用於產生黏膜免疫的口服疫苗的製作方法

2023-06-09 22:48:51

專利名稱：用於產生黏膜免疫的口服疫苗的製作方法
技術領域：
本發明一般性地涉及適合儲存、施用及改善疫苗中使用的抗原或免疫原的免疫原性的組合物。特別地，本發明涉及用於改善對細菌抗原的免疫應答的基於脂質的佐劑或者載體。更特別地，本發明涉及具有特定的脂質成分的基於脂質的佐劑或者載體，以及其用於提供對衣原體(Chlamydia)和螺桿菌(Helicobacter)引起的感染改善了的免疫應答的用途。背景大量感染性病原體侵入黏膜表面導致感染和疾病。全世界影響人類和動物群體的兩種重要黏膜病原體是衣原體和螺桿菌。世界衛生組織(WHO)估計在1999年全世界有9千 2百萬個衣原體生殖器感染新病例，並且感染的發病率在發達國家和發展中國家均持續增力口 (KW，Timms P. Journal ofReproductive Immunology 2000 ；48(1) :47-68)。螺桿菌據信感染全世界50%的人群，在一些發展中國家比率超過90% (Del Giudice，G.，et al. ,Annu RevImmunol,2001. 19 :ρ· 523-63 ；Frenck, R. W. , Jr.and J.Clemens, Microbes Infect, 2003. 5(8) :p. 705-13)。衣原體衣原體屬的成員引起許多伴有嚴重併發症的眼部、生殖器和呼吸道疾病，如致盲性沙眼、盆腔炎性疾病、異位妊娠和輸卵管因素不孕、間質性肺炎，以及可包括動脈粥樣硬化、多發性硬化、成年型哮喘(adult-onsetasthma)和阿爾茨海默病在內的慢性疾病，。沙眼衣原體(Chlamydia trachomati)和肺炎衣原體(C. pneumoniae)感染各種黏膜表面，引起許多疾病，包括盆腔炎性疾病(PID)、不育、致盲的沙眼、呼吸道疾病、動脈粥樣硬化和哮喘加劇(Faal，N.，et al.，PLoS Med, 2006. 3 (8) :p. e266 ；Mabey, D. and R. Peeling, Sexually transmitted infections,2002. 78(2) :p. 90-2 ；Hansbro, P. Μ. , et al. ， Pharmacol Ther,2004. 101(3) :p. 193-210 ；Horvat, J. ， et al. ， Am J Respir Crit Care Med，2007)。衣原體科的生物體是專性細胞內細菌。它們缺乏幾種代謝和生物合成途徑並依賴於宿主細胞的中間體，包括ATP。衣原體以兩個階段存在(1)稱為原體(elementary body) 的感染性顆粒，及(2)稱為網狀體(reticulate body)的細胞質內的繁殖形式。通常感染人類的有三種已描述的衣原體種。沙眼衣原體引起眼病沙眼及性傳播感染，衣原體。鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)引起鸚鵡熱，肺炎衣原體導致某形式的肺炎。另外，小鼠易感於鼠型沙眼衣原體(C. muridarum)，其引起小鼠的生殖道感染。前二個種含有許多基於細胞壁和外膜蛋白中的差異的血清變型。肺炎衣原體含有一個血清變型一TWAR生物體。衣原體具有可促進附著於細胞的血凝素。細胞介導的免疫應答很大程度上是炎症期間組織損傷的成因，儘管已描述了一種內毒素樣毒素。大多數人類和動物病原體包括衣原體均通過黏膜表面而發起感染。類似地，衣原體生殖道感染可發生自黏膜表面的感染。因此，針對這種病原體的保護性免疫可需要誘導強黏膜免疫應答。儘管明顯需要疫苗以針對經黏膜部位的感染提供保護，但是目前使用的疫苗是通過真皮內或皮下注射而給予的。然而，在腸胃外免疫後的黏膜免疫應答通常是弱的。沙眼衣原體感染是世界範圍內最常見性傳播細菌感染。沙眼衣原體引起性傳播生殖器和直腸感染。男人中沙眼衣原體感染的頻率可等於或超過淋病的頻率。男人中非淋球菌性尿道炎、附睪炎和直腸炎可緣於沙眼衣原體感染。淋病患者由沙眼衣原體超感染也會發生。年輕女性中的急性輸卵管炎和宮頸炎可以由源於宮頸的沙眼衣原體感染所引起。已報導了患有淋病的女性中由沙眼衣原體導致的高比率生殖道共感染。沙眼衣原體分離自被感染婦女的輸卵管。在一個報導中，從患有輸卵管炎的患者的腹膜腔中取得附著於精子的沙眼衣原體原體。在感染的產道中暴露於沙眼衣原體的新生兒可在5-14天內發生急性結膜炎。該疾病由顯著的結膜紅斑、淋巴網狀內皮細胞增殖及膿性排出物所表徵。未治療的感染可發展為肺炎；這種類型的肺炎僅在生命的前4-6個月發生。最近，沙眼衣原體已被懷疑引起成人的下呼吸道感染，並且已報導了幾例在無免疫應答的患者中的沙眼衣原體肺炎，從所述患者中分離了所述病原體。還有證據表明沙眼衣原體可在免疫活性的人中引起肺炎或者支氣管肺部感染。