磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其製備方法
2023-06-09 16:52:06 2
專利名稱：磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其製備方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase，SOD)，別名肝蛋白、奧谷蛋白， 簡稱S0D，是1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到的。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，廣泛分布於各種生物體內，如動物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。SOD在生物體內的水平高低意味著衰老與死亡的直觀指標；現已證實，由氧自由基引發的疾病多達60多種。它可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，並及時修復受損細胞，復原自由基造成的對細胞傷害。由於現代生活壓力，環境汙染，各種輻射和超量運動都會造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化機制中SOD的地位越來越重要。SOD具有非均化分解作為富於反應性的游離活性氧的超氧化物陰離子自由基的活性。期待可以將SOD用於抗風溼藥物、自身免疫性疾病治療劑、心肌梗塞治療劑和臟器移植，以及用於除去腦梗塞後的抗血栓劑使用時在生物體內產生的自由基，還可期待將其用於各種炎症等(參照日本專利第3070980號公報)。SOD體內半衰期短(6-lOmin)、穩定性差、難以進入細胞內、與細胞膜親和力小、具有抗原性，直接藥用存在療效差和有一定的副作用等缺點，有必要進行結構修飾和改造。 對SOD的分子修飾包括化學修飾和酶切修飾。目前國內外大多採用一些不具有免疫原性的水溶性高分子化合物對SOD的非活性部位的胺基酸殘基進行修飾。修飾劑主要有聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、聚蔗糖、藥用澱粉、粘多糖等。經過不同手段修飾後的SOD保留了天然酶活性，而且顯示出體內半衰期延長、穩定性增加、抗原性降低、毒副作用降低等優點 (Shimizu T, Iwanaga M, Yasunaga A. Protective role of glutathione synthesis on radiation-induce DNA damage in rabbit brain [J].CeIl-MoI-Neurobiol, 1998,18(3) 299-310)。磷脂是膜的主要組成成分，對膜的結構完整、膜的離子傳輸和分子識別等功能的正常發揮以及依賴於磷脂的蛋白質系統的活性等都起著決定作用。人體所有細胞中都含有磷脂，它是維持生命活動的基礎物質。磷脂對活化細胞，維持新陳代謝，基礎代謝及荷爾蒙的均衡分泌，增強人體的免疫力和再生力，都能發揮重大的作用。概括的講磷脂的基本功用是增強腦力，安定神經，平衡內分泌，提高免疫力和再生力，解毒利尿，清潔血液，健美肌膚，保持年輕，延緩衰老。磷脂醯乙醇胺(PE，phosphatidyl ethanolamine)，又名腦磷脂，是磷脂的一種，由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺組成的一種磷脂。存在於腦、神經、大豆等中。新鮮製品是無色固體，空氣中易變為紅棕色。有吸溼性。不溶於水和丙酮，微溶於乙醇，溶於氯仿和乙醚。由於其含有極性部分和非極性部分，極適宜在體內降解，無毒性，無免疫原性。作為載體有降低藥物毒性、提高療效、減少副作用和藥物劑量的作用。也可用作抗氧劑。
本發明使用磷脂醯乙醇胺對SOD進行結構修飾，以提高SOD的穩定性和活性，增強 SOD的細胞親和力，降低抗原性和毒副作用，為SOD的臨床應用提供支持。
發明內容
本發明的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶(PE-SOD)組合物的結構如下式⑴所
示，
權利要求
1.一種磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，如下式(I)所示，
2.如權利要求1所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特徵在於，η為1 4的整數，η的平均值為1. 5 2. 4，該組合物由25 40摩爾％的η = 1的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，35 50摩爾％的η = 2的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，10 20摩爾％的η = 3的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，5 15摩爾％的η = 4的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。
3.如權利要求1所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，其特徵在於，R選自 Cn，C13 C15，C17 的烷基。
4.一種權利要求1 3任一所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，包括以下反應步驟(1)乙二醇在二氯甲烷中與對硝基苯基氯甲酸酯以及吡啶反應，生成化合物(II)，乙二醇對硝基苯基氯甲酸酯吡啶的摩爾比為1 2 4 4 8，反應溫度為0 30°C， 反應時間3 5小時；(2)惰性氣體保護條件下，化合物(III)與化合物(II)以氯仿為溶劑在三乙胺的作用下生成化合物(IV)，化合物(III)三乙胺化合物(II)的摩爾比為1 20 30 8 12，反應溫度為20 40°C，反應時間12 24h;(3)將SOD溶於適當的溶劑獲得的SOD溶液，攪拌的同時向該溶液中添加磷脂醯乙醇胺衍生物(IV)，生成組合物(I)；(4)精製方法，將步驟(3)所得磷脂醯乙醇胺化超氧化物歧化酶組合物吸附於離子交換樹脂後，用溶液A洗脫除去未反應的S0D，再用溶液B洗脫磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物，濃縮洗脫液既得精製組合物(I)；
5.如權利要求4所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中所用溶劑選自水或水和有機溶劑的混合溶劑，優選水和有機溶劑的混合溶劑，作為水，選自精製水、離子交換水、蒸餾水或注射用水，有機溶劑，選自異丙醇、N，N-二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯烷酮、N，N-二甲基乙醯胺、環丁碸、二甲亞碸、丙酮、1，4_ 二噁烷、甲醇，優選異丙醇。
6.如權利要求4所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中磷脂醯乙醇胺衍生物(IV)與SOD的摩爾比為1 0.05 0.4，優選 1 0. 1 0. 25。
7.如權利要求4所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，步驟⑶的反應溫度為0 30°C，反應時間為0. 5 72小時，優選2 24小時。
8.如權利要求4所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，步驟(3)的攪拌速度為50 500rpm，優選100 300rpm。
9.如權利要求4所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，步驟(4)所用溶液A由無機鹽濃度為5 lOOmmol，pH6 9的緩衝液和有機溶劑組成，緩衝液為20 90體積％，有機溶劑為10 80體積％ ；溶液B由無機鹽濃度為150 400mmol, pH6 9的緩衝液和有機溶劑組成，緩衝液為20 90體積％，有機溶劑為10 80體積％。
10.如權利要求9所述的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物的製備方法，其特徵在於，溶液A、B所用有機溶劑選自異丙醇、N, N- 二甲基甲醯胺、N-甲基吡咯烷酮、N, N- 二甲基乙醯胺、環丁碸、二甲亞碸、丙酮、1，4_ 二噁烷、甲醇，優選甲醇。
全文摘要
本發明涉及如式(I)所示的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組合物及其製備方法，超氧化物歧化酶(SOD)的一個以上的氨基被磷脂醯乙醇胺殘基取代，式中n為取代基個數，n為1～4的整數，n的平均值為1.5～2.4，式中的R為C11，C13，C15，C17的烷基。如式(I)所示的組合物由25～40摩爾％的n＝1的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，35～50摩爾％的n＝2的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，10～20摩爾％的n＝3的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶，5～15摩爾％的n＝4的磷脂醯乙醇胺基超氧化物歧化酶組成。經過磷脂醯乙醇胺修飾後的SOD顯示出穩定性增加、活性提高等優點。
文檔編號A61K47/48GK102492670SQ20111045190
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者姜家妹, 宋華先, 徐慶春, 秦玉霞, 馬紅萍, 黃海 申請人:遼寧中海康生物藥業有限公司