內醯胺抗生素類型如青黴素和頭孢菌素類藥物的抗生素抗性增加使得治療由 革蘭氏陰性菌株導致的感染變得複雜。這些抗生素因此被其它廣譜抗微生物製劑代替。碳 青黴烯在這些廣譜抗微生物製劑中發揮重要作用，特別是在治療住院患者中。碳青黴烯對 於大多數革蘭氏陽性和革蘭氏陰性需氧菌及對於某些厭氧菌起作用。
[0003] 然而，在住院患者中出現增加數目的碳青黴烯抗性菌株。此外，需要快速檢測呈現 出碳青黴烯酶活性的菌株，以在適當情況中進行抗生素治療，使得可以適當地治療感染，並 用以鑑別攜帶者以降低這些菌株在護理中心增殖的危險。
[0004] 0 -內醯胺酶是導致0 -內醯胺抗生素抗性的細菌性酶，其命名不完全是標準化 的。其基於其一級原始結構可以分為四種分子類別（A-D) (Ambler分類），或者基於靶向的 底物及其對抑制劑的抗性按功能分組（參見BushandJacoby,AntimicrobialAgentsand Chemotherapy, 2010 ；54(3):969-976)〇
[0005]碳青黴稀抗性細菌非限制性地是：大腸桿菌（Escherichia coli)、陰溝腸 桿菌（Enterobacter cloacae)、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、朽1 樣酸杆 菌（Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、臭鼻克雷伯菌 (Klebsiella oxytoca)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)、嗜麥芽寡養單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii)、叢毛單胞 菌（Comamonas sp.)、產氣單胞菌（Aeromonas sp.)、摩氏摩根菌（Morganella morganii)、 腸球菌（Enterococcus sp.)、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis)、森夫頓堡沙門氏菌 (Salmonella senftenberg)、粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)、鼠傷寒沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium)等。
[0006] 這些細菌可產生能水解碳青黴烯的各種類型的e-內醯胺酶或者碳青黴烯酶。碳 青黴烯酶是非常廣譜的內醯胺酶，能失活幾乎所有內醯胺抗生素。根據Ambler分 類法將其概括地分為三個類別：
[0007] A類，也稱作絲氨酸碳青黴烯酶，特徵在於通過克拉維酸及硼酸的衍生物的可變抑 制。主要的代表物是KPC酶；
[0008]B類，也稱作金屬-碳青黴烯酶，特徵在於通過陽離子螯合劑如EDTA的抑制。主要 的代表物是NDM、VM和MP酶；
[0009]D類，其相應於0XA-型0-內醯胺酶，其中是變體0XA-48,其具有擁有碳青黴烯酶 活性的特性。儘管不是常見的，但是存在通過點突變從0XA-48中衍生的其它變體，其保留 這種碳青黴烯酶活性。可以提及的是OXA-162、OXA-163、OXA-181、0XA-204和0XA-232。 [0010]金屬_內醯胺酶（MBL)和肺炎克雷伯菌碳青黴烯酶（KPC)在腸桿菌中是普遍 存在的，更特別是在北美洲、南美洲、以色列、義大利、希臘、印度、中國和巴基斯坦。苯唑西 林酶-48((^3(：;[11;[1^86-48,0乂4-48)最近在土耳其、地中海盆地和在西歐已經分離。
[0011] 碳青黴烯酶基因能存在於染色體和/或質粒中。由於在質粒形式中的這種存在， 這些酶促類型抗性能非常明顯地傳播及因此在流行病學方面存在重大危險。
[0012] 為了檢測和/或鑑別碳青黴烯-抗性菌株，可以使用分子生物學技術，其是非常靈 敏的並具有可以快速鑑別產生碳青黴烯酶的腸桿菌菌株的優勢。然而，這些方法是昂貴且 複雜的，大多數實驗室中通常還不具備。
