用於檢測黃病毒特異性抗體的抗原捕獲抗登革熱IgAELISA(ACA-ELISA)的製作方法

2023-06-09 17:33:16

專利名稱：用於檢測黃病毒特異性抗體的抗原捕獲抗登革熱IgA ELISA(ACA-ELISA)的製作方法
技術領域：
本發明涉及對人或動物近期暴露於黃病毒或其等價物的檢測技術。更特別地，本發明涉及對取自受試者(動物或人)的生物樣品的快速簡便的分析，以確定該受試者是否已明確地暴露於黃病毒或其等價物。本發明還提供了醫學診斷試劑盒以及通過檢測由黃病毒或其等價物感染產生的黃病毒特異性抗體(IgA)而進行的血清評價。更優選地，本發明涉及登革病毒。

背景技術：
黃病毒科(Flaviviridae)包括許多導致人類疾病並通常經蚊或蜱傳播的病毒。黃病毒屬(Flavivirus genus)包括多種病毒，其包括各自導致相應疾病的黃熱病毒(YF)、登革熱(DF)病毒、西尼羅河(WN)病毒和日本腦炎(JE)病毒。
登革熱是世界範圍內影響熱帶及亞熱帶地區(主要在市區和市郊區域)的主要病毒疾病之一。登革熱及其更嚴重的形式登革出血熱(DHF)和登革休克症候群(DSS)是重要的公共衛生問題。
登革病毒是有被膜的正鏈RNA病毒。基因組RNA長約11kb並包含三個結構蛋白基因(其編碼核衣殼或核心蛋白(C)、膜相關蛋白(M)、被膜蛋白(E))以及七個非結構(NS)蛋白基因。登革病毒以及其它黃病毒的基因順序是5』-C-prM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3』。其具有四種不同的血清型——血清型1至4。感染會誘導針對同源血清型的終生保護性免疫，但對另外三種血清型的繼發感染只有部分的和暫時性的保護。然而，已普遍認識到，由於依賴抗體的增強作用(antibody-dependent enhancement)所致，由多種登革病毒血清型引起的繼發感染或者再次或多重感染是DHF和DSS的主要風險因素。已推測對於DHF發病很重要的另一些因素包括病毒毒力、宿主遺傳背景、T細胞活化、病毒載量和自身抗體。由於試圖在登革熱流行國家消滅埃及斑蚊(Aedes aegypti)(登革病毒的最有效蚊媒)的嘗試未獲成功，因此只有在開發出有效疫苗之後才有可能控制登革熱。目前，尚無有效的登革疫苗獲得批准。
實驗室診斷登革病毒感染可以通過檢測特定病毒、病毒抗原、基因組序列和/或抗體來進行。目前，大多數實驗室使用的用於診斷登革病毒感染的三種基本方法是病毒分離和表徵，通過核酸擴增技術測定來檢測基因組序列以及檢測登革病毒特異性抗體。在疾病發作之後，所述病毒存在於血清或血漿、循環中的血細胞以及所選組織(特別是免疫系統中的組織)中大約2至7天(大致對應於發熱期)。
在登革病毒感染的患者中可觀察到兩種模式的血清學應答初次和再次抗體應答，這取決於受感染個體的免疫狀況。初次抗體應答見於對登革病毒或黃病毒其它成員缺乏免疫力的個體中。再次抗體應答見於曾被登革病毒或黃病毒感染的個體中。對於急性期和恢復期的血清來說，基於捕獲免疫球蛋白M(IgM)和IgG酶聯免疫吸附測定(ELISA)的抗體血清學檢測已成為檢測和鑑別原發和繼發登革病毒感染的新標準。這是很重要的，因為用於檢測和鑑別原發、繼發或多重登革病毒感染的靈敏且可靠的測定對於流行病學、病理學、臨床和免疫學研究的數據分析來說是十分關鍵的。
由於針對繼發感染患者之測定的低靈敏度，藉助血清學檢測急性期血清樣品中的抗原進展緩慢，這是因為這些患者具有之前存在的病毒-IgG抗體免疫複合物。然而，使用針對被膜膜(E/M)抗原(denKEY試劑盒；Globio Co.，Beverly，Mass.)和NS1抗原的ELISA和點印跡測定的近期研究表明，在原發登革病毒感染患者和疾病發作後多至9天的繼發登革病毒感染患者的急性期血清中均可以檢測到免疫複合物形式的高濃度E/M和NS1抗原。Koraka等(2003)最近報導了通過點印跡免疫測定在急性登革病毒感染的患者中檢測到與免疫複合物解離的NS1抗原，並得出結論與用RT-PCR和denKEY試劑盒所得到的數目相比，在來自原發和繼發登革病毒感染患者的非解離和解離的血清和血漿樣品中通過點印跡免疫測定對NS1抗原進行檢測得到的登革熱抗原陽性患者的數目最多。
血清學診斷登革病毒感染相當複雜，原因包括(i)由於缺乏交叉保護的中和抗體，患者可能具有四種登革病毒血清型的多重和相繼感染；(ii)在兩種或更多種黃病毒共同流行的地區，由於存在原有抗體和最初抗原原罪性影響(antigenic sin)(許多對首次黃病毒感染產生應答的B細胞克隆在之後的每一次黃病毒感染中受到再次刺激而合成早期抗體，這些抗體與首次感染病毒的親和力較之與當次感染病毒的親和力更高)，因此多重和相繼黃病毒感染使鑑別診斷難於進行；(iii)IgG抗體對同源和異源的黃病毒抗原具有高度的交叉反應性；以及(iv)在許多登革熱繼發感染患者中，由於IgG抗體長期存在(≥10個月，如通過E/M特異性捕獲IgGELISA(E/M-specific capture IgG ELISA)測量的；或終生，如通過E/M抗原包被間接IgG ELISA測量的)，難於對過去、近期和當前的登革病毒感染進行血清學診斷。因此，在可通過血清學進行診斷的病毒感染中，登革病毒感染是最具挑戰性的。
已描述了幾種用於血清學檢測登革病毒特異性抗體的方法，其包括血凝抑制(HI)試驗、中和試驗、間接免疫螢光抗體試驗、ELISA、補體結合、點印跡、Western印跡和快速免疫色譜試驗。其中，捕獲IgM和/或IgG ELISA、抗原包被間接IgM和/或IgG ELISA以及HI試驗是常規診斷登革病毒感染最常用的血清學技術。傳統上，由於HI試驗具有簡易性、靈敏性和可重複性，將其用於檢測和鑑別原發和繼發登革病毒感染。當患者血清中HI試驗效價高於或等於1:2560時，其被歸為具有繼發登革病毒感染；當HI試驗效價低於1:2560時，其被歸為具有原發登革病毒感染。由於HI試驗存在固有缺陷，目前已不常用並且逐漸被E/M特異性捕獲IgM和IgG ELISA所取代。
市售有許多使用免疫色譜原理的快速測試試劑盒。這些試劑盒中的大多數可在5至30分鐘內同時檢測出人全血、血清或血漿中針對登革病毒的IgM和IgG抗體。這些試劑盒中的某些聲稱可以鑑別原發和繼發登革病毒感染，然而這不總是可靠的。結果顯示，這些試劑盒通常具有較高的IgG檢測靈敏度而具有較低的IgM檢測靈敏度，以及與E/M特異性捕獲IgM和IgG ELISA相比不同的特異性。儘管快速測試試劑盒具有操作簡便和快速提供結果的優點，但是它們應最多作為醫院臨床上的篩選試驗。
一些研究人員報導了登革病毒特異性IgA和IgE抗體應答。Talarmin等(1998)報導了使用IgA和IgM特異性捕獲ELISA在診斷登革病毒感染中的用途。結果顯示IgM(2至3個月)比IgA(約40天)似乎更加快速和持久。他們得出結論捕獲IgA ELISA是可與捕獲IgM ELISA一起實施的簡單方法，其可幫助解釋DF的血清學特徵。最近，Balmaseda等(2003)報導了對血清和唾液中特異性IgM和IgA抗體的檢測。他們得出結論與唾液相比，血清中的登革病毒特異性IgA由於其高水平的表現因而更有潛力作為診斷靶標。
本發明提供了用於檢測針對黃病毒感染的IgA的有效且靈敏的檢測方法，其克服了現有技術中的某些問題。
發明概述 一方面，本發明提供了用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA的方法，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及 用抗IgA抗體表徵所述複合物中的結合伴侶。
該方法僅鑑定所述生物樣品中的IgA。
另一方面，本發明提供了檢測受試者對黃病毒或其等價物的暴露的方法，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況； 表徵所述複合物中的結合伴侶；以及 將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯。
本發明源自對開發一種檢測當前或不久前暴露於黃病毒的快速、低成本和直接測定的需求。本發明優選使用抗體從細胞裂解物中免疫純化黃病毒特異性免疫原性組分，其隨後捕獲來自生物樣品(如黃病毒感染患者的血清或唾液)的鑑定為抗登革熱IgA的結合伴侶。
因此，通過提供能夠在黃病毒感染早期特異性鑑定針對黃病毒或其免疫學近親所產生的抗體(IgA)的平臺，本發明顯示出比其它常規的和目前最常用的登革熱捕獲IgM ELISA更好的特異性和靈敏性。最優選地，該方法鑑定登革病毒感染。
另一方面，本發明提供了用於檢測受試者對黃病毒或其等價物的暴露之方法的固體支持物，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物或其等價物進行接觸； 測定該生物樣品中存在的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及任選地 表徵所述複合物中的結合伴侶從而將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯； 所述支持物包含固定於其上的黃病毒特異性免疫原性組分。
