檢測aml1-eto融合基因相對表達量的引物和方法

2023-06-09 16:59:46

檢測aml1-eto融合基因相對表達量的引物和方法
【專利摘要】本發明公開了檢測AML1-ETO融合基因相對表達量的引物，包括（1）檢測目的基因用上下遊引物AML1-ETO-F，AML1-ETO-R，探針AML1-ETO-Probe，和（2）檢測內參基因Abl用引物為abl-F，abl-R，探針abl-Probe。本發明還公開檢測AML1-ETO融合基因相對表達量的方法，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。
【專利說明】檢測AML1-ET0融合基因相對表達量的引物和方法
[0001]本申請是申請號為201210174382.0、申請日2012年5月30日的中國專利申請的
分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明屬生命科學和生物【技術領域】，特別是一種基因檢測試劑盒，採用探針實時螢光定量PCR技術，能夠對人類急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者體內AMLl-ETO融合基因表達水平進行檢測，可有效的節約檢測時間，提高檢測精度。
【背景技術】
[0003]在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中染色體易位很常見，其中某些易位與AML的亞型有特異性的聯繫。在AML中t(8 ；21) (q22 ；q22)是最常見的染色體異常之一，可見於近40%的AML-M2亞型患者和8%~20%的原發AML患者。該易位導致21號染色體的AMLl基因(acutemyeloblastic leukemia one gene)和8號染色體的ETO基因(eight twenty-one gene，也稱為 MTG8 基因)融合，形成 AML1-ET0 和 ET0-AML1 融合基因。由於後者不能通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法檢測到，一般認為其表達量極低或者由於降解導致表達不穩定。故現階段的研究多集中AML1-ET0融合基因。AML1-ET0融合蛋白全長含有 752 個胺基酸,其 N 端為 RUNXl (runt-related transcription factor I),也稱為AMLl、CBFct2或者PEBP2ctB區，含有結合DNA的結構域；C端為8號染色體編碼的RUNXlTl[runt-related transcription factor I ;tran_located to,I(cyclin D-related)],也稱為ETO(eight-twenty-one)。文獻報導12% -20%的急性髓系白血病(AML)存在t (8 ；21) (q22 ；q22)染色體易位，尤其在AML-M2，其發生率可高達40% -80 %。研究證實，全長的AML1-ET0融合蛋白在小鼠動物實驗中並無致白血病作用，而C末端截短倒位的融合蛋白(AMLl-ETOtr)卻高度致白血病。Lancet等鑑定出一種具有選擇性的剪接變構體AML1-ET0，它含有ETO外顯子9a，產生的AMLl-ET09a融合蛋白幾乎與AMLl-ETOtr完全相同，也有較強的致白血病作用。儘管目前為止尚未發現新的與AML1-ET0相同的結合位點，但與AMLl相t匕，AMLl ETO能夠優先與包含重複的AMLl相同位點的DNA序列相結合，說明AML1-ET0融合蛋白具有優先選擇具有多聚化AMLl相同位點的AMLl靶基因，可能是其阻斷正常血細胞生成、促進白血病發生的機制之一。
[0004]有研究報導，融合蛋白AML1-ET0並非通過單一通路導致白血病的發生，它的作用可能是通過多方面、多因素、多步驟的影響，或者類似於信號通路級聯放大作用，從而觸動急性白血病的猝發。但染色體易位產生融合基因AML1-ET0是白血病發生的一個重要始動因素，沒有它也就沒有下遊基因或染色體改變事件，因而也不會有白血病的發生。因而，對AML1-ET0融合基因進行定量監測，是判斷和追蹤該基因陽性的白血病患者療效的良好指標，可以較好地反映患者微小殘留病的動態變化。 [0005]目前臨床上已經將AML1-ET0融合基因作為動態評估患者病情及預後的手段之一。常用的檢測技術有螢光原位雜交技術(FISH)、RT-PCR、RQ-PCR等方法。FISH法儘管結果較為直觀，但是試驗過程繁瑣，涉及試劑種類繁多，費時費力，且結果需經驗豐富的專業人士來判讀，結果判讀存在較大的主觀性。而單純RT-PCR法則為終點定量，無法對起始模板量進行準確的估算。此外，由於砷劑及全反式維甲酸的應用，APL治療效果得到很大的提高，微小殘留病是其復發的主要原因，因而急需一種高敏感性、高特異性、高自動化程度、汙染控制好的方法來對AMLl-ETO融合基因mRNA殘留進行檢測。