[0013]為了篩選、檢測和/或鑑別產生碳青黴烯酶的腸桿菌（CPE)，本領域技術人員熟知 基於培養的方法。這些方法是基於依次在通過加入碳青黴烯或者在產生示出碳青黴烯非敏 感性抗菌譜之後而變為選擇性的Mac-Conkey瓊脂型常規培養基上或者在胰蛋白酶解的大 豆肉湯中分離。在適當的情況中，可以使用浸漬了碳青黴稀或Etest?strips(bioM6rieux) 的培養皿。通過補加檢測證實碳青黴烯酶的存在是必要的，可以提及的檢測是：修改的Hodge檢測（CLSIM10〇-S22:PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-SecondInformationalSupplement.January2012.Supplemental Table2A-S2)，及在瓊脂中的擴散（或者組合的培養皿）協同檢測，使用與碳青黴烯組合 的抑制劑，例如對於B類碳青黴烯酶的EDTA，對於檢測A類碳青黴烯酶的苯硼酸。Rosco 公司提議一種多皿式方法以使用分離的菌株檢測產生碳青黴稀酶的細菌（BioConnections KPC+MBLConfirmIDkit)，並建議加入包含30yg替莫西林的培養皿以檢測0XA-48酶的 存在。然而，這個檢測示出替莫西林不抑制所有的KPC、AmpC和MBL菌株，因此其自身不能 特異性檢測0XA-48菌株。
[0014] 因此。現有技術不能特異性檢測OXA-48CPE，需要三天的較長應答時間。此外，就 預防多重抗性細菌感染而言，這些技術不太適於搜索用於尋找攜帶者的糞便或直腸樣品中 的CPE。
[0015]其它方法使用商業生色培養基如&'illianceCRE培養基（Oxoid?)、 CHROVIagar?KPC培養基（CHROMagar?,Paris,France)、ColorexKPC等價培養基 (BiomedDiagnosticsInc.)，或者 申請人:的chromlDCR)ESBL或chromlD?CARBA培養 基。後者的培養基證實能檢測參考OXA-48菌株，但是條件是接種物量大（大約107CFU/ ml)。已經描述了另一培養基（SuperCarba(Nordmannetal.，2012,J.Clin.Microbiol.，in press))，其能可靠地檢測產生OXA-48的CPE，然而不能鑑別或特異性檢測，因為產生其它 類型碳青黴烯酶的細菌不被抑制。此外，這種培養基具有非常短的保存期限（大約一周） 的缺點，這很大程度地限制其常規使用及其工業化。
[0016] 因此，這些方法無一是同時足夠敏感地、特異性地和快速地檢測0XA-48菌株，並 且還沒有提出改良的解決方案。由於0XA-48菌株的檢測在臨床和流行病學方面是確實感 興趣的，因此仍然需要克服這個領域中現有培養基的缺點。
[0017] 在此方面，本發明涉及一種特異性檢測和/或鑑別生物學樣品中產生0XA-48碳青 黴烯酶的細菌的方法，所述方法包括如下步驟：
[0018] a)使可能含有所述細菌的生物學樣品與反應培養基接觸，所述培養基包含濃度高 於或等於150mg/L、優選200-500mg/L的替莫西林及可以檢測特異性酶活性的生色底物，
[0019] b)保溫全部的混合物，以使得細菌生長，及
[0020] c)檢測相應於產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌的菌株。
[0021] 實際上，本 申請人:的研宄已經令人驚奇地示出高於或等於150mg/L的高濃度的替 莫西林可以特異性區分OXA-48CPE。優選地，使用的替莫西林的濃度為150-500mg/L。因 此，本發明的方法可以敏感性、特異性及快速地檢測（通常少於24小時）0XA-48CPE，同時 具有使用即用型培養基的優勢，所述培養基具有較長的保存期限，使其可以工業化。有利 地，本發明的方法也可以鑑別菌株。
[0022] 替莫西林是替卡西林的6-a_甲氧基衍生物，其自身是青黴素，有時與克拉維酸 組合使用。本文描述了針對多重抗性的腸桿菌科細菌的另一種治療。
[0023] 體外易感性測試已經由Livermoreetal.(InternationalJournalof AntimicrobialAgents, 2011 ;37:415_419)進行。他們表明最小抑制濃度（MIC) ^ 256mg/ L，本領域技術人員對此的解釋為，所檢測的細菌可生長的最終測試替莫西林濃度為128mg/ L。這些測試因此示出18/19的0XA-48菌株和32/35的具有金屬-碳青黴烯酶的菌株對替 莫西林具有抗性。這樣阻止了本領域技術人員在特異性檢測0XA-48的培養基中使用替莫 西林。
[0024] 給出以下定義以更清楚地理解本發明。
[0025] 術語"生物學樣品"是指分離的小部分或少量實體以進行分析。這個樣品可以是 人或動物臨床樣品，得自生物學液體樣品，或者是食物樣品，得自任何類型食物，或者是得 自食物生產或運輸環境的樣品。這個樣品因此可以是液體或固體。可以提及的非限制性的 是全血、血清、血漿、尿液、糞便或腦脊液的臨床樣品，或者是鼻、咽喉、皮膚、直腸或傷口樣 品，食物樣品，來自水、飲料如牛奶或果汁、來自酸奶、肉類、蛋類、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等， 食物樣品，得自動物飼料如特別是得自動物肉的樣品，或者地表或水處理樣品。優選地，根 據本發明，所述樣品是臨床樣品。