與沙眼衣原體感染相關的後遺症包括盆腔炎性疾病、異位妊娠和不育，這是除了 HIV/AIDS之外任何STI的代價最大的健康後果(Westrom L, Mardh P. A.，Br Med Bull 1983Apr ;39 (2) :145-50)。另外，存在的衣原體感染增加了感染HIV (Ho幾，et al.， J Exp Med 1995Apr 1 ； 181 (4) :1493-505)和單純皰疹感染(Kaul R, et al.，J Infect Dis 2007Dec 1 ；196(11) :1692-7)的風險。由於大多數衣原體感染無症狀的性質(Stamm WE. · In Woodall JP, editor. Proceedings of the Chlamydia Vaccine Development Colloquium ；2004 ；Alexandia,Virginia :The Albert B.Sabin Vaccine Institute ；2004. p. 15-8)，有效的抗生素治療的可利用性不能減緩日益增加的感染髮病率，通常據信需要有效的疫苗來控制這種隱性的流行病(silent印idemic)。螺桿菌螺桿菌屬細菌包括幽門螺桿菌被認為是幾種類型的胃腸疾病的重要病因。胃黏膜的螺桿菌感染與諸如慢性活動性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等疾病的發展相關聯，並且與胃腺癌發展相關聯(Enno, A.，et al.，Am J Pathol, 1998. 152(6) :ρ· 1625-32 ；Correa, P. ,J Natl Cancer Inst,2003. 95(7) :p. E3 ；Ernst, P.and B. Gold, Annu Rev Microbiol, 2000. 54 :p. 615-40 ； Uemura, N.，et al.，N Engl J Med, 2001. 345(11) :ρ· 784-9)。概述我們發現了先前本領域未認識到的問題，即儘管許多人類和動物病原體經黏膜感染生物體，但是在黏膜中發揮作用以保護動物的有效疫苗的開發即便不是不可能也是非常困難的。存在的主要問題是口服輸送的疫苗在它們到達免疫誘導部位如淋巴集結 (Peyer' s patches)之前就由於胃酸性及蛋白酶解破壞而降解。腸相關淋巴組織的不適宜刺激也可以誘導口服耐受而非獲得性免疫。另外，儘管嚙齒類免疫可以通過使用霍亂毒素(CT)而增加，但是CT不被人類耐受。尚未有針對衣原體或螺桿菌的有效疫苗被批准用於人類。因此，目前對於在黏膜有效並且模擬霍亂毒素的有益效果但是沒有在人類中觀察到有害副作用的組合物和方法有巨大需求。我們出乎意料地發現一些脂質組合物、特別是含有長鏈脂肪酸的那些脂質組合物當用作佐劑或者載體時，可以解決這些及其它問題以促進黏膜免疫並且提供針對衣原體和螺桿菌引起的黏膜感染的保護。我們還出乎意料地發現一些脂質組合物當用作佐劑或者載體時與分離的衣原體抗原一起可以提供針對衣原體的免疫，其與霍亂毒素一樣有效，但是沒有有害的毒性副作用。基於現有觀測一些脂質組合物當與活生物體一起使用時可以改善免疫應答(PCT/ NZ2002/00132，引入本文作參考)，這個發現是完全出乎意料的。類似地，我們出乎意料地發現一些脂質組合物當用作佐劑或者載體時與幽門螺桿菌抗原一起可以提供針對黏膜幽門螺桿菌感染的免疫。這個發現基於現有觀測是完全出乎意料的。另外，口服疫苗接種存在由於疫苗抗原在胃和消化系統的其它部分的降解所致的主要問題。這些問題可以是由於抗原在到達免疫誘導部位如淋巴集結之前的胃酸性和/或蛋白酶解破壞所致。因此，腸相關淋巴組織(「GALT")的不適宜刺激也可以誘導口服免疫耐受而非獲得性免疫，不導致保護而是可以惡化與抗原相關的病症狀。因此，本文首次證實滅活抗原(killed antigen)(與活生物體或減毒生物體相反)可以在口服活性疫苗中施用，並且可以誘導黏膜免疫，由此保護動物免受病原生物體的黏膜感染。附圖簡述本發明參照其特定的實施方案進行描述。本發明其它特徵可以參照附圖理解，其中圖IA和IB描繪了血清中(