[0006]RQ-PCR米用Taqman探針突光定量技術,綜合生物學、酶學和突光化學於一體，從擴增到結果分析均在PCR反應管封閉狀態下進行，解決了 PCR產物汙染而導致假陽性的問題，同時也提高了敏感度，其結果用拷貝數表示，實現了對PCR產物的準確定量，易於統一標準，與定性PCR技術相比，具有特異度好，靈敏度高，線性關係好，操作簡單，自動化程度高、防汙染，有較大的線性範圍等優點。能夠滿足AMLl-ETO融合基因mRNA微量殘留的檢測，被認為是目前首選檢測方法，用於評價治療效果、預測預後。實時螢光定量PCR中常見的方法有SYBR GreenI染料法，雙探針雜交法以及Taqman技術等。其中SYBR GreenI由於是非飽和染料，特異性不如雙探針雜交法以及Taqman法，必須通過觀察溶解曲線來判斷其特異性；而雙探針法雜交法成本又較為昂貴。因此本發明採用實時螢光PCR技術結合Taqman探針法應用於AMLl-ETO的基因檢測。

【發明內容】

[0007]鑑於現有技術中檢測AMLl-ETO融合基因的不足，本發明設計了檢測內參/目的基因用引物、探針序列，用螢光定量PCR技術檢測白血病AMLl-ETO融合基因相對表達量。通過調整兩個基因的引物探針濃度及比例，優化PCR的反應體系和反應條件，開發了一種用於檢測白血病AMLl-ETO融合基因相對表達量的試劑盒。
[0008]用於檢測AMLl-ETO融合基因相對表達量的試劑盒，包括紅細胞裂解液、TRIzol,氯仿、無水乙醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、檢測體系PCR反應液、陽性對照品和陰性對照品，其特徵在於:`
檢測體系PCR反應液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、檢測目的基因用上下遊引物AML1-ETO-F, AML1-ETO-R，探針 AML1-ETO-Probe，檢測內參基因 Abl 用引物 abl_F，abl_R，探針 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0009]進一步地，檢測用上下遊引物和探針的比例優選為:AML1-ET0-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩爾比為 2: 2:1。
[0010]參照用上下遊引物和探針的比例優選為:於abl-F: abl-R: abl-Probe的摩爾比為2:2:1。
[0011]所述陽性對照品為含有AMLl-ETO基因的溶液；所述陰性對照品為無AMLl-ETO基因的溶液。[0012]其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit為TOYOBO公司生產的qPCR用cDNA試劑盒產
品O
[0013]THUNDERBIRD qPCR MIX為TOYOBO公司生產的定量PCR試劑，產品規格為QPS-101。
[0014]使用本發明的試劑盒，將實時螢光PCR技術結合採用Tapman探針，可以對AML1-ET0)融合基因的表達水平進行檢測，檢測精度高，而且操作簡單，可降低檢測成本，節約檢測時間。採用雙標準曲線法，通過構建AMLl-ETO和內參基因abl的標準定量曲線，精確定量樣本的內參基因拷貝數和AMLl-ETO拷貝數，相比於以往的免疫組化方法和現今的ΔΔ CT法，該試劑盒具有精度高，結果便於判讀等優點。加之該試劑盒將反應體系所需的引物、探針進行合理配比和優化，使擴增效率和速率等實驗條件達到最佳，從而省去了繁瑣的條件摸索環節，大大提升了實驗效率。該試劑盒經測試特異性好，靈敏度高，操作簡便。有助於臨床上急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)患者體內AMLl-ETO融合基因的微量殘留檢測，對於及時幹預治療避免血液學復發、調整治療方案、評價治療效果、預測預後、預防臨床復發都具有重要意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:AML1-ET0型陽性結果示意圖。
[0016]圖2:AML1-ET0型陰性結果示意圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
本發明的用於檢測AMLl-ETO融合基因相對表達量的試劑盒，包括:
紅細胞裂解液；
TRIzol ；
氯仿；
無水乙醇；
ReverTra Ace qPCR RT Kit (Τ0Υ0Β0 公司)；
檢測體系PCR反應液:THUNDERBIRD Probe qPCR Mix (2X )、檢測目的基因用上下遊引物 AML1-ETO-F,AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AMLl-ET0_Probe (探針)0.4 uM ;檢測內參基因 Abl用上下遊引物 abl-F, abl-R 各 0.8uM、abl-probe (探針)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
[0018]陽性對照品:含有AML1-ET0基因的溶液；
陰性對照品:不含AML1-ET0基因的溶液。
[0019]實施 例2
本發明試劑盒的使用方法:(I)抽提血液中的組織RNA:在潔淨的1.5ml的離心管中加入Iml紅細胞裂解液，取抗凝血0.5ml混勻。室溫靜置IOmin ；5000rpm離心5min,棄上清,收集底部的細胞；再次加入0.5ml紅細胞裂解液，5000rpm離心5min，棄上清，收集底部的細胞；向細胞中加入ImlTRIzol，反覆吹打直至沉澱完全溶解，室溫靜止5min ;加入0.2ml氯仿，震蕩均勻；HOOOrpm40C離心lOmin，吸取上清層轉移至另一新的離心管中；加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置IOmin ；14000rpm 4°C離心IOmin,棄上清,加入75%乙醇Iml,輕輕上下顛倒洗漆管壁；14000rpm 4°C離心5min,棄乙醇；室溫乾燥10_15min,加入20ulRNase_free水溶解沉澱。