在一個優選的實施方案中，可將生物樣品應用到預先用所添加的源自黃病毒的黃病毒抗原或其等價物進行包被和捕獲的聚苯乙烯板。優選地，所述抗原或免疫原性組分來源於細胞裂解物。然後可以使用含有報告基團並且特異性結合所述組分/結合伴侶(更具體為IgA結合伴侶)複合物的檢測試劑來檢測黃病毒細胞裂解物的免疫原性組分與所述結合伴侶所形成的複合物。
又一方面，本發明提供了用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA或者檢測對黃病毒的暴露的試劑盒，其包含 包含黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物；或 包含附著於另一支持物的黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物； 至少一種綴合有報告基團的檢測試劑，其用於檢測生物樣品中與黃病毒特異性免疫原性組分形成複合物的結合伴侶；以及任選地 使用所述試劑盒以進一步鑑定所述複合物中之結合伴侶的說明書。
本發明還提供了用於本發明方法的試劑盒中的各個組分。
本發明還提供了一種評估限定區域(例如地理區域、住宅區域、運輸工具或醫學治療或評估中心)內一個或多個受試者暴露於黃病毒或其等價物的相對風險的方法，其包括 從限定區域內的代表性群體中獲得樣品；以及 通過包括以下步驟的方法來評估樣品群體中各成員暴露於黃病毒或其等價物的證據 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況，其中所述複合物的存在指示該受試者暴露於黃病毒或其等價物；以及 通過表徵所述複合物中的結合伴侶來評估限定區域內暴露的相對風險。
可使用計算機可讀形式的軟體來進行風險分析。因此，本發明還涉及適於分析受試者或受試者群暴露於黃病毒或其等價物或者受試者或受試者群暴露於黃病毒或其等價物之風險的計算機可讀程序以及包含其的計算機。



圖1顯示使用由泛-登革熱單克隆抗體包被的聚苯乙烯板對登革熱裂解物抗原進行優化。
圖2顯示使用確診為登革熱的成對血清對ACA-ELISA進行優化。
圖3顯示使用經確認的登革熱陰性和陽性血清樣品來確定ACA-ELISA的臨界點。
圖4顯示兩種抗登革熱IgA ELISA技術(ACA和AAC)的靈敏度比較結果。
圖5顯示使用兩種抗登革熱IgA ELISA技術對確診為登革熱的血清樣品中由非登革熱特異性IgA所導致的抑制進行比較研究。
圖6顯示使用兩種ELISA技術所產生抗登革熱IgA的動力學，及其與使用確診為登革熱的血清樣品時之抗登革熱IgM的比較。
圖7顯示對基於唾液的ACA ELISA的優化。
圖8顯示ACA-ELISA所檢測的唾液中抗登革熱IgA產生的動力學。
圖9顯示使用確診為登革熱的唾液樣品對ACA-ELISA(唾液和血清)與登革熱IgM ELISA(pan-bio)的表現進行比較。
發明詳述 第一方面，本發明提供了用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA的方法，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及 用抗IgA抗體表徵所述複合物中的結合伴侶。
該方法特別地用於鑑定生物樣品中IgA形式的結合伴侶。可使用經黃病毒特異性IgA分離得到的免疫原性組分來進一步改進該方法。因此，所述免疫原性組分可以是黃病毒IgA特異性免疫原性組分。引入IgA特異性免疫原性組分將會吸引生物樣品中特異性針對該黃病毒的IgA。
另一方面，本發明提供了用於檢測受試者對登革病毒或其等價物的暴露的方法，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸； 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況； 表徵所述複合物中的結合伴侶；以及 將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯。
本發明提供了一種新的抗登革熱IgA檢測技術(ACA-ELISA)，其優選靶向唾液以作為血液的替代品。相比於IgG和IgM(分別為1.4mg/100mg和0.2mg/100ml)，唾液中含有高水平的IgA(19.9mg/100ml)。就檢測抗黃病毒IgA來說，該技術檢測唾液具有比檢測血清更好的表現，並可用作初級保健系統中當基於分子的黃病毒診斷不可用時的早期黃病毒診斷之一。
本發明源自對開發一種檢測當前或不久前暴露於黃病毒的快速、低成本和直接測定的需求。根據本發明，對受試者(包括動物例如哺乳動物，特別是人)篩選針對黃病毒或其等價物的結合伴侶(優選IgA)的存在情況。優選的結合伴侶是來源於受試者的結合伴侶，例如但不僅限於免疫互作分子(immunointeractive molecule)。免疫互作最強的分子是抗體，特別是免疫球蛋白A(IgA)。然後，將這些結合伴侶的鑑定用作該受試者當前或不久前暴露於黃病毒或其等價物的證據。
本發明特別地使用了抗體(優選單克隆抗體)來捕獲包含黃病毒免疫原性組分混合物的抗原(優選來自黃病毒感染之細胞的裂解物)，所述黃病毒免疫原性組分包括黃病毒顆粒以及指示黃病毒感染的其它抗原。在本發明中，所述細胞裂解物優選包含含有病毒顆粒以及結構和非結構病毒蛋白的黃病毒免疫原混合物。優選地，所述黃病毒免疫原是能夠引發與生物樣品中結合伴侶之免疫反應的裂解物免疫原性組分。
因此，與其它常規的和目前最常用的抗體捕獲IgA(AAC-ELISA)相比，本發明通過提供在感染早期可鑑定針對黃病毒或其等價物所產生的抗體的平臺從而顯示出更高的靈敏度和特異性。
因此，本發明提供了一種優選使用感染黃病毒之細胞裂解物的新的特異、快速且經濟的檢測方法，所述裂解物包含黃病毒組分的混合物(優選上述裂解物的免疫原性組分)，其使得特異性檢測黃病毒結合伴侶(優選可能存在於測試血清或唾液中的IgA)。該測試十分快速，優選在室溫(RT)下90分鐘內提供結果。除了是用於檢測特異性抗體的簡便技術之外，本發明的一個主要優點是優選使用黃病毒特異性單克隆抗體從粗製細胞裂解物中純化黃病毒抗原以及從唾液中檢測抗黃病毒IgA。另外，由於最大程度暴露人血清或唾液中存在的抗登革熱IgA，因此本發明具有高的測試靈敏度。
在整個說明書和權利要求書中，詞語「包括」及其變化形式(如「包含」和「含有」)的使用不意在排除其它添加物、組分、整數或步驟。
黃病毒 本文的權利要求書和說明書中使用的術語「黃病毒」包括黃病毒科的黃病毒，其包含導致人類疾病且通常經節肢動物(如蚊和蜱)傳播的黃病毒屬。該病毒導致例如但不限於黃熱病(YF)、登革熱(DF)和日本腦炎(JE)的疾病。組成該屬的黃病毒種在核苷酸和胺基酸序列水平上具有一定的序列保守性。黃病毒屬中的病毒包括但不限於黃熱病(YF)病毒、登革病毒、西尼羅河(WN)病毒和日本腦炎(JE)病毒。由於核苷酸和胺基酸水平上的相似性，這些病毒在抗原性、傳播和致病中可顯示出相似性。最優選地，本發明的黃病毒是登革病毒。
登革病毒 本文的權利要求書和說明書中使用的術語「登革病毒」是指與登革熱感染有關的所有登革熱血清型(Den-1、Den-2、Den-3和Den-4)。優選地，本發明可適用於在任何受試者(包括人、非人動物和實驗動物)中檢測登革病毒感染或暴露。但是，本發明優選人類受試者。然而，本發明包括可以對登革病毒或其等價物的感染或免疫產生應答的任何受試者。
登革病毒被定義為一組人類RNA病毒，其包含直徑約為40-50nm的被膜顆粒。該病毒的基因組約為11kb(Stollar等，1966)。成熟的病毒體包含包在等邊(isometric)核衣殼中的正義RNA基因組。該基因組編碼一個約11000個核苷酸的開放讀碼框，其編碼3種結構蛋白(C-衣殼、M-膜和E-被膜)和7種非結構蛋白(NS1、NS2a和NS2b、NS3、NS4a和NS4b、NS5)。
登革病毒通過經感染的雌性伊蚊(Aedes)(主要是埃及斑蚊(A.aegypti))叮咬而傳播給人。這是一種小型、黑白兩色、主要在室內活動(highly domesticated)的熱帶蚊子，它常將卵產於室內或附近的可盛有水的人造容器中，如桶、花瓶及其它盛水容器。成年蚊很少在戶外發現；它們通常棲息在室內黑暗的位置，不顯眼，並喜歡在白天以人或動物為食，大多數叮咬發生在凌晨或傍晚(Gubler等，1992；Newton等，1992)。雌蚊在攝食時警惕性很高，即使宿主極其輕微的動作都會干擾其取食過程，隨後其返回原先的宿主或另外的宿主繼續取食。由於該蚊的這種行為，其常常在一次進食中在若干人身上取食，如果其被感染，則可將病毒傳播給多人(Platt等，1997；Scott等，1997)。這種行為還用於解釋流行病學所觀察到的如下現象登革熱病主要在兒童中發病；而在某些地方(如新加坡)，由於採取了媒介物控制措施，這種情形可以發生改變(Ooi等，2001)。