圖1A)和陰道灌洗中(圖1B)M0MP特異性抗體的圖， IgG和IgA由ELISA確定。y軸顯示終點效價(Ε. P. T)比率，其通過用免疫組Ε. P. T除以非免疫對照Ε. P. T而確定。脂質C和衣原體MOMP —起產生與非免疫動物相比大約加倍的IgA 生產，這個效果類似於用CpG/CT和MOMP—起所觀測到的。我們的結論是脂質C可以增加陰道黏膜對衣原體MOMP抗原的免疫學應答。結果代表兩個單獨實驗，每個實驗中每組5隻小鼠。0.05，"ρ <0.01，與未免疫對照相比。誤差杆，平均值的標準誤差。圖2Α和2Β描繪了在用鼠型沙眼衣原體進行活細菌攻擊後從陰道拭子回收的細菌。在用鼠型沙眼衣原體進行陰道內攻擊後以3天間隔從經免疫的(與CpG/CT混合的Μ0ΜΡ、脂質C配製的MOMP或者脂質C配製的與CpG/CT混合的Μ0ΜΡ)和對照小鼠收集陰道拭子。以3天間隔經細胞培養確定從陰道拭子的活細菌回收(細菌釋放(bacterial shedding))(圖2A)。感染性總水平通過測量每個曲線下面積確定(圖2B)。結果代表每組5個動物的2個獨立實驗。我們出乎意料地發現與暴露於單獨MOMP的動物相比脂質C和MOMP —起降低細菌釋放大約60% (圖2B)。CpG/CT和MOMP—起降低細菌釋放57%。 另外，我們出乎意料地發現與CpG/CT+MOMP處理的動物相比脂質C降低細菌釋放(脂質 C+MOMP+CpG/CT)大約48% < 0. 05,***p < 0. 001，與未免疫對照相比。誤差杆，平均值的標準誤差。這些結果表明脂質C可以與CpG/CT協同作用以提高陰道黏膜的免疫學應答。圖3A和;3B描繪了血清(上部)和糞便沉澱洗液(fecal pellet wash)(下部)中的幽門螺桿菌特異性抗體的圖。IgG和IgA由ELISA確定。y軸顯示終點效價(Ε. P. T)比率，其通過用免疫組Ε. P. T除以非免疫對照Ε. P. T而確定。結果代表兩個單獨實驗，其在每個實驗中含有每組5隻小鼠。圖3A顯示與未免疫對照相比脂質C增加血清中幽門螺桿菌特異性IgG的產生。另外，圖:3B顯示脂質C增加糞便沉澱中的幽門螺桿菌特異性IgA的產生(圖3B)。用脂質C和幽門螺桿菌抗原觀測的保護程度在回收的細菌降低大約25%，其代表生物體中降低的細菌載荷。誤差杆，平均值的標準誤差。這些結果表明脂質C可以促進胃腸道中的黏膜免疫。圖4A、4B和4C描繪了血清(圖4A)、支氣管肺泡灌洗(圖4B)和陰道灌洗(圖4C) 中衣原體MOMP特異性抗體的圖。IgG和IgA效價由ELISA確定。y軸顯示終點效價(Ε. P. T) 比率，其通過用免疫組Ε. P. T除以非免疫對照Ε. P. T而確定。結果代表兩個單獨實驗，其在每個實驗中含有每組5隻小鼠。< 0. 05，**p < 0. 01，與未免疫對照相比。誤差杆，平均值的標準誤差。口服脂質C加MOMP產生了血清IgG的適度升高(圖4A)。口服脂質C加 MOMP在呼吸道中效果很小(圖4B)。相反，口服脂質C加MOMP使陰道MOMP特異性IgA增加大約2倍(圖4C)。圖5描繪了用幽門螺桿菌SSI胃內攻擊後細菌回收的圖。小鼠在最終免疫之後1 周用兩次胃內接種IxlO7Cfu幽門螺桿菌SSI而攻擊。在活細菌攻擊後6周，將胃組織勻漿並在含有GLAXO-補充物的CSA瓊脂平板上培養6天(見材料和方法)。y軸顯示勻漿胃組織的菌落形成單位數量/g(cfu/g)，由log尺度表示。用脂質C和幽門螺桿菌SSl抗原組合免疫導致在胃內接種後6周從胃組織回收的細菌與非免疫動物相比降低大約25%。與未免疫對照相比，幽門螺桿菌加CpG/CT降低細菌回收，而加入脂質C進一步降低細菌回收大約85%。結果代表兩個獨立實驗。與未免疫對照相比0.05;每個實驗每組η = 5隻動物。誤差杆，平均值的標準誤差。這些結果表明含有脂質C的口服組合物可以促進胃中針對幽門螺桿菌的黏膜免疫。圖6描繪了用鼠型沙眼衣原體活細菌攻擊後從肺組織回收的細菌。用活鼠型沙眼衣原體鼻內攻擊由與CpG/CT混合的MOMP 口服免疫的、由脂質C配製的MOMP 口服免疫的、 或者由脂質C配製的與CpG/CT混合的MOMP 口服免疫的雌性BALB/c TCI以及及未免疫的對照小鼠。細菌攻擊後12天(峰值感染點)取出肺，通過培養確定回收的活衣原體的量。 結果代表兩個獨立實驗。這些結果顯示用脂質C和MOMP —起口服免疫與未免疫對照相比降低衣原體的回收、< 0. 05 ；每個實驗每組η = 5隻動物，誤差杆是平均值的標準誤差。詳細描述黏膜免疫黏膜表面是病原生物體進入的主要入口(portal)。因此，它們由黏膜免疫系統防禦，所述系統與全身性免疫系統在功能和解剖學上是不同的。黏膜和全身性免疫系統一起工作以提供針對病原體的保護作用。在腸中，抗原呈遞細胞(APC)選取(sample)腔抗原(luminal antigen)將表位呈遞給淋巴集結中的淋巴細胞並排出(draining)腸繫膜淋巴結(Owen, R. and A. Jones, Gastroenterology, 1974. 66(2) :ρ· 189-203 ；Iwasaki, A. and B. Kelsall, J ExpMed，2000. 191 (8) :ρ· 1381-94)。作為在APC和淋巴細胞群體中豐富的主要的黏膜誘導部位，腸相關淋巴組織(GALT)代表了用於通過口服免疫誘導保護性黏膜免疫的有吸引力的位點。胃腸道暴露於各種抗原，其包括產生自正常代謝過程的「自身」抗原、攝入的食物抗原及來自共生菌群或病原生物體的那些抗原。為了有效起作用，需要免疫系統從可能對宿主「有害」的那些抗原中區分「好」抗原。