[0026] 樣品可以現狀使用或者在分析前可以經歷富集、稀釋、提取、濃縮和/或純化等制 備，根據本領域技術人員已知的方法製備。
[0027] 術語"反應培養基"是指包含為代謝物表達和/或微生物生長所需的所有成分的 培養基。反應培養基可以是固體、半固體或者液體。術語"固體培養基"是指例如凝膠或 瓊脂培養基。瓊脂是在微生物學中培養微生物的常規膠凝劑，但是可以單獨或組合使用 明膠、瓊脂糖或其它天然或人工膠凝劑。某些製備物是可以商購的，例如Columbia瓊脂、 胰蛋白酶消化的大豆瓊脂、Mac Conkey瓊脂、Mueller Hinton瓊脂，或者在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述的更通常的那些瓊脂。
[0028] 反應培養基可包含一或多種元件組合，如胺基酸、蛋白腖、碳水化合物、核苷酸、礦 物質、維生素等。所述培養基也可包含染料。例如可以提及的染料是Evans藍、中性紅，綿 羊血、馬血，遮光劑如氧化鈦或高嶺土，硝基苯胺，孔雀綠，亮綠，或者一或多種代謝指示物， 一或多種代謝調節物等。
[0029] 反應培養基可以是展示培養基或者是培養和展示培養基。在第一種情況中，微生 物的培養在接種之前進行；在第二種情況中，培養基還包含檢測和/或鑑別培養基。鑑別是 指微生物在感興趣的種或群中的分類。
[0030] 本領域技術人員也可以使用雙平板或者包含兩個隔室的Petri型培養皿，使得可 以容易地對比包含不同底物或者不同的選擇性混合物的兩個培養基，其上已經沉積了相同 的生物學樣品。
[0031] 反應培養基可包含一或多種選擇劑。術語"選擇劑"是指能阻止或減緩除了靶微 生物之外的微生物生長的任何化合物。非限制性地，濃度在0. 〇lmg/L-5g/L之間特別適於 本發明。
[0032] 作為選擇劑，可以提及的是抗生素、抗真菌劑、膽鹽、結晶紫、鹼性品紅、亮綠、表面 活性劑如Tergitol?等。術語"抗生素"是指能阻止或減緩細菌生長的任何化合物。它們 特別屬於內醯胺抗生素、糖肽、氨基糖苷、多肽、磺胺、喹諾酮類。例如可以特別提及的 抗生素是羧苄青黴素、替卡西林、替莫西林、福米西林、頭孢噻肟、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢 西丁、頭孢曲松、頭孢泊汙、氨曲南、厄他培南、法羅培南、多利培南、萬古黴素、慶大黴素、甲 氧苄啶、託普黴素、拉氧頭孢、磷黴素、D-環絲氨酸、多粘菌素、粘菌素、喹諾酮類如萘啶酸。
[0033] 術語"抗真菌劑"是指能阻止或減緩酵母或黴菌生長的任何化合物。例如可以特 別提及的是兩性黴素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、放線菌酮和氟胞嘧啶。
[0034] 術語"生色底物"是指可以通過直接或間接可檢測信號檢測靶微生物的酶或代 謝活性的底物。對於直接檢測，這種底物可以與作為標記的成分結合，其是螢光或有色的 (Orengaetal.，2009 ;J.Microbiol.Methods;79 (2) : 139-55)。對於直接檢測，本發明的反 應培養基可另外包含pH指示劑，其對由於底物的消耗所致pH變化敏感及展示靶微生物的 代謝。所述pH指示劑可以是生色團或者螢光團。生色團例如可以提及的是溴甲酚紫、溴百 裡酚藍、中性紅、苯胺藍和溴甲酚藍。螢光團包含例如4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物或 者試滷靈衍生物。
[0035] 根據本發明，生色底物優選選自基於如下基團的底物：吲哚酚（3-吲哚 酚、5-溴-3-吲哚酚、5-碘-3-吲哚酚、4-氯-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-3-吲哚酚、 5_溴-6-氯-3-吲哚酚、6-溴-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、6-氟-3-吲哚酚、 5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚酚、N-甲基-3-吲哚酚、Aldol?等）；傘形酮（4-甲基 傘形酮，環己烯七葉亭等）；茜素；P-萘酚苯；硝基酚（正-硝基酚，對-硝基酚等）；羥 基喹啉；cathecol(cathecol，二輕基黃酮，輕基黃酮等）；試滷靈；氯酷紅；焚光素；氨基 苯酷（對-氨基苯酷，二氯氨基苯酷等）；萘酷（a-萘酷，2_萘酷，萘酷-ASBI等）；氨 基香豆素（7-氨基-4-甲基香豆素等）；萘基醯胺；吖啶（氨基苯基吖啶等）；氨基吩噁 嗪（氨基苯並吩噁嗪，氨基戊基試滷靈等）；氨基苯乙烯基化合物（氨基苯乙烯基喹啉， aminostyryllepidinium等）。