在被經感染的雌蚊叮咬後，病毒進入3至14天的內潛伏期(intrinsicincubation period)(平均4至7天)，之後患者可經歷急性發熱並伴隨其它非特異性跡象和症狀。在該病毒血症期期間(可為2～7天)，病毒在被感染人的血液中循環。如果未經感染的伊蚊取食病毒血症期間的宿主，這隻蚊子在必經的10～12天外潛伏期後將會被感染，它隨後能夠將該病毒傳播給其他未被感染的宿主。儘管研究表明猴子可被感染並且可能作為該病毒的擴增主體，但是在該傳播循環中人才是該病毒的主要擴增宿主(Putnam等，1995；Gubler等，1976；WHO，情況說明書，2002)。
取決於所感染的病毒、宿主的年齡和免疫狀況，登革病毒感染導致人的多種疾病。它可以導致無症狀疾病，或者從未分化的流感樣疾病(病毒症候群(Viral syndrome))到登革熱(DF)，到登革出血熱(DHF)，以至嚴重並致命的登革休克症候群(DSS)(Nimmannitya，1993WHO，1997)。
世界衛生組織已建立了登革出血熱嚴重程度的分級標準。分為4個嚴重性等級，其中等級III和等級IV被認為是登革休克症候群(DSS)。
等級I具有非特異性全身症狀的發熱，僅有的出血性表現是止血帶試驗呈陽性和/或容易發生瘀傷(bruising)。
等級II除等級I中的表現外，皮膚自發性出血或其它出血。
等級III表現為快速微弱的脈搏、脈壓變窄(narrowing of pulse pressure)或低血壓的循環衰竭，並出現皮膚冰冷、溼粘以及多動不安(restlessness)。
等級IV深度休克(profound shock)，並檢測不到血壓或脈搏(WHO，1997)。
典型的登革熱在年齡稍大的兒童、青少年和成人中更為常見，他們較少為無症狀的(Sharp等，1995)。發作時突然發熱，並伴有高燒、頭痛、失能性肌痛(incapacitating myalgia)和關節痛、噁心嘔吐以及斑疹或斑丘疹(Waterman，1989)。發熱通常持續5～7天，有時會跟隨有雙峰式病程(biphasic course)(鞍背狀)(Nimmannitya，1993)。
儘管登革出血熱也發生在成人中並且其主要與繼發登革熱感染有關，它主要是發生在15歲以下兒童中的疾病(Sumarmo等，1983；WHO)。登革出血熱的關鍵階段是體溫變為正常時的退熱期。在該時期決定疾病嚴重程度的主要因素是由增加的血管滲透性所致的血漿滲出(plasmaleakage)、穩態異常以及其它常見出血現象(如瘀點、紫癜性損傷和瘀斑)。這些症狀加上止血帶試驗呈陽性有助於登革出血熱的準確診斷(GublerDJ.，1998)。
登革休克症候群是登革出血熱的末期階段，其表現為血漿滲出引起的低血容量性休克(WHO，1997)。登革休克症候群有4種徵兆持續腹痛、持續嘔吐、多動不安或嗜睡，以及突然由發熱轉變為低體溫並伴有出汗和虛脫。有經驗的醫護人員的早期鑑定和適當治療可以降低登革休克症候群的致死率至0.2％，但一旦發生休克，死亡率會超過40％(Nimmannitya，1994；Rigau-Perez JG等，1998)。
E蛋白是暴露於該病毒表面上最大的且僅有的結構蛋白，它是參與免疫反應(如受體結合、血凝(haemmagglutination)和中和)的主要蛋白。被所述血清型之一感染的人對該血清型產生終生免疫，但對其它血清型僅產生暫時性保護。
核質粒(nucleoplasmid)依次被含有脂質的被膜和膜蛋白包圍。除被膜和衣殼蛋白外，登革病毒還包含7種非結構蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5。
等價物 本文涉及黃病毒時使用的術語「等價物」意在包括可以引發與黃病毒或黃病毒的結構或非結構蛋白可引發的應答同樣或類似之應答的相似分子。例如，黃病毒在感染的各個階段所表達的各種抗原或者各種病毒顆粒或片段可以導致與完整病毒類似的效果。所述應答可以是免疫應答(非臨床應答)，或者是感染性應答(臨床應答)或由疫苗接種所致。
暴露 本發明適用於檢測針對黃病毒或其等價物的暴露。暴露可以是當前或先前對黃病毒或其等價物的暴露。優選地，所述暴露足以引發體內的免疫反應或應答，從而誘導對黃病毒或其等價物產生應答的結合伴侶。受試者一經暴露，本發明的方法即可以應用於上述的任何暴露階段。優選地，本方法用於檢測那些不具有明顯的黃病毒感染跡象和症狀的暴露。優選地，本方法在以下任意黃病毒感染階段檢測受試者對黃病毒或其等價物的暴露在繼發感染的急性期早期，或者在原發感染或疫苗接種的恢復期晚期。該暴露並不總表現出黃病毒感染或者明顯的跡象或症狀，但它會引起應答從而誘導產生結合伴侶。優選地，所述應答為免疫應答。
受試者可以曾經暴露於黃病毒，但無需表現出可見的感染症狀。本方法檢測可導致感染的暴露或者可以指示未表現出任何症狀的先前暴露。
免疫應答 「免疫應答」是指脊椎動物的免疫系統產生的選擇性應答，其中針對被機體識別為外源物的入侵病原體和抗原產生特異性抗體或抗體片段和/或細胞毒性細胞。
結合伴侶 結合伴侶是針對外源登革病毒或其等價物而產生的任何分子或細胞。優選地，所述結合伴侶是抗體或其免疫學活性片段，或細胞毒性細胞。所述結合伴侶包括可以與黃病毒抗原或等價物相互作用的免疫互作分子並優選IgA分子。
如本文所示，優選的結合伴侶是免疫互作分子，其優選指包含抗原結合部分或其衍生物的任何分子。優選地，所述免疫互作分子是在黃病毒感染或暴露的受試者之體液應答期間產生的針對黃病毒蛋白任意部分的抗體。
如本文所示，優選的結合伴侶是受試者產生的針對黃病毒或相關病毒組分的抗體。然而，也可使用被靶向抗體的結合伴侶。這樣的結合伴侶的實例是抗獨特型抗體或者特異性針對並區別於目標抗體的抗體，所述目標抗體特異性針對黃病毒或相關病毒組分。
本文使用的「抗獨特型抗體」是指與另一抗體的特異性抗原結合位點結合的抗體，所述另一抗體是由對源自黃病毒或其免疫學近親的組分的暴露產生應答而產生的。
本文使用的術語「抗體」包括完整的抗體以及包含其功能性部分的抗體片段。術語「抗體」包括含有輕鏈可變區和/或重鏈可變區充足部分的任何單特異性或雙特異性的化合物，從而與完整抗體對其具有結合特異性的表位結合。所述片段可包括至少一條重鏈或輕鏈免疫球蛋白多肽的可變區，並包括但不僅限於Fab片段、F(ab』)2片段和Fv片段。
優選地，所述結合伴侶是抗體。更優選地，其為黃病毒IgA分子或登革熱IgA分子。
生物樣品 本發明的方法通過使用獲取自曾可能暴露於所述病毒之受試者的生物樣品來檢測對黃病毒或其等價物的暴露。所述生物樣品可以是來自機體的可包含結合伴侶的任何樣品。這樣的生物樣品可選自血液、唾液、脊髓液(cord fluid)、B細胞、T細胞、血漿、血清、尿液和羊水等。優選地，所述生物樣品為血清或血漿。最優選地，所述生物樣品為血清或唾液。
所述生物樣品還優選獲取自疑似暴露於黃病毒的受試者。生物樣品還可以在使用前進行修飾，例如稀釋、純化各級分、離心等。因此，生物樣品可以指從完整生物體或其一部分組織、細胞或部分組分製備的勻漿物、裂解物或提取物，或其級分或部分。
應注意的是，生物樣品還可以不包含能夠與黃病毒或其等價物相互作用的結合伴侶。這種情形發生在受試者未曾暴露於黃病毒或其等價物時。由於在缺乏結合伴侶時不會形成複合物，因此「檢測生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間所形成的複合物的存在情況」可能得到零結果。可以使用黃病毒特異性免疫試劑(如設計為競爭生物樣品中結合伴侶的單克隆抗體)作為對照。
提及與組分(優選免疫原性組分或其免疫學近親)接觸的生物樣品時，應理解為提及促進該生物樣品中一種或多種免疫互作分子與組分(優選來源於經黃病毒或其等價物感染之細胞的裂解物的組分)之間相互作用的任何方法。所述相互作用應為免疫互作分子與來源於經黃病毒或其等價物感染之細胞的裂解物的特異性免疫原性組分之間可以發生的偶聯、結合或其它相互作用。
所述生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物(優選來源於經黃病毒或其等價物感染的細胞之裂解物)相接觸。所述裂解物提供了病毒免疫原性組分，其可以由任何發育階段的黃病毒提供。在黃病毒感染的恢復期早期，來自先前登革熱感染的抗體(優選IgA)是繼發或原發黃病毒感染的指示之一，這可以通過其與黃病毒特異性免疫原性組分(優選所述裂解物的免疫學組分)之間形成複合物來檢測。
細胞裂解物 優選通過使用黃病毒特異性單克隆抗體的免疫純化來純化本發明中使用的裂解物。重要的是，所述裂解物是來源於已被黃病毒或其等價物感染之細胞的組分混合物。所述裂解物是黃病毒特異性免疫原性組分的優選來源。然而，這些組分可通過其它方法得到。由於裂解物可提供病毒產生的最早抗原(其可引發IgA應答)，因此細胞裂解物開始是最方便的。