[0020](2)參考TOYOBO公司的Rever Tra Ace qPCR RT Kit試劑盒說明書，將RNA反轉為 cDNA。
[0021](3)試劑配置:按檢測人份數配置檢測體系PCR反應液各X ul，每人份23ul分裝: X=23ul反應液X (8份內參(標準曲線)+8份目的基因(標準曲線)+η份標本+1份陽
性對照+1份陰性對照+1份空白對照)；
(4)加樣:加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA ;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質。
[0022](5)檢測:檢測在實時螢光PCR儀上進行，可用儀器包括ABI7300，7500 (美國Applied Biosystems 公司)等。反應條件:95°C預變性 Imin ;95°C 15s, 58°C 35sec 40 個循環，突光信號於58°C 35 sec時米集。
[0023](6)結果判斷:將閾值線調整至背景信號及陰性擴增線以上，系統根據標準曲線和CT值自動計算出拷貝數。
`[0024]I)內參陽性時，檢測結果才認為有效；
2)陽性判斷標準:，Ct〈36，為陽性；35 ^ Ct ^ 38，為疑似陽性，需要再次驗證；Ct >38，為陰性。
[0025]實施例3
採用本發明核酸檢測試劑盒檢測臨床標本
取送檢的急性早幼粒細胞白血病(APL)患者抗凝血標本共80例，按實施例2所述方法提取基因組RNA、配製試劑並檢測。
[0026]每份標本加入檢測體系PCR反應液中2ul。同時做陽性，陰性，空白對照，內參基因/目的基因的標準曲線各一份。一臺96孔的螢光PCR儀可同時檢測38份樣品，每個樣本2次重複，一份陽性對照，一份陰性對照和一份空白對照。檢測時間僅為100分鐘。
[0027]實驗結果與特檢實驗室的報告結果相比較，確定樣品檢測的準確率。部分陽性結果如下表:
【權利要求】
1.檢測AMLl-ETO融合基因相對表達量的引物，其特徵在於:所述引物包括(I)檢測目的基因用上下遊引物AML1-ET0-F，AML1-ET0-R,探針AML1-ETO-Probe，和(2)檢測內參基因 Abl 用引物 abl-F，abl_R，探針 abl-Probe ;其中，
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
2.如權利要求1所述的引物，其特徵在於AMLl-ETO-F: AMLl-ETO-R:AMLl-ETO-Probe 的摩爾比為 2: 2:1。
3.如權利要求1所述的引物，其特徵在於abl-F: abl-R: abl-Probe的摩爾比為2:2: 10
4.如權利要求1所述的引物，其特徵在於所述陽性對照品為含有AMLl-ETO基因的溶液；所述陰性對照品為無 AMLl-ETO基因的溶液。
5.檢測AMLl-ETO融合基因相對表達量的方法，其特徵在於，包括如下步驟: (1)抽提血液中的組織RNA； (2)將RNA反轉為cDNA； (3)試劑配置:檢測體系PCR反應液:THUNDERBIRDProbe qPCR Mix (2X)、檢測目的基因用上下遊引物 AML1-ET0-F，AMLl-ETO-R 各 0.8uM、AML1-ΕΤΟ-Probe (探針)0.4 uM ;檢測內參基因Abl用上下遊引物abl-F，abl-R各0.8uM、abl-probe (探針)0.4uM ;其中:
AML1-ETO-F: GTCTTCACAAACCCACCGCAAG
AML1-ETO-R: GTCAGCCTAGATTGCGTCTTCA
AMLl-ETO-Probe:FAM-TGAGAAGCACTCCACAATGCCAGACTCACC-TAMRA
abl-F: GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG
abl-R: ATGATATAGAACGGGGGCTC
abl-Probe: FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA ； 陽性對照品:含有AML1-ET0基因的溶液； 陰性對照品:不含AML1-ET0基因的溶液； (4)加樣:加入檢測體系PCR反應液中2ulcDNA;陽性對照和陰性對照直接加2ul陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2ul生理鹽水或不加任何物質； (5)檢測:檢測在實時螢光PCR儀上進行，反應條件:95°C預變性Imin；95°C 15s，58°C35sec 40個循環，螢光信號於58°C 35 sec時採集； (6)結果判斷。
【文檔編號】C12N15/11GK103805698SQ201410031099
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年5月30日 優先權日:2012年5月30日
【發明者】周曉犢, 王淑一, 徐建成 申請人:北京艾迪康醫學檢驗所有限公司