[0036] 例如，由生色底物靶向的酶活性可以屬於水解酶類，優選苷酶、酯酶或者肽酶類。 優選地，由生色底物靶向的酶活性選自：葡糖苷酸酶、半乳糖苷酶、核糖苷酶、酯酶、硫酸酯 酶、磷脂酶、氨基肽酶和脫氨酶。
[0037] 例如，用於檢測葡糖苷酸酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-葡糖 苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸，5-溴-6-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸， 6_氯-3-吲哚基-0 -葡糖苷酸，Aldol?- 0 -葡糖苷酸，茜素-0 -葡糖苷酸，環己烯七葉 亭-0-葡糖苷酸，或者其鹽。
[0038] 用於檢測半乳糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-半乳糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-0 -半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-0 -半乳糖苷，6-氯-3-吲 哚基-0 _半乳糖苷，Aldol?- 0 -半乳糖苷，茜素-0 -半乳糖苷，環己烯七葉亭-0 -半乳 糖苷，或者其鹽。
[0039] 用於檢測a_半乳糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-a_半乳糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-a-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-a-半乳糖苷，6-氯-3-吲 哚基-a-半乳糖苷，或者其鹽。
[0040] 用於檢測葡糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-葡糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-葡糖苷， 5_漠_6_氣_3_卩引噪基-13 -匍糖昔，6_氣_3_卩引噪基-13 -匍糖昔，A1do1?-13 -匍糖昔，茜 素-0 _葡糖苷，環己烯七葉亭-0 _葡糖苷，硝基苯基-0 _葡糖苷，二氯氨基苯基葡糖苷， 或者其鹽。
[0041] 用於檢測a-葡糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-a-葡糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-a-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-a-葡糖苷， 5_漠_6_氣_3_H引噪基-a-匍糖昔，6_氣_3_H引噪基-a-匍糖昔，硝基苯基-a-匍糖昔， 或者其鹽。
[0042] 用於檢測核糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-核糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-0 -核糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-0 -核糖苷，6-氯-3-吲哚 基-|3 -核糖苷，茜素-|3 -核糖苷，硝基苯基-|3 -核糖苷，或者其鹽。
[0043] 例如，用於檢測酯酶活性的底物可特別是飽和或不飽和的線性脂肪酸的酯，具 有6-14個碳原子，優選具有7-9個碳原子，及4-甲基傘形酮、5-溴-4-氯-3-吲噪酷、 5_溴-6-氯-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚基或者茜素的酯，或者其鹽。優選 地，其選自4-甲基傘形酮辛酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚 辛酸酯，6-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-3-吲哚基辛酸酯或者茜素辛酸酯。