當受試者暴露於黃病毒時，機體發生反應以除去該病毒。這導致通常表現為對黃病毒或其等價物呈遞的多種抗原的免疫應答中的一系列事件。
本發明的裂解物可以獲得自已感染黃病毒或其等價物之細胞的任何來源。優選地，所述細胞是在體內培養中被黃病毒或其等價物感染的細胞。
任何類型的細胞都可以被感染。優選地，所述細胞類型能夠感染並培養黃病毒。但是，優選地，根據本發明的方法感染那些能夠產生高滴度黃病毒的細胞，所述細胞包括但不僅限於常用的傳代細胞系(例如Vero細胞(Vero-PM細胞株)、CV-1細胞，LLC-MK2，C6/36和AP-61細胞)、原代細胞系(如恆河猴胎肺細胞(FRhL-2)、BSC-1細胞和MRC-5細胞)或人二倍體成纖維細胞。本發明還涉及細胞類型的組合。使用黃病毒或其等價物感染C6/36或AP-61細胞。最優選的細胞類型為C6/36。
可以將細胞培養任意長的階段，優選允許黃病毒進入並感染細胞的階段。更優選地，將細胞培養至細胞培養物中的致細胞病變效應(cytopathiceffect)明顯時，其指示細胞中病毒活躍的感染。
這時，可以利用本領域技術人員已知的任何方法來裂解細胞。通常，可使用低滲緩衝液(包含去垢劑如Triton X)，只要該裂解緩衝液不會影響黃病毒或其等價物的免疫原但可使活病毒顆粒失活即可。
應理解的是，所述裂解物包含病毒免疫原性組分的混合物，其包括結構和非結構的病毒抗原以及完整的黃病毒顆粒。對於登革病毒來說，這些可選自DEN1、2、3或4等。本發明試圖通過提供生物樣品中響應於對黃病毒或其等價物的暴露而產生的結合伴侶混合物來提供抗原混合物。
優選地，所述黃病毒是登革病毒。
更優選地，所述黃病毒或登革熱特異性免疫原性組分是黃病毒或登革病毒的結構或非結構蛋白。更優選地，所述結構蛋白選自可被抗黃病毒IgA所捕獲的C-衣殼、M-膜和E-被膜蛋白等。更優選地，登革病毒的非結構蛋白選自NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5等。
可以採用任何方式對裂解物進行處理。優選地，將裂解物淨化以去除細胞核、細胞碎片和完整的黃病毒顆粒。可以將裂解物分裝並儲存於-80℃備用。
對於登革病毒來說，先前的方法使用特異性的登革熱抗原DEN1、2、3和4(存在於登革病毒感染細胞的上清中)來檢測指示登革病毒感染的抗體。然而，本發明不僅使用這些抗原，還使用在黃病毒暴露期針對其產生抗體的黃病毒分子/免疫原的混合物(存在於黃病毒感染的細胞中，其可包含黃病毒顆粒和其它免疫學組分，優選結構和非結構蛋白)。
所述黃病毒特異性免疫原性組分優選來自裂解物，所述生物樣品進行接觸從而所述裂解物的病毒免疫原性組分可以與所述生物樣品中含有的結合伴侶形成複合物。優選地，所述黃病毒顆粒的免疫原包括但不限於抗登革熱IgA捕獲的結構和非結構蛋白，所述免疫原與結合伴侶將形成複合物。優選地，所述特異性結合伴侶是來源於生物樣品的抗體或其片段。它們只有在受試者已暴露於登革病毒或被其免疫時才會存在。
複合物形成 在抗體(優選針對登革病毒或其等價物的IgA)與黃病毒特異性或反應性免疫原性組分之間會形成複合物。
本發明的方法和試劑盒試圖檢測組分和結合伴侶，其形成複合物並指示黃病毒感染。這些組分和結合伴侶在黃病毒感染過程中產生。
所述複合物可包含與來源於黃病毒或其等價物的一種或多種組分結合的一種或多種結合伴侶。但是，並非所有都是黃病毒特異性IgA。另一些分子例如IgG和IgM也可結合。
在使得複合物穩定形成或抑制競爭性免疫試劑(如特異性單克隆抗體)結合的條件下，將所述生物樣品與來源於黃病毒或其等價物的組分接觸足夠長的時間。
將所述黃病毒特異性免疫原性組分與所述生物樣品接觸，從而使得所述組分與所述生物樣品中的結合伴侶之間可以形成複合物。優選地，包含但不僅限於結構和非結構蛋白(優選通過具有黃病毒特異性表位的抗黃病毒IgA捕獲)的所述黃病毒顆粒的免疫原會與結合伴侶或競爭性黃病毒特異性免疫試劑(例如特異性IgA)形成複合物。優選地，所述特異性結合伴侶是所述生物樣品中存在的抗體或其片段。它們只有當受試者已暴露於黃病毒或被其免疫時才會存在。
優選地，抗體(優選特異性針對黃病毒屬成員或其等價物的IgA)與抗黃病毒IgA捕獲的黃病毒組分之間會形成複合物。於是，這指示樣品中存在黃病毒特異性IgA，並因此指示最近或之前的暴露。
如果所述組分上仍保留同樣表位的話，競爭性黃病毒或成員特異性的免疫試劑也會與所述組分形成複合物。當所述結合伴侶與所述免疫試劑特異性針對同一表位時會形成競爭，這指示所述結合伴侶的存在以及先前曾暴露於黃病毒。
本發明的優選方法依賴於檢測所述生物樣品中存在的黃病毒特異性結合伴侶(優選IgA)，所述結合伴侶特異性針對來源於黃病毒或其等價物感染的細胞之細胞裂解物中存在的黃病毒抗原組分，該組分是使用抗黃病毒IgA捕獲的。所述複合物可包含與源自黃病毒或其等價物的一種或多種組分結合的一種或多種結合伴侶。但是，在本發明中，鑑定出與所述複合物結合的IgA指示先前的暴露。
一經結合，可加入競爭性黃病毒特異性免疫試劑。因此，優選包括預孵育的步驟，其使得結合試劑與黃病毒特異性免疫原性組分在免疫試劑加入前形成複合物。但是，這些組分也可以同時加入。
檢測黃病毒特異性IgA的支持物 因此，另一方面，本發明提供了用於檢測受試者對黃病毒或其等價物之暴露的方法的固體支持物，所述方法包括 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物或其等價物進行接觸； 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及任選地 表徵所述複合物中的結合伴侶從而將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯； 所述支持物包含固定於其上的黃病毒特異性免疫原性組分。
所述固體支持物可以是本領域普通技術人員已知的並且結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分可與之結合的任何材料。例如，該固體支持物可以是微量滴定板中的測試孔或者硝酸纖維素膜或其它合適的膜。或者，所述支持物可以是珠或盤，例如玻璃、玻璃纖維、膠乳或塑膠材料(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。該支持物還可以是磁性顆粒或光纖傳感器，例如在美國專利No.5,359,681中公開的那些。
可用本領域技術人員已知的技術將所述結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分固定在固體支持物上，這已詳細描述於專利文獻和科學文獻中。在本發明中，術語「固定」既指免疫吸附或非共價結合(如吸附)，也指共價結合(其可以是抗原或核苷酸與支持物上的功能性基團直接連接，或者可以通過交聯劑進行連接)。優選使用吸附至微量滴定板的孔或吸附至膜的固定方式。在這些情形中，可以通過將結合伴侶或細胞裂解物組分與固體支持物在合適的緩衝液中接觸適當長的時間來實現吸附。接觸時間隨溫度而變化，通常約為1小時和過夜。
通常還可以通過首先將所述支持物與雙功能試劑反應來實現結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分與固體支持物的共價結合，所述雙功能試劑與支持物以及結合伴侶或細胞裂解物組分的官能團(羥基或氨基)均發生反應。例如，可以使用苯醌或者通過所述支持物上醛基與所述組分的胺基和活化氫縮合將所述結合伴侶或組分共價連接至具有適當聚合物包被的支持物(參見，例如Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook，1991，A12-A13)。
檢測、表徵和鑑定所述複合物的結合伴侶 然後，在使得複合物穩定形成的條件下，將源自黃病毒或其等價物的黃病毒特異性免疫原性組分與所述生物樣品接觸足夠長的時間。複合物一經形成，即加入檢測系統以檢測所述複合物中結合伴侶與所述黃病毒特異性免疫原性組分的特異性結合。
可以基於任何方便的方法來檢測源自黃病毒或其等價物的組分源自受試者的結合伴侶(例如免疫反應性分子)之間的複合物，所述方法是本領域技術人員已知的。
認為用於檢測形成複合物並指示生物樣品中黃病毒感染的組分和結合伴侶的方法包括但不僅限於免疫測定，例如免疫印跡、免疫細胞化學、免疫組織化學或抗體親和色譜、Western印跡分析或這些方法的變形或組合，或者本領域已知的另一些技術。
通常，可以通過本領域技術人員可用的任何方法在獲得自受試者的生物樣品中檢測形成組合物並指示黃病毒感染的組分和結合伴侶。在一個優選的實施方案中，所述檢測方法使用另外的檢測試劑(例如綴合有酶的特異性MAb和抗MAb)，其允許檢測所述複合物和結合伴侶。