口服耐受性是免疫系統用於產生對視為無害的那些抗原免疫無應答狀態的特定機制。在口服免疫後用於免疫呈遞的抗原攝取可以通過許多機制實現。腸細胞攝取、加工並呈遞抗原給基底外側表達的MHC II類分子上的T細胞(S. G. Mayrhofer, and L. Spargo, in Immunology. 1990 ；Hershberg, R. Μ., etal.,J Clin Invest. 1998. p. 792-803)。位於整個固有層的樹突狀細胞(DC)通過上皮細胞之間的緊密連接而「擠壓」它們的樹突來選取腔抗原(Rescigno，Μ.，et al.，Nat Immunol, 2001. 2 (4) :ρ· 361-7)。小結相關上皮(M)細胞非特異性地轉運腔抗原穿過小腸上皮屏障至下面的抗原呈遞細胞(APC)包括 DC 和巨噬細胞(Bockman, D.，etal.，Ann N Y Acad Sci, 1983. 409 :ρ· 129-44 ；Bockman, D. and Μ. Cooper, Am JAnat, 1973. 136(4) :ρ. 455-77 ；Neutra, Μ. R. , et al. , Cell Tissue Res. 1987. p. 537-46)。通過主動免疫引入GALT的蛋白質抗原通常導致誘導耐受而非免疫。因為胃腸道是入口且因為其形成容易接近的、無損傷免疫接種途徑，因此口服免疫長期被認為是針對通過胃腸道、呼吸道和泌尿生殖道襯層的黏膜表面侵襲身體感染性介質保護宿主的有吸引力的手段。如在許多動物研究中證實的那樣，口服免疫的潛力還沒有在人類中實現，僅口服脊髓灰質炎、口服破傷風和口服霍亂疫苗被批准用於人類，它們均是活減毒疫苗。阻止口服免疫在人類中應用的限制包括需要大的抗原劑量，正常消化過程對抗原的破壞及需要強黏膜佐劑以克服口服耐受的誘導，所述口服耐受經常由攝入的蛋白質亞單位抗原而誘導(ffeiner HL. J Clin Invest 20000ct ； 106 (8) :935-7) 口服免疫是不用針的有成本效益的方法，其容易施用並且不伴有在人與人之間擴散諸如HIV、B型肝炎和C型肝炎等疾病的風險(Giudice，Ε. L. and J. D. Campbell, Adv Drug Deliv Rev. 2006. p. 68-89)。口服途徑也是免疫野生動物的重要方法。口服方案避免了與目前使用的侵襲性捕獲以及釋放的疾病控制方法相關的動物壓力(Cross，Μ. Let al. ,Vet J. 2006)。由於這些原因，口服途徑提供了免疫大的動物群和人群以使傳染性疾病的傳播最小化的潛力。在人類中廣泛應用的商業口服疫苗包括薩賓(Sabin)脊髓灰質炎疫苗、活減毒傷寒疫苗及滅活全細胞B亞單位和活減毒霍亂疫苗。這些結果表明口服施用的本發明疫苗在幽門螺桿菌情況中可以作用於胃(圖3和圖5)，而在衣原體情況中可以作用於生殖道和肺(圖1、圖2、圖4和圖6)。這些結果還顯明本發明疫苗輸送至黏膜表面能夠在各種其它黏膜表面觸發應答。這些發現因此證實本發明疫苗組合物提供了本領域長期存在問題的解決方案。本發明脂質組合物能進一步增加由傳統佐劑CpG和CT引起的黏膜免疫的發現表明本發明組合物可以協同作用以促進黏膜免疫。疫苗佐劑
為改善免疫應答，抗原已與許多佐劑物質混合以刺激免疫原性。常用佐劑包括明礬和水包油乳液。後一組典型代表為弗氏礦物油佐劑。但是，在人類和獸用疫苗中使用弗氏完全佐劑(FCA)是禁忌，因為已報導有毒性反應。為此，弗氏佐劑可能也不適用於口服施用。在水包油乳液中因為油含量高而需要表面活性劑。表面活性劑的去汙劑性質使它們不適用於腸胃外或者口服施用。另外，甚至經批准的表面活性劑的毒性反應也已有報導。 乳液的另外的缺點是它們是一種不混溶液體分散在另一種中的異質系統。這種製備物通常不穩定並且導致水相隨時間分離，因此維持疫苗呈穩定懸浮液有困難。另外，在油包水乳液的水相或者傳統脂質體中捕獲的抗原不太可能被保護而免於在胃中或消化系統其它部分中降解。相反，本發明的含有脂質的組合物及其使用方法可以在消化道中保護脆弱的蛋白質抗原，由此使得它們能到達淋巴集結及胃腸道中的其它免疫敏感性結構，由此提供對黏膜的免疫學保護。ADP-核糖基化外毒素為了促進用弱免疫原性蛋白質抗原口服免疫後的獲得性免疫，使用佐劑如 ADP-核糖基化外毒素(bARE)增強免疫活化及防止誘導口服耐受性。口服免疫的動物研究中最常用的佐劑ADP-核糖基化細菌外毒素(ABARES) (Williams ΝΑ, Hirst TR, Nashar TO. Immunol Today 1999Feb ；20 (2) :95-101)如霍亂毒素(CT)和大腸桿菌熱不穩定毒素 (LT)因為胃及神經學毒性而不能用於人類中(van Ginkel Fff et al.