[0044] 用於檢測磷脂酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-磷脂醯肌醇，4-甲基傘形 酮-磷脂醯膽鹼，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂醯肌醇，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂醯 膽鹼，硝基苯基-磷脂醯肌醇，硝基苯基-磷脂醯膽鹼，或者其鹽。
[0045] 用於檢測氨基肽酶活性的底物可特別是L-丙氨醯-7-醯胺-4-甲基香豆 素，L-丙氨醯二氯醯胺苯基，L-丙氨醯-7-醯胺-1-戊基phenoxazinone，L-丙氨 酉先-4-amidostyrylquinaldinium，或者其鹽。
[0046] 用於檢測脫氨酶活性的底物可特別是L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-組 氨酸。
[0047] 用於檢測硫酸酯酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮硫酸酯，5-溴-4-氯-3-吲 哚酚硫酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚硫酸酯，3-吲哚酚硫酸酯，酚酞二硫酸酯，或者其鹽。
[0048] 優選地，生色底物選自：5_溴-4-氯-3-吲哚酚-0-D-吡喃葡萄糖苷（X-葡 糖苷），5-溴-6-氯-3-卩引噪酷-13 -D-半乳糖苷（Magenta|3 -Gal)，6-氯-3-卩引噪 酷-13 -D-葡糖苷酸（Pink-13 -Gur)，5-溴-4-氯-3-n引噪酷-N-甲基-13 -D-R比喃葡萄糖苷 (GreenA--Glu)，甲基--D-吡喃葡萄糖苷（甲基--D-葡糖苷），乳糖和L-色氨酸。
[0049]反應培養基也可以含有至少一種EDTA型陽離子螯合劑，以複合是B類碳青黴烯酶 輔因子的鋅，因此促進其抑制作用並因此能恢復內醯胺抗生素如替莫西林的活性。有 利地，EDTA濃度在1. 0-2. 5mmol/L之間。
[0050] 可以提及的其它螯合劑是：吡啶二羧酸，2-巰基乙醇及鄰二氮雜菲衍生物。
[0051] 術語"保溫"是指在適當溫度，通常在20-50°C之間，優選30-40°C維持1-48小時， 優選4-24小時，更優選16-24小時。
[0052] 術語"檢測"是指用裸眼或者使用光學或數字儀器辨識靶細菌生長的尺度。有利 地，當使用的培養基包含生色底物時，所述檢測也可以對靶細菌進行分類鑑別。對於螢光底 物及對於生色底物，檢測是用裸眼或者使用光學或數字儀器進行。
[0053] 術語"特異性"是指當尋找的細菌菌株不存在時，所述方法或反應培養基提供陰性 結果的能力。換句話說，根據本發明，更特異性的鑑別相應於與不表達0XA-48碳青黴烯酶 的菌株相關的假陽性數降低，而不是指抑制所有這些菌株。
[0054] 術語"敏感性"是指當尋找的細菌菌株存在於樣品中時提供陽性結果的能力。
[0055] 因此，本發明涉及一種特異性檢測和/或鑑別生物學樣品中產生0XA-48碳青黴烯 酶的細菌的方法，所述方法包括如下步驟：
[0056]a)將可能含有所述細菌的生物學樣品與反應培養基接觸，所述培養基包含生色底 物及濃度高於或等於150mg/L、優選濃度為200-500mg/L的替莫西林，
[0057] b)保溫全部的混合物，以使得細菌生長，及
[0058] c)檢測相應於產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌的菌株。
[0059] 有利地，生色底物使得可以檢測酶活性及鑑別檢測的細菌。
[0060] 有利地，所述反應培養基是培養基。
[0061] 根據本發明的一個特定的實施方案，步驟a)中使用的反應培養基還包含EDTA型 的二價陽離子螯合劑，優選濃度在1. 0-2. 5mM之間。
[0062] 根據本發明的一個特定的實施方案，步驟a)中使用的培養基包含至少一種其它 生色底物，其可以檢測酶活性。
[0063] 優選地，檢測的以可以鑑別細菌的酶活性選自酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶和葡糖 苷酸酶活性。
[0064] 優選地，能產生0XA-48碳青黴烯酶的靶細菌是腸桿菌科細菌。
[0065] 有利地，本發明的方法組合兩種反應培養基，一種包含至少一種生色底物和替莫 西林，另一種包含至少一種生色底物和碳青黴烯，優選法羅培南。優選地，兩個隔室的Petri 型培養皿，也稱作雙平板，可以組合這兩種培養基。在保溫後存在的菌落的對比可以鑑別相 應於碳青黴烯抗性的菌株和/或產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌。