在一個優選的實施方案中，本文所述方法包括使用源自感染了黃病毒或其等價物的細胞裂解物或者從其中純化的組分(在本文中可互換地指「組分」或「細胞裂解物組分」)，其固定於生物樣品的結合伴侶可吸附/結合於其上的固體支持物(例如聚苯乙烯或硝酸纖維素膜)上。然後可以使用包含報告基團並特異性結合所述組分/結合伴侶複合物的檢測試劑來檢測細胞裂解物組分與結合伴侶所形成的複合物。這樣的檢測試劑可包括例如抗體或特異性與結合伴侶結合的其它試劑，如抗免疫球蛋白(即抗體)、G蛋白、A蛋白或凝集素。或者，可使用競爭性測定，其中能夠與源自黃病毒成員的抗原結合的檢測試劑用報告基團進行標記，並使之與固定的細胞裂解物組分連同生物樣品中的結合伴侶結合。生物樣品中的結合伴侶抑制經標記的黃病毒檢測試劑與固定組分結合的程度指示生物樣品中結合伴侶與固定組分的反應性。
在一個優選的實施方案中，所述檢測試劑是能夠與生物樣品中的結合伴侶結合的抗體或二抗或其抗原結合片段。可以通過本領域普遍技術人員已知的多種技術之任一種或幾種來製備抗體(例如，參見Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。通常，可以利用細胞培養技術(包括產生單克隆抗體)或通過將抗體基因轉染進合適的細菌或哺乳動物細胞宿主(以產生重組抗體)來產生抗體。
可以將綴合有標記的二抗加入複合物以利於檢測。可以使用多種提供可檢測信號的標記。所述標記可選自色原、酶、催化劑、螢光團和直接可見的標記。對於直接可見的標記來說，可以使用膠體金屬或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物或膠乳顆粒。許多適於用作標記的酶已公開於美國專利No.4366241、4843000和4849338中。本發明中合適的酶標記包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶，優選辣根過氧化物酶。酶標記可單獨使用或與溶液中的另一種酶聯合使用。在本發明中，優選使用與辣根過氧化物酶(其隨後與其底物DAB反應並產生可察覺的顏色改變)連接的二抗來檢測複合物。
優選地，所述抗體是抗IgA抗體，從而檢測已與所述黃病毒特異性免疫原性組分結合的IgA結合伴侶。
所述方法概述 實施該測定可以通過首先將已固定在固體支持物(通常為微量滴定板的孔)上的生物樣品中的結合伴侶與如本文所述的黃病毒特異性免疫原性組分進行接觸，從而使所述組分與固定的結合伴侶(例如抗體)結合。或者，可以將所述黃病毒特異性免疫原性組分與固體支持物結合，從而使結合伴侶與固定的組分結合。然後，從固定的複合物除去未結合樣品，加入檢測試劑(優選能夠結合所述結合伴侶或所述組分並含有報告基團的二抗)。然後使用適用於特定報告基團的方法來測定仍結合在固體支持物上的檢測試劑的量。
更特別地，所述結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分一經如上所述固定於所述支持物上，通常將所述支持物上剩餘的結合位點封閉。可以使用任何本領域普通技術人員已知的合適封閉劑，例如血清白蛋白或含Triton X 100或吐溫20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)的脫脂乳。還可以用合適的稀釋緩衝液對所述組分或結合伴侶進行稀釋，所述緩衝液如含有人血清的磷酸鹽緩衝液(PBS)以及孵育前的Triton X 100或吐溫20。通常，合適的接觸時間(即孵育時間)優選30分鐘，其足以使得黃病毒特異性免疫原性組分與固定的結合伴侶結合，反之亦然。優選地，所述接觸時間足以實現與所結合的黃病毒特異性免疫原性組分上的靶表位結合水平是結合和未結合的結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分之間平衡時所達到水平的至少約95％。本領域普通技術人員會了解，可以通過測定一段時間內發生結合的水平來方便地確定達到平衡所需時間。在室溫(RT)下，約30-60分鐘的孵育時間通常足矣。
然後，可以通過用合適的緩衝液(例如含0.05％吐溫20TM或吐溫80的PBS)衝洗所述固體支持物來除去未結合的黃病毒特異性免疫原性組分或結合伴侶。然後可加入能夠結合所述結合伴侶且含有報告基團的檢測試劑。所述檢測試劑通常是抗IgA抗體。優選的報告基團包括本文所述的基團。然後將所述檢測劑與固定的結合伴侶-組分複合物一起孵育足夠長的時間以檢測所結合的組分或結合伴侶。通常可以通過測定在一段時間內發生結合的水平來確定合適的時間。然後除去未結合的檢測試劑，並使用報告基團來檢測結合的檢測試劑。用於檢測報告基團的方法取決於報告集團的性質。對於放射性基團來說，閃爍計數或放射自顯影方法通常是適用的。光譜方法可用於檢測染料、發光基團、顯色酶(chromogenic enzyme)和螢光基團。顯色酶包括但不僅限於過氧化物酶和鹼性磷酸酶。螢光基團包括但不僅限於異硫氰酸螢光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tetramethylrhodamine isothiocyanate，TRITC)、羅丹明、德克薩斯紅和藻紅蛋白。生物素可以使用偶聯有不同報告基團(通常為放射性或螢光基團，或者酶)的抗生物素蛋白來檢測。酶報告基團通常可通過加入底物(通常保持特定長短的時間)、隨後對反應產物進行光譜分析或其它分析來檢測。底物可選自如下試劑4-氯-1-萘酚(4-chloro-1-naphtol，4CN)、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine，DAB)、氨乙基咔唑(aminoethyl carbazole，AEC)、2，2』-連氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)(2，2』azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS)、鄰苯二胺(ophenylenediamine，OPD)和四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)。
優選地，還可以將多於一個報告基團偶聯至檢測試劑。在一個實施方案中，多個報告基團被偶聯至一個檢測試劑分子上。在另一實施方案中，可以將多於一種類型的報告基團偶聯至一種檢測試劑。不考慮特定的實施方案，可利用多種方式來製備帶有多於一種報告基團的檢測試劑。例如，多於一種的報告基團可直接與檢測試劑偶聯，或者可以使用提供多個連接位點的接頭。
在一個相關的實施方案中，本文所述的方法可以以流過(flow-through)或條帶測試(strip test)的方式進行，其中生物樣品中的結合伴侶或黃病毒特異性免疫原性組分被固定在膜(如硝酸纖維素膜)上。例如，在流過測試中，當樣品通過膜時，黃病毒特異性免疫原性組分能夠與固定的結合伴侶結合。或者，當樣品通過膜時，生物樣品中的結合伴侶能夠與固定的黃病毒特異性免疫原性組分結合。然後，當含有檢測試劑的溶液流過膜時，另一種經標記的檢測試劑與結合伴侶-組分複合物結合。隨後可以如上所述對結合的檢測試劑進行檢測。
在條帶測試中，將細胞裂解物組分所結合的膜的一端浸在含有生物樣品的溶液中。該生物樣品中的結合伴侶沿著膜遷移，其穿過含有檢測試劑的區域到達固定組分區域。在固定的結合伴侶-組分複合物區域的檢測試劑濃度指示生物樣品中結合試劑的存在。通常，該位點的檢測試劑濃度形成一種圖案，例如可見並可讀取的線。沒有這樣的圖案指示陰性結果。通常，當生物樣品包含的結合試劑水平足以形成三明治測定(以上述的形式)中的陽性信號時，膜上或聚苯乙烯板上所固定的結合伴侶的量會產生可見的可分辨圖案。通常可以用很少量的生物樣品進行這些測試。
在簡化的條帶測試或試紙條測試(dipstick test)中，可以將細胞裂解物組分固定在膜(如硝酸纖維素膜)上。然後，可以將膜條帶與生物樣品反應從而在組分和生物樣品中的結合伴侶之間形成複合物。隨後使用檢測試劑(如抗體)利用上述任意方法來檢測複合物。試紙條測試可以迅速指示先前的暴露，而無需使用大量生物樣品。
本文使用的「結合」是指兩個單獨分子的非共價結合，從而形成複合物。結合的能力可通過例如測定複合物形成的結合常數來評估。結合常數是將複合物的濃度除以組分濃度的乘積得到的值。通常，在本發明中，當複合物形成的結合常數超過約103L/mol時，認為兩個化合物「結合」。可使用本領域公知的方法來測定結合常數。
本發明的方法和試劑盒所涉及的膜包括可與結合伴侶、源自黃病毒或其等價物結合的膜。所述膜的實例包括但不限於硝酸纖維素膜、聚四氟乙烯濾膜、醋酸纖維素濾膜和硝酸纖維素濾膜。最優選地，所述膜為硝酸纖維素膜。
或者，本發明的診斷方法可使用生物微晶片而採用自動分析方法。例如，可組成診斷試劑盒，其使用包被有細胞裂解物組分的載玻片進行免疫印跡。如本文所述，該診斷試劑盒可包含生物學微晶片(其表面上固定有黃病毒特異性免疫原性組分)、合適的緩衝液、包含可檢測水平的結合試劑的標準樣品以及二級檢測試劑(secondary detection reagent)。