，J Immunol 2000 ； 165(9) =4778-82) 0為此人類的口服免疫潛力僅在可以發現安全佐劑以代替如ABARES的佐劑時才能實現。ABAREs如CT或LT是黏膜免疫的有力刺激物並且已實驗用於許多免疫途徑如口服、鼻內和經皮(Holmgren, J.，et al.，Vaccine, 1993. 11(12) :ρ· 1179-84 ； Hickey, D. K. ， et al. ， Vaccine, 2004. 22(31-32) :p. 4306-15 ；Skelding, K. Α. ， et al.， Vaccine, 2006. 24(3) :p. 355-66 ；Glenn, G.，et al.，J Immunol, 1998. 161(7) :ρ· 3211-4 ； Yu, J. , et al. , Infect Immun, 2002. 70(3) :ρ· 1056-68 ；Berry, L. J. , et al. , Infect Immun，2004. 72(2) :p. 1019-28).但是，它們在使用口服和鼻內途徑的獸醫和人類免疫方面的應用由於毒性而受限，毒性包括胃腸流體平衡的破壞及在中樞神經系統毒素的聚積 (vanGinkel, F.，et al.，J Immunol,2000. 165(9) :p.4778-82)。用於與本發明組合物相比的熟知的有力黏膜佐劑CT和CpG分別通過細胞toll 樣受體9(TLR9)和神經節苷脂受體(GM-I)激活免疫應答。GM-I和TLR的激活和信號傳導依賴於細胞膜脂膜筏(lipid rafts)群(association)，其允許蛋白質和信號傳導分子的共定位(Fujinaga, Y. , et al. , MolecularBiology of the Cell. 2003 ；Orlandi, P. A. and P. H. Fishman, J Cell Biol. 1998. p. 905-15 ；Wolf, Α. A. , et al. , J Biol Chem. 2002. p. 16249-56 ；Triantafilou, Μ. ， et al. ， J Cell Sci.2002. p. 2603-11 ；Triantafilou, Μ. , et al. , J Biol Chem. 2004. ρ. 40882-9 ；Dolganiuc, Α. , et al. , Alcohol Clin Exp Res. 2006. p. 76-85 ；Latz, Ε. , et al. , Nat Immunol. 2004. ρ. 190-8) (Fujinaga, Y. , et al. , Molecular Biology of the Cell. 2003 ；Orlandi, P.A. and P.H. Fishman, J Cell Biol. 1998. p. 905-15 ；Wolf,Α. A. , et al. ,J Biol Chem. 2002. p. 16249-56 ；Triantafilou, Μ.，et al.，J Cell Sci. 2002. p. 2603—11 ；Triantafilou, Μ.，et al.，J Biol Chem. 2004. p. 40882-9 ；Dolganiuc, Α. , et al. , Alcohol Clin Exp Res.2006. p. 76—85；Latz, Ε. , etal.，Nat Immunol. 2004. p. 190—8)。脂膜筏由鞘脂和含有高比例飽和脂肪酸的膽固醇組成，導致比周圍不飽和磷月旨更緻密堆積的區域(Simons, K. and W. L. Vaz, Annual review of biophysics and biomolecular structure. 2004. p. 269-95 ；Dykstra,Μ. ,et al. ,Annu Rev Immunol. 2003. p. 457-81)。游離脂肪酸插入到膜雙層內直接根據它們的結構組織成不同結構域，並且由於脂肪酸的高周轉率，脂肪酸的含量是動態的(Klausner，R.D.，et al. , J Biol Chem. 1980. p. 1286-%)。飽和脂肪酸的摻入通過促進形成脂膜筏而直接影響膜細胞信號傳導機制，並且反過來由高比例不飽和脂肪酸而抑制(Stulnig, T.M.，et al.，J Cell Biol,1998.143 (3) :ρ· 637-44 ；Stulnig, Τ. Μ.，et al.，J Biol Chem. 2001. p. 37335-40 ； Weather ill, A. R. , et al. , J Immunol, 2005. 174(9) :p. 5390—7)。