[0066] 本發明還涉及即用型培養基以特異性檢測和/或鑑別產生0XA-48碳青黴烯酶的 腸桿菌科細菌，其包含：
[0067] ?營養性瓊脂培養基，適於腸桿菌科細菌的生長，
[0068] ?替莫西林，濃度高於或等於150mg/L，優選濃度為200-500mg/L，及
[0069] ?至少一種生色底物。
[0070] 有利地，所述培養基還包含EDTA型二價陽離子螯合劑，優選濃度為1. 0-2. 5mM。
[0071] 最後，本發明涉及在瓊脂或液體反應培養基中使用替莫西林，濃度高於或等於 150mg/L，優選濃度為200-500mg/L，以特異性檢測和/或鑑別可能包含於生物學樣品中的 產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌。
[0072] 對於本發明，在存在樣品的條件下，替莫西林在反應培養基中是均相的。替莫西林 未浸漬在培養皿或試紙條上或是沉積在反應培養基上或之中的另一單獨的容器上。
[0073] 下文揭示的實施例的目的是便於理解本發明。這些實施例只是例證本發明而不限 制本發明的範圍。
[0074]實施例1:針對一組CPE菌株確定替莫西林的MIC(使用瓊脂稀釋方法）
[0075] 使用的菌株集合：
【權利要求】
1. 一種特異性檢測和/或鑑別生物學樣品中產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌的方法，所 述方法包括如下步驟： a) 使可能含有所述細菌的生物學樣品與反應培養基接觸，所述培養基包含使得可以 檢測酶活性的至少一種生色底物以及濃度為高於或等於150mg/L的替莫西林、優選濃度為 200_500mg/L， b) 保溫全部的混合物以使得細菌生長，及 c) 檢測相應於產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌的菌株。
2. 權利要求1的方法，其中在步驟a)中使用的培養基還包含EDTA型二價陽離子螯合 劑，優選濃度為1. 0-2. 5mmol/L。
3. 權利要求1或2的方法，其中可能存在於樣品中的細菌是腸桿菌科細菌。
4. 權利要求2或3的方法，其中在步驟a)中使用的培養基包含至少一種其它生色底 物，使得可以檢測酶活性。
5. 權利要求2-4任一項的方法，其中所述底物使得可以檢測選自如下一組的至少一種 酶活性：酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶及葡糖苷酸酶活性。
6. -種檢測和/或鑑別生物學樣品中的產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌和碳青黴 烯-抗性細菌的方法，包括如下步驟： a) 將可能含有所述細菌的生物學樣品與反應培養基接觸，所述培養基包含可以檢測 酶活性的至少一種生色底物及濃度為高於150mg/L的替莫西林，且與另一種反應培養基 接觸，該另一種培養基包含可以檢測酶活性的至少一種生色底物及碳青黴烯，優選法羅培 南； b) 保溫全部混合物以使得細菌生長，及 c) 檢測相應於碳青黴烯-抗性細菌和/或產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌的菌株。
7. 權利要求7的方法，其中步驟a)在組合了步驟a)中所述的兩種培養基的雙平板上 進行。
8. 檢測和/或鑑別產生0XA-48碳青黴烯酶的腸桿菌科細菌的即用型培養基，包含： ?適於腸桿菌科細菌生長的營養性瓊脂培養基， ?濃度高於或等於150mg/L的替莫西林、優選濃度為200-500mg/L， ?至少一種生色底物。
9. 權利要求8的培養基，還包含EDTA型二價陽離子螯合劑，其濃度優選為1. 0-2. 5mM。
10. 液體或瓊脂反應培養基中濃度高於或等於150mg/L、優選濃度為200-500mg/L的替 莫西林在檢測和/或鑑別可能包含於生物培養基中的產生0XA-48碳青黴烯酶的細菌中的 應用。
11. 權利要求10的應用，其中將替莫西林與二價陽離子螯合劑組合，所述二價陽離子 螯合劑的濃度優選為1. 0-2. 5mmol/L。
【文檔編號】C12Q1/04GK104508140SQ201380040004
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年7月29日 優先權日:2012年7月27日
【發明者】G·贊巴爾迪, L·德維涅, S·吉拉爾迪 申請人:生物梅裡埃公司