本發明的方法和試劑盒可檢測人或動物對黃病毒或該家族任意特定成員或其等價物的在急性感染期或恢復期的特定暴露。本文使用的「急性感染」是指病毒已感染宿主並且活躍複製和/或導致感染相關症狀(如發熱、皮疹(rush)、關節痛和/或腹痛)的一段時期。「恢復期」是指黃病毒不再增殖或維持在宿主血液中、並且已產生結合伴侶(例如但不僅限於抗體)的黃病毒感染周期階段。使用本發明的方法和試劑盒，可以在感染的患者或先前感染的患者中產生結合伴侶後的任何時間檢測暴露。
試劑盒 另一方面，本發明提供了用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA或者用於檢測黃病毒暴露的試劑盒，其包含 包含黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物；或 與第二支持物連接的包含黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物； 至少一種綴合有報告基團的檢測試劑，其用於檢測生物樣品中與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成複合物的結合伴侶；以及任選地 使用所述試劑盒進一步鑑定所述複合物之結合伴侶的說明書。
任選地，所述試劑盒還包括另外的部分，如實施該方法所需的清洗緩衝液，孵育容器，封閉緩衝液和說明書。
因此，本發明提供了用於檢測受試者暴露於黃病毒或該家族任意成員或其等價物的試劑盒。該試劑盒可以採用使生物樣品中的結合伴侶與抗登革熱IgA捕獲的黃病毒組分相互作用、並可進一步與競爭性黃病毒特異性免疫試劑進行競爭的任何方便的形式。生物樣品中存在黃病毒特異性結合伴侶的結果表明先前曾暴露於黃病毒。優選地，該試劑盒包含如本文所述的固體支持物，其適於接受或包含抗黃病毒IgA捕獲的黃病毒或其等價物組分。所述試劑盒還可以包含試劑、能夠提供可檢測信號的報告分子以及可選的使用說明書。該試劑盒可以採用組合的形式，其中各組成部分可以分別購買。
所述試劑盒可以是包括一個或多個成員的組合試劑盒，其中至少一個成員是包含抗黃病毒IgA捕獲的黃病毒或等價物或細胞裂解物(其包含源自黃病毒或其等價物的免疫原性組分)的黃病毒組分的固體支持物。
在一個可替代的實施方案中，所述固體支持物包含針對來自一個或多個受試者的一種或多種黃病毒或其等價物的一種或多種組分的結合伴侶之陣列。
本發明還提供本發明的方法中使用的試劑盒的單獨組分。本發明提供了固體支持物，其包括用於檢測黃病毒暴露的抗黃病毒IgA捕獲的黃病毒組分。在一個實施方案中，本發明提供了聚苯乙烯96孔板或硝酸纖維素膜來附著病毒抗原，其或者用作固定的抗黃病毒IgA捕獲的黃病毒組分，或作為點印跡，或者用作包含黃病毒或其等價物組分的試紙條。優選地，所述板或膜包含選自以下的組分黃病毒結構和非結構蛋白、黃病毒顆粒及其片段、源自黃病毒的糖蛋白、脂質和碳水化合物或其任意混合物等。
所述固體支持物還可以是細胞裂解物組分固定於其上的微量滴定板、載玻片或生物微晶片。然後，可將這些固體支持物與生物樣品接觸以檢測黃病毒暴露。優選地，使用來自經黃病毒感染的細胞裂解物的抗黃病毒IgA，利用聚苯乙烯微量滴定板通過免疫純化來附著黃病毒抗原。
在硝酸纖維素膜的情形中，所述第二支持物可以是固定器，其固定固體支持物以改善固體支持物(其包含固定的黃病毒組分)的操作。例如，硝酸纖維素膜可以靠小棒(stick)夾持，從而使該膜能夠浸入生物樣品(如血清)中。這作為試劑盒的組分是有用的，因為可以同時檢測少量的生物樣品。
評估感染的相對風險 再一方面，本發明還提供了一種評估限定區域(例如地理區域、住宅區域、運輸工具或醫學治療或評價中心)內一個或多個受試者暴露於黃病毒或其等價物的相對風險的方法，其包括 從限定區域內的代表性群體中獲得樣品；以及 通過包括以下步驟的方法來評估樣品群體中各成員暴露於黃病毒或其等價物的證據 將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分進行接觸；以及 測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況，其中所述複合物的存在指示該受試者暴露於黃病毒或其等價物；以及 通過表徵所述複合物中的結合伴侶來評估限定區域內暴露的相對風險。
可使用計算機可讀形式的軟體來進行風險分析。因此，本發明還涉及適於分析受試者或受試者群暴露於黃病毒或其等價物或者受試者或受試者群暴露於黃病毒或其等價物之風險的計算機可讀程序以及包含其的計算機。
本發明的方法或技術允許對由黃病毒或該家族任意成員或其等價物導致的感染髮作進行流行病學研究或血清監視。這些研究提供了多方面增進黃病毒疾病領域研究的有價值的信息。例如，流行病學研究有助於鑑定感染指標。這些信息使得能夠鑑定導致病毒爆發的病毒來源的特定區域。
此外，本發明的技術/方法允許快速鑑定或分離感染有黃病毒或其等價物的受試者，而無需主要的實驗室設備，甚至可以在野外條件下進行。這些信息有助於鑑定需要醫學治療的受試者以及確定需要進一步調查或進行疾病控制的區域，例如確定其孳生地及其控制方法。另外，本發明的技術允許監測已感染的患者以確定抗黃病毒特異性IgA的存在。IgA效價的降低或者其出現在感染早期可以指示繼發感染，並因此有助於監測隨後的黃病毒感染期(如登革出血熱(DHF)或登革休克綜合症(DSS))。
另外，本發明的技術提供了一種用於鑑定感染有黃病毒屬任意特定成員以及所參與血清型之受試者的方法，其允許快速檢測進一步感染的風險、指出感染的區域以及疾病控制策略。
本文對專利文獻或其它作為現有技術給出的事項的參考並非承認該文獻或事項是已知的或者其包含的信息是任意權利要求的優先權日時公知常識的一部分。
本發明中使用的方法實例將進行更充分地描述。但應理解的是，以下的描述僅為示例性的，而不應以任何方式作為對上述發明的概括性的限制。
實施例 實施例1開發使用血清的抗登革熱IgA(ACA-ELISA) a)製備抗原根據Cardosa等(2002)所述方法製備針對所有四種登革病毒血清型的裂解物登革病毒抗原。簡言之，將登革熱病毒(5m.o.i.)培養在C6/36細胞中，取決於致細胞病變效應的發生以及病毒的血清型，在含有2％胎牛血清的病毒維持培養基中孵育4～5天。將培養基倒出，用PBS衝洗包含感染細胞的培養瓶4次，用含有1％ trix100的1ml低滲緩衝液處理1小時，最後以14000rpm離心10分鐘。收集上清，並以250μl分裝至eppendorf管中，儲存於-70℃備用。
b)血清樣品使用3組總共292個經登革PCR確認的血清樣品作為陽性樣品。使用182個登革PCR呈陰性的患者血清樣品作為該研究的陰性樣品。
c)血清學測定使用IgM捕獲ELISA商用試劑盒(Pan-bio，Australia)測量本研究所用樣品中的抗登革熱特異性IgM抗體。根據製造商所述步驟實施此測試。
使用IgG間接ELISA商用試劑盒(Pan-bio，Australia)檢測本研究所用血清樣品中的抗登革熱特異性IgG抗體。根據製造商所述步驟實施此測試。
d)IgA捕獲ELISA(AAC-ELISA)使用Talarmin等(1998)和Balmaseda等(2003)所述的方法並進行微小改動。簡言之，用100μl包被緩衝液(碳酸氫鈉緩衝液，Sigma，USA)中1:500稀釋的抗人IgA(Source)包被96孔聚苯乙烯板(maxi-absorb，NUNC)，在37℃孵育2小時或者4℃孵育過夜。用封閉緩衝液(含0.1％ triton X100的5％脫脂乳)在37℃封閉1小時，用清洗緩衝液(含0.05％吐溫20的1×PBS)清洗4次。使用10對確診為登革熱的血清樣品(抗登革熱IgM和IgG)優化該測試。每個血清樣品在稀釋緩衝液(含0.1％ triton X100的5％脫脂乳)中進行1:100稀釋，並將100μl稀釋的血清樣品加至每個孔中，在室溫孵育1小時。每個板中保留1個陽性對照和3個陰性對照。在玻璃瓶中準備登革熱裂解物抗原(1:100)以及綴合有HRP的泛登革熱反應性單克隆抗體(1:1000)(ICL，USA)的混合物，並在室溫下孵育1小時。將所述板如上所述清洗6次之後，向每個孔中加入100μl抗原和MAb混合物，室溫下孵育1小時，然後再清洗6次。然後將100μl OPD(Sigma，UK)加至每個孔中，室溫下孵育5-10分鐘。然後用終止緩衝液(2.75％硫酸)終止反應，在ELISA讀數器中492nm處讀取所述板的讀數。使用以下公式計算結果，即測試樣品的OD值除以陰性樣品的平均OD值，然後乘以5。