脂質體為保護疫苗存活性，研究者已探索開發了各種遞送運載體包括惰性顆粒、脂質體、 活載體和病毒樣顆粒(VLP) (Bangham, A. D. and R. W. Home, J Mol Biol. 1964. p. 660-8 ； Niikura, Μ.，et al.，Virology. 2002. p. 273—80 ；Guerrero, R. Α.，et al.，J Virol. 2001. p. 9713-22)。脂質體和脂質小泡也已被探索用於疫苗，特別是用於可以容易包囊的小免疫原性成分。通常，脂質體和小泡不用於包囊大抗原如活微生物。另外，脂質體和小泡的生產昂貴且耗時，它們的製備中使用的提取程序可導致疫苗製備物的化學結構或者存活性的改變及因此的其免疫原性的改變。例如，加熱和溶劑可改變免疫原性成分如蛋白質的生物學完整性。脂質體通常是小的(在微米大小範圍)，及是球形層狀(lemellar)結構，其具有可以放置抗原或者其它材料的內側。脂質體通過將脂質與含有抗原或其它材料的水溶液混合而製成。在渦旋該混合物後，混合物中的脂質傾向於自發形成典型脂質體結構。在一些情況中，可以加入去汙劑以幫助脂質成分與水相成分的混合。通過透析除去去汙劑，脂質和水相傾向於分離，且脂質自發形成脂質體結構將水相包囊。脂質體然後通常保持在懸浮液中對脂質體接種的免疫學應答高度依賴於該脂質的物理化學性質，因此採用許多成熟及複雜的技術，包括反相蒸發、醚汽化、凍-融擠出和脫水-再水合(&oka，
F.and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p. 4194-8 ；Deamer, D. and A.D.Bangham, Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34 ；Chapman, CJ. , et al. , Chem Phys Lipids. 1991. p. 201—8 ；Sou, K.，et al.，Biotechnol Prog. 2003. p. 1547—52 ；Kirby, CJ. and
G.Gregoriadis, Journal of microencapsulation. 1984. p. 33-45)。PCT 國際專利申請號 PCT/KR00/00025(W000/41682 ；以下 「Kim」)揭示了一種「親脂微粒」(即脂質體)，其摻入蛋白質藥物或者抗原。所述微粒具有0. l-200im的大小。該親脂微粒可以通過用在水溶液中的親脂物質或者使用有機溶劑包被含有活性成分的固體顆粒而製備。所得組合物包括適於注射的水包油乳液。不幸地，Kim的微粒不適用於口服攝取。它們進一步也不太適於提供當抗原通過消化系統時的保護。因此，Kim的微粒不提供有效的黏膜口服免疫。另外，製備脂質體的方法需要成熟的製造技術，這限制了大規模生產的成本效率(Szoka, F. and D. Papahadjopoulos, Proc Natl Acad Sci USA. 1978. p. 4194-8 ；Deamer, D.and A. D. Bangham,Biochim Biophys Acta. 1976. p. 629-34 ；Chapman,C. J. ,et al. ,Chem Phys Lipids. 1991. p. 201-8 ；Sou, K.，et al.，Biotechnol Prog. 2003. p. 1547—52 ；Kirby, CJ. and G. Gregoriadis, Journal ofMicroencapsulation. 1984. p. 33-45)。脂質體在口服免疫中應用有限，部分是因為它們是脆弱的，以及因為水性內腔中的抗原可以隨時間降解。另外，典型用於製備脂質體的脂質是在室溫是液體的那些，因此， 它們通常在儲存條件下是液體形式。這些特徵限制了基於脂質體的疫苗的保存期限。免疫刺激複合物已知為ISC0MS 的免疫刺激複合物主要由具有限定的極性和非極性區域的磷脂和膽固醇分子組成。另外，ISC0MS .含有高免疫原性佐劑皂苷(Quil A) (Morein, B.，et al.，Nature. 1984. p. 457-60)。磷脂形成球形環，產生由周圍的疏水性力保持在一起的脂雙層，並且將水相內的各種抗原包囊。在兩個系統中，保持膜完整性均很關鍵，否則抗原被釋放進局部環境並經受降解。因此，保持最佳儲存條件對於疫苗存活性和輸送是重要的。 ISCOMS 需要比於脂質體較不複雜的製造技術，如透析、超濾和超離心(SjSlander, A.，et al.，Vaccine. 2001. p. 2661-5)。這些方法不必然產生抗原的自發摻入。另外，最近描述了另一種佐劑。ISC0MATRIX 是類似於ISC0MS 的脂質佐劑。但是， ISC0MATRIX 不物理摻入抗原而是作為佐劑共施用以通過皂苷的免疫原性性質來誘導免疫，因此其不用作在口服免疫期間保護疫苗抗原的輸送運載體(Skene，⑶.and P. Sutton, Methods. 2006. p. 53-9)。脂質體和ISC0MS 已實驗用於經各種途徑包括肌肉內、皮下、鼻內、口服及經皮輸送疫苗(Mishra, D.，et al.，Vaccine. 2006 ；Wang，D.，et al.，J Clin Virol. 2004. p. S99-106 ；Perrie, Y. , et al. , Journal of liposome Research. 2002. p. 185-97)。用於黏膜免疫的作為口服疫苗佐劑及載體的脂質組合物上述產生黏膜免疫的困難出人意料地由本發明的含有脂質的組合物所克服。代替現有技術所使用的典型短鏈脂質(例如油)或者磷脂，我們發現使用長鏈脂肪酸作為脂質基質以保持抗原在懸浮液中相對於現有技術組合物具有獨特優勢。首先，長鏈脂肪酸在胃腸道中更抗降解，因此提供保護性周圍環境，在其中抗原保持它們的天然構象，由此增加黏膜中的免疫應答。人類和其它動物消耗脂質作為它們日常飲食並且脂肪(三醯基甘油)的消化是正常代謝過程。脂質在胃中很少被胃酸降解，大約90%脂質消化發生在腸道中由膽汁鹽和脂酶進行(Erickson, R. H. and Y. S. Kim, Annu Rev Med. 1990. p. 133-9)。在口服免疫期間，飽和脂肪酸不像不飽和脂肪酸那樣容易摻入膽汁鹽微團，因此不容易被腸細胞吸收。過量的腔(luminal)飽和脂肪酸可以與疫苗成分非特異性轉移穿過特化的小結相關上皮「M」細胞。在上皮下穹隆(sub epithelial dome)內脂質基質的飽和脂肪酸部分摻入抗原呈遞細胞(APC)的膜雙層中，促進功能性GM-I受體和TLR複合物的上調。本發明的脂質配製的疫苗的增強的保護作用通過完整抗原的物理輸送及黏膜佐劑對 APC的激活均可以是兩倍。與許多用於藥物和疫苗的現有技術脂質組合物相反，本發明的脂質組合物由甘油三酯而非磷脂組成。甘油三酯不含有極性和非極性區域，因此不組織成同心球形雙層。相反，用於本發明疫苗中的脂質可以形成網狀基質，在其中疫苗成分被捕獲。這在暴露於變化的儲存因素如溼度和水分期間及在胃的強酸性不適環境中提供了對摻入脂質的抗原的物理保護。上述配製物中採用的脂質被希望適用於動物或者人類消耗並且可以選自廣泛的天然(源於植物或者動物的)或者合成脂質產品，包括油、脂肪和蠟。在開發新疫苗時，避免產生不利副作用是疫苗應用於人類中的試驗的主要決定因素。使用「安全的」亞單位抗原而不共施用毒性佐劑將是理想的。本發明的脂質配製物使用不與任何副作用相關的食品或者藥品級膳食脂肪酸製造。用這種脂質配製的MOMP 口服免疫誘導顯著的保護呼吸道和生殖器黏膜免於衣原體感染的作用。另外，將滅活的全細胞幽門螺桿菌摻入本發明的脂質配製物在用幽門螺桿菌SSl活細菌攻擊後在胃腸道引起保護作用(圖3和圖5)。用脂質C 和幽門螺桿菌抗原所觀測到的這種保護程度在回收的細菌中降低大約25%，其代表在動物中降低了的細菌負荷。免疫導致在用幽門螺桿菌SSl胃內接種後六周從胃組織回收的細菌顯著降低。滅活的全細胞生物體由眾多未鑑別的、也未分離其免疫原性的抗原組成。但是純化的MOMP是含有I類和II類T細胞表位的免疫顯性表面抗原(Caldwell, H. D.，et. al.， Infect Immun. 1981. p. 1161-76)。本發明的MOMP脂質配製物引發針對呼吸道和生殖器衣原體感染部分保護小鼠的免疫應答。本發明疫苗的生產是簡單的廉價機械過程，無專門的技能或設備需求。儘管脂質體和IC0MS 與其它非脂質輸送載體相比被突出為較廉價的選擇，本發明組合物的簡便性可以提供更廉價的選擇。在一些實施方案中，脂質配製物可以在高於約30 V的溫度是液體。即，可以選擇脂質以實現在最常見通過口服途徑施用的動物中處於生理學溫度的熔點。希望的是，脂質在大氣壓下於10°c -30°c是固體形式，優選在大氣壓下在20°C -30°c仍然是固體。但是脂質的熔解溫度不是排他的，並且可以包括具有各個範圍熔解溫度的油、脂肪和蠟。在一些實施方案中，用於本文的脂質在大約30°C和大約37°C的人類生理溫度之間可經歷從固相到液相的轉變。脂質相行為的總結可得自現有技術。因此，本領域技術人員可以基於現有技術的信息和簡單的實驗來選擇具有所希望的性質和熔點的脂質。通常，合適的脂質配製物可以包括甘油三酯如羧酸的甘油酯，由脂族鏈和-COOH 末端組成的化合物，飽和和不飽和脂肪酸及其混合物。在一些實施方案中，甘油三酯可以主要含有C8-C^1醯基基團，例如豆蔻酸、棕櫚酸、 硬脂酸、油酸、亞油酸、parinic acid、月桂酸、亞麻酸、花生四烯酸及二十碳五烯酸，及其混合物。在一些實施方案中，用於本發明的脂質配製物包括較長鏈的脂肪酸，例如C16-C18。 已發現在用於小鼠和負鼠(possum)的疫苗中的生物體如BCG的保護中長鏈脂肪酸更有效。 由此，優選用於本發明的脂質配製物含有約30 %至約100 %、或者約60 %至約100 %、者大約80%至約100%、及在其它實施方案中約90%至約100%的C16和/或C18脂肪酸。在其它實施方案中，C16脂肪酸可以代表約10 %至約40 %、或者約20 %至約35 %、 及在其它實施方案中約25%至約32%的總脂肪酸含量。C18脂肪酸可以代表約30%至約 90%、或者約50%至約80%、及在其它實施方案中約60%至約70%的總脂肪酸含量的C18。