e)抗原捕獲抗登革熱IgA ELISA(ACA-ELISA)以100μl/孔用包被緩衝液中1:1000稀釋的抗小鼠IgG包被96孔板(Max-absorb，NUNC)，然後在4℃孵育過夜或37℃孵育1小時。用封閉緩衝液在37℃下封閉所述板1小時後，將100μl在PBS中1:1000稀釋的泛-登革熱MAb(ICL，USA)加至每個孔中，在37℃孵育1小時。清洗4次後，將1:100稀釋的登革熱裂解物抗原(1-4)加至每個孔中，在37℃再孵育1小時。然後用清洗緩衝液清洗所述板4次，將100μl在稀釋緩衝液中1:100稀釋的測試血清加至每個孔中。每個板上保留1個陽性和3個陰性血清對照。在室溫孵育1小時後，再用清洗緩衝液清洗所述板6次，然後將100μl綴合有HRP的兔抗人IgA(1:4000)加入到每個孔，在室溫下再孵育30分鐘。孵育後，將所述板清洗6次，將100μl OPD(Sigma，USA)加入到每個孔，在室溫孵育5分鐘。使用硫酸(2.75％)終止進一步顯色，在ELISA讀數器中492nm處讀取所述板的讀數。使用以下公式計算結果，即測試樣品的OD值除以陰性樣品的平均OD值，然後乘以5。
f)ACA和AAC ELISA的分析靈敏度比較。通過使用強、中和弱的登革熱IgA陽性血清樣品來研究用於檢測患者血清中抗登革熱IgA的IgA捕獲(AAC)和抗原捕獲(ACA)酶測定的分析靈敏度。血清樣品以1:5至1:640在來自登革熱抗體(IgG、IgM和IgA)陰性的健康人血清中稀釋或者在稀釋緩衝液中稀釋，並用作儲存溶液。所述儲存稀釋液在稀釋緩衝液中進一步以1:100稀釋以用作工作溶液，如上所述實施所述測定(AAC和ACA ELISA)。通過如下公式計算由於稀釋緩衝液的血清中登革熱非特異性IgA所致的測定抑制 抑制百分比(PI)＝100-(血清稀釋液中OD值/稀釋緩衝液中OD值)×100。
g)測定的標準化棋盤式滴定(checkerboard titration)顯示，100μl抗小鼠IgG、100μl泛登革熱MAb(在PBS中1:1000，以1:100稀釋的100μl裂解物抗原)對於96孔板測定來說是最佳的(圖1)。通過針對抗人IgA的棋盤式滴定使用10個登革熱陽性和6個登革熱陰性抗體血清樣品來確定ELISA中所用的血清樣品最佳稀釋度(1:100)(圖2)。類似的，通過棋盤式滴定來確定用於ACA-ELISA的兔抗人IgA-HRP的最佳稀釋度，其在1:4000時是最佳的。
使用12.5至1:800的樣品系列稀釋進行所述測定的血清稀釋。在此測定中使用8個抗登革熱IgA陽性和6個抗登革熱IgA陰性血清樣品。甚至在1:800稀釋時，平均所有的陽性血清樣品均為陽性，而陰性樣品則沒有呈陽性的(圖3)。2個樣品略高於臨界值，該測定的血清稀釋度固定在1:100(4倍於陰性樣品稀釋度)並在整個測定中使用。
使用以10-37天間隔收集的10對登革熱PCR陽性急性和恢復期血清樣品進行ACA-ELISA。以1:100檢測血清，結果顯示所有確診為登革熱的10個恢復期血清顯示出高水平的抗登革熱裂解物抗原之抗登革熱IgA(圖4)。
實施例3兩種IgA測定的分析靈敏度比較 使用2種不同稀釋劑中(例如登革熱陰性血清和稀釋緩衝液)的登革陽性IgA血清樣品進一步分析兩種抗登革熱IgA測定(AAC-ELISA和ACA-ELISA)的靈敏度水平。圖4顯示，在AAC-ELISA中，當在陰性血清中稀釋時具有高水平抗登革熱IgA的血清之靈敏度相比於稀釋緩衝液中低32倍，由於血清稀釋劑中高水平非登革熱特異性IgA造成的抑制為43.71％～79.79％(圖4)。
另一方面，在ACA-ELISA中，兩種稀釋劑(陰性血清和稀釋劑緩衝液)中的登革熱特異性IgA的檢測水平相同，血清稀釋劑中存在的非登革熱特異性IgA的抑制是可忽略的，為-11.08％～-61.76％(圖4)。
實施例4ACA-ELISA的靈敏度和特異性 使用在急性期和恢復期收集的296例確診為登革熱的以及182例登革熱陰性的血清樣品實施該實施例。在所述確診為登革熱的樣品中，96例收集自發熱發作的第1-3天，97例樣品收集自第3-7天，而102例收集自發熱發作的第10-37天。182例血清樣品收集自登革熱PCR呈陰性而在樣品收集過程中發生發熱的患者。ACA-和AAC-ELISA的靈敏度和特異性顯示於表1和表2中。
表1.血清ACA-ELISA的靈敏度和特異性
表2.顯示AAC-ELISA的靈敏度和特異性
實施例5使用兩種抗登革熱IgA測定和IgM抗體捕獲(MAC)-ELISA在確診為登革熱的血清樣品中產生抗登革熱IgA和IgM的動力學。
使用3組101例確診為登革熱的血清樣品來研究IgA(AAC和ACA-ELISA)和IgM的動力學。總共292例樣品收集自急性期和恢復期。分三次收集發熱發作後的血清樣品(第一組(1-3天)、第二組(3-7天)和第三組(10-37天))。在所述登革熱陽性血清樣品中，第一組(1-3天)中35.79％是抗登革熱IgA陽性的，第二組(3-7天)中61.46％是陽性的，而第三組(10-37天)中85.15％血清樣品是陽性的。
另一方面，在第一組中AAC-ELISA的檢測水平是6.49％，第二組中是41.67％，第三組中是72.50％。相當地，在同樣的疾病階段中抗登革熱IgM的存在情況如下第一組中6.67％，第二組中66.67％，第三組中79.61％(圖6)。當用於檢測醫院樣品的抗登革熱IgA時，實施ACA-ELISA觀察到類似的水平(圖7)。
新開發的ACA-ELISA顯示出相比於ACC-ELISA更好的表現。這是由於在ACA-ELISA中消除了非登革特異性IgA的幹擾，其在AAC-ELISA中抑制43.71％至79.79％，特別是在登革熱疾病的早期。相比於MAC-ELISA，ACA-ELISA還檢測到更多的登革熱病例，其可能是由於在繼發感染中缺少登革熱IgM產生(Chanama等2004)，而發現92.1％的IgA與IgG相關。該研究提示ACA-ELISA可單獨或者與MAC ELISA聯合用於檢測更多的登革熱病例(在確診為登革熱的病例中為76.26％)。
實施例6開發使用唾液的ACA-ELISA a)抗原捕獲抗登革熱IgA ELISA(ACA-ELISA)用100μl/孔在包被緩衝液中1:1000稀釋的泛-登革熱MAb包被96孔板(Max-absorb-NUNC)，然後在4℃孵育過夜或37℃孵育1小時。用封閉緩衝液在37℃下封閉所述板1小時後，將1:100稀釋的登革熱裂解物抗原加入到每個孔，在室溫再孵育1小時。然後用清洗緩衝液清洗所述板4次，將100μl在稀釋緩衝液中1:5稀釋的測試唾液加入到每個孔。每個板上保留1個陽性和3個陰性血清對照。在室溫孵育1小時後，再次用清洗緩衝液清洗所述板6次，然後將100μl綴合有HRP的兔抗人IgA(1:4000，Dakocytomation，Denmark)加入到每個孔，在室溫下再孵育30分鐘。孵育後，將所述板再清洗6次，將100μl OPD(Sigma，USA)加入到每個孔，在室溫孵育5分鐘。使用硫酸(2.75％)終止進一步顯色，在ELISA讀數器中492納米處讀取所述板的讀數。使用以下公式計算結果，即測試樣品的OD值除以陰性樣品的平均OD值，然後乘以5。
b)測定的標準化棋盤式滴定顯示，100μl泛登革熱MAb(包被緩衝液中1:4000，0.25ng/孔)和1:100稀釋的100μl裂解物抗原對於96孔板中的抗原來說是最佳的。通過針對抗人IgA的棋盤式滴定使用來自5個確診為登革熱的病例(PCR)的唾液和來自健康供體的作為陰性對照的5個唾液樣品來確定ELISA中所用的唾液樣品最佳稀釋度。類似的，通過棋盤式滴定來確定用於ACA-ELISA的兔抗人IgA-HRP以及用於AAC-ELISA的抗小鼠IgG的最佳稀釋度，其分別是1:4000和1:3000。
在稀釋緩衝液中1:1:25至1:640範圍內測試從5-7天的登革熱PCR陽性患者中收集5個唾液樣品以及來自健康志願者的5個樣品。結果顯示，來自5個確診為登革熱的患者之所有唾液樣品顯示高水平的針對登革熱裂解物抗原的抗登革熱IgA，其效價為1:160至1:640，而除了2個在稀釋水平多至1:1:25時顯示輕微反應之外，5個登革熱陰性唾液樣品即使在較低稀釋度下(1:2.5)也不顯示任何的反應(圖6)。因此，對於ACA-ELISA，唾液稀釋的臨界點設在1:5(4倍)，並在整個研究中使用。
使用收集自急性期和恢復期(1-3天、4-7天和10-37天)的184例登革熱PCR確認的唾液樣品進行ACA-ELISA。104例唾液樣品收集自已發熱但登革熱PCR測試呈陰性的患者。收集自健康者的50例唾液樣品在本研究中用作陰性樣品。發現100μl泛-登革熱MAb(包被緩衝液中1:4000，0.25ng/孔)和1:100稀釋的100μl裂解物抗原對於96孔板中的抗原是最佳的。
實施例7使用AAC-和ACA-ELISA檢測抗登革熱IgA 使用兩種抗登革熱IgA測定(AAC-ELISA和ACA-ELISA)測試來自106個確診為登革熱的患者之唾液和血清樣品中抗登革熱IgA的存在情況。結果顯示，在ACA-ELISA中63.04％的唾液樣品和48.08％的血清樣品是登革熱IgA陽性的，而在AAC-ELISA中32.40％的唾液樣品和37.15％的血清樣品是陽性的。
通過ACA-ELISA顯示的在登革熱疾病期間唾液中產生的抗登革熱IgA的動力學顯示出在感染早期出現登革熱反應性IgA，在疾病(出現發熱)的第二周內達到100％，在第五周之後逐漸消退(圖10)。
在急性期和恢復期的3次血清收集(1-3天、4-7天和10-37天)期間，ACA-ELISA檢測的登革熱陽性病例水平分別為61.04％、70.83％和54.35％。相比於MAC-ELISA，在1-3天(圖11)基於唾液的ACA-ELISA檢出多出50％的登革熱病例，這清楚地表明了此技術在使用非侵入性樣品(例如唾液)早期檢測登革熱感染的有效性。
表32乘2表格顯示基於唾液的ACA-ELISA對於在發熱發作的第1-37天之間收集的184例唾液樣品的靈敏度、特異性、陽性和陰性的預測值。

陽性預測值＝91.89％ 陰性預測值＝79.57％
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權利要求
1.一種用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA的方法，所述方法包括
將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及
測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及
用抗IgA抗體來表徵所述複合物中的結合伴侶。
2.一種檢測受試者對黃病毒或其等價物的暴露的方法，所述方法包括
將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及
測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；
表徵所述複合物中的結合伴侶；以及
將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯。
3.根據權利要求1或2的方法，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分捕獲自經黃病毒或其等價物感染的細胞之裂解物。
4.根據權利要求1的方法，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分通過單克隆抗體進行捕獲。
5.根據權利要求1的方法，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分選自黃病毒結構和非結構蛋白、黃病毒顆粒及其片段、源自黃病毒的糖蛋白、脂質和碳水化合物。
6.根據權利要求5的方法，其中所述結構蛋白選自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核衣殼蛋白。
7.根據權利要求6的方法，其中所述結構蛋白是被膜蛋白。
8.根據權利要求1的方法，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分選自登革病毒血清型免疫原性組分，其選自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4。
9.根據權利要求2的方法，其中所述方法檢測對選自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的登革病毒血清型的暴露。
10.根據權利要求5的方法，其中所述非結構蛋白選自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5。
11.根據權利要求10的方法，其中所述非結構蛋白是NS-1。
12.根據權利要求1的方法，其中所述免疫原性組分是針對黃病毒抗體之抗原結合位點的抗獨特型抗體，所述黃病毒抗體響應於對源自黃病毒或其等價物的組分之暴露而產生。
13.根據權利要求1的方法，其中所述結合伴侶是黃病毒特異性抗體或其免疫學片段。
14.根據權利要求13的方法，其中所述結合伴侶是在黃病毒感染早期、恢復期表達的抗體或者源自先前感染的抗體。
15.根據權利要求1的方法，其中所述結合伴侶是IgA抗體。
16.根據權利要求1的方法，其中所述黃病毒選自黃熱病毒、登革病毒和日本腦炎病毒。
17.根據權利要求16的方法，其中所述黃病毒是登革病毒。
18.根據權利要求13的方法，其中所述結合伴侶抗體是特異性針對選自DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4的登革熱血清型的IgA抗體。
19.根據權利要求1的方法，其中所述生物樣品選自血液、唾液、脊髓液、B細胞、T細胞、血漿、血清、尿和羊水。
20.根據權利要求19的方法，其中所述生物樣品是血清或唾液。
21.根據權利要求1的方法，其中使用抗IgA抗體來表徵所述結合伴侶。
22.根據權利要求21的方法，其中所述抗IgA抗體結合有報告基團。
23.根據權利要求22的方法，其中所述報告基團是酶。
24.用於根據權利要求1之方法的固體支持物，所述方法包括
將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物或其等價物進行接觸；
測定該生物樣品中存在的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況；以及任選地
表徵所述複合物中的結合伴侶從而將所述結合伴侶與對黃病毒的暴露相關聯；
所述支持物包含固定於其上的黃病毒特異性免疫原性組分。
25.根據權利要求24的固體支持物，其選自珠、盤、磁性顆粒或光纖傳感器、微量滴定板、載玻片或生物微晶片或膜，所述膜包括硝酸纖維素膜、聚四氟乙烯濾膜、醋酸纖維素濾膜和帶濾紙載體的硝酸纖維素濾膜。
26.一種用於檢測受試者中特異性針對黃病毒或其等價物的IgA或者用於檢測黃病毒暴露的試劑盒，其包含
包含黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物；或
與第二支持物連接的包含黃病毒特異性免疫原性組分或其等價物的固體支持物；
至少一種綴合有報告基團的檢測試劑，其用於檢測生物樣品中與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成複合物的結合伴侶；以及任選地
使用所述試劑盒進一步鑑定所述複合物之結合伴侶的說明書。
27.根據權利要求26的試劑盒，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分固定於固體支持物上。
28.根據權利要求26的試劑盒，其中所述黃病毒特異性免疫試劑通過單克隆抗體進行捕獲。
29.根據權利要求28的試劑盒，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分選自黃病毒結構和非結構蛋白、黃病毒顆粒及其片段、源自黃病毒的糖蛋白、脂質和碳水化合物。
30.根據權利要求29的試劑盒，其中所述結構蛋白選自被膜蛋白、Pr膜蛋白和核衣殼蛋白。
31.根據權利要求30的試劑盒，其中所述結構蛋白是被膜蛋白。
32.根據權利要求26的試劑盒，其中所述黃病毒選自黃熱病毒、登革病毒和日本腦炎病毒。
33.根據權利要求32的試劑盒，其中所述黃病毒是登革病毒。
34.根據權利要求29的試劑盒，其中所述黃病毒特異性免疫原性組分選自登革病毒血清型免疫原性組分DEN-1、DEN-2、DEN-3或DEN-4。
35.根據權利要求29的試劑盒，其中所述非結構蛋白選自NS-1、NS-2a、NS-2b、NS-3、NS-4a、NS-4b和NS-5。
36.根據權利要求35的試劑盒，其中所述非結構蛋白是NS-1。
37.一種評估限定區域(例如地理區域、住宅區域、運輸工具或醫學治療或評估中心)內一個或多個受試者暴露於黃病毒或其等價物的相對風險的方法，其包括
從限定區域內的代表性群體中獲得樣品；以及
通過包括以下步驟的方法來評估樣品群體中各成員暴露於黃病毒或其等價物的證據
將來自受試者的生物樣品與黃病毒特異性免疫原性組分混合物進行接觸；以及
測定該生物樣品中的結合伴侶與黃病毒特異性免疫原性組分之間形成的複合物的存在情況，其中所述複合物的存在指示該受試者暴露於黃病毒或其等價物；以及
通過表徵所述複合物中的結合伴侶來評估限定區域內暴露的相對風險。
全文摘要
抗原捕獲IgA酶聯免疫吸附測定(antigen capture IgA Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ACA-ELISA)已被開發用於檢測抗黃病毒IgA。該測定使用由單克隆抗體捕獲的黃病毒裂解物抗原，優選登革病毒裂解物抗原。優選使用綴合有報告基團(例如辣根過氧化物酶(HRP))的兔抗IgA來檢測測試血清中的所捕獲抗黃病毒IgA。發現該測定比抗人IgA捕獲ELISA(AAC-ELISA)靈敏至少8倍。發現基於血清或唾液的ACA-ELISA與「黃金標準」抗登革熱IgM檢測技術相比更加靈敏和快速，並且可用作感染早期確診登革熱的診斷工具。
文檔編號G01N33/569GK101479606SQ200780022652
公開日2009年7月8日 申請日期2007年5月10日 優先權日2006年5月11日
發明者比容·庫馬爾西, 葉秀蓮 申請人:國家環境局