其它實施方案具有含有少於約35% C14脂肪酸或者更短的脂質配製物，或者少於約25%、及在其它實施方案中少於約10%。在一些實施方案中脂質鏈長是C14鏈或者更短的少於約5%脂肪酸，約25%至約 35%的C16脂肪酸，及約60%至約70%的C18脂肪酸鏈。在一些實施方案中，用於本發明的脂質配製物可以含有量為約20 %至約60 %、 或者約30%至約55%、及在其它實施方案中約40%至約50%的飽和脂肪酸。單不飽和脂肪酸可以在約25%至約60%、或者約30%至約60%、及在其它實施方案中約40%至約55% 的範圍。多不飽和脂肪酸可以在約0.5%至約15%、或者約3%至約11%、及在其它實施方案中約5%至約9%的範圍。本發明的一些實施方案包括約40%至約50%飽和脂肪酸、約40%至約50%單不飽和脂肪酸及約5%至約9%多不飽和脂肪酸。在一些實施方案中，用於本發明的脂質配製物經HPLC分析測定具有約3%豆蔻酸、約棕櫚酸、約15%硬脂酸、約40%油酸和約6%亞油酸。在其它實施方案中，本發明的脂質配製物具有約豆蔻酸、約25%棕櫚酸、約 15%硬脂酸、約50%油酸和約6%亞油酸(脂質C)。在這些實施方案的一些中，組合物含有脂質C和Μ0ΜΡ。在其它實施方案中，組合物含有脂質C和幽門螺桿菌抗原。如本文所用，術語「脂質C」和「LipoVax」是等價的。本發明的其它實施方案包含脂質C的變異「脂質Ca」，具有2. 8%豆蔻酸、22. 7% 棕櫚酸、2.5%棕櫚油酸、1. 曼陀羅酸(daturic acid)、15. 9 %硬脂酸、38. 0 %油酸 (C18: ln-7)、1. 7 %油酸(C18 ln-9)和4. 0 %亞油酸，具有42. 4 %的總飽和脂肪組成， 42. 2%的單不飽和脂肪組成，及4.0%的多不飽和脂肪組成。在這些實施方案的一些中，組合物含有脂質Ca和Μ0ΜΡ。在其它實施方案中，組合物含有脂質Ca和幽門螺桿菌抗原。或者，本發明的脂質配製物包括氫化椰子油(「脂質K」)。一些含有脂質K的組合物包括7. 6%辛酸(C8:0)、6. 8%癸酸(C10:0)、45. 月桂酸(C12 0)、18. 3 %豆蔻酸 (C14:0)、9. 7%棕櫚酸(C16:0)、2. 7%硬脂酸(C18:0)、7. 7%油酸(C18:l)和 2. 3%亞油酸 (C18:2)並且具有約27. 1°C的熔點。在這些實施方案的一些中，組合物含有脂質K和Μ0ΜΡ。 在其它實施方案中，組合物含有脂質K和幽門螺桿菌抗原。含有脂質K其它變體的實施方案(脂質Ka)包含具有如下重量組成的脂肪酸， 6. 5% 的己酸(C6:0)、5. 4%癸酸(C10:0)、44. 5%月桂酸(C120)、17. 8%豆蔻酸(C14:0)、 9. 8%棕櫚酸(C16:0)、11. 5%硬脂酸(C18:0)、2. 2%油酸(C18:0)，及95. 5%的總飽和脂肪組成，和2. 2 %的單不飽和脂肪組成。在這些脂質Ka實施方案的一些中，組合物含有脂質Ka 和MOMP。在這些脂質Ka實施方案的其它一些中，組合物含有脂質Ka和幽門螺桿菌抗原。在其它替代方案中，本發明脂質配製物包括藥用級的氫化椰子油(脂質PK)。在一些含有脂質I3K的實施方案中，包含具有如下重量組成的脂肪酸，7.0%的己酸、5. 8%癸酸、 45. 0%月桂酸、18. 2%豆蔻酸、9. 9%棕櫚酸、2. 9%硬脂酸、7. 6%油酸及2. 3%亞油酸，及 88. 8%的總飽和脂肪組成、7. 6%的單不飽和脂肪組成、和2. 3%的多不飽和脂肪組成。在這些實施方案的一些中，組合物含有脂質I3K和Μ0ΜΡ。在其它實施方案中，組合物含有脂質Hi 和幽門螺桿菌抗原。在另外替代方案中，本發明脂質配製物包括「脂質SPK」，其具有如下重量組成，6. 7%的己酸、5. 6%癸酸、44. 3%月桂酸、17. 9%豆蔻酸、9. 6%棕櫚酸、3. 0%硬脂酸、8. 4% 油酸及2. 6%亞油酸，及87. 3%的總飽和脂肪組成、8. 4%的單不飽和脂肪組成、和2. 6%的多不飽和脂肪組成。在這些實施方案的一些中，組合物含有脂質SH(和Μ0ΜΡ。在其它實施方案中，組合物含有脂質SH(和幽門螺桿菌抗原。組合物可容易地由輕易可得的脂質成分製造。在一些實施方案中，本發明的脂質組合物由純化的和分級分離的甘油三酯組成，所述甘油三酯當加熱至37°C以上的熔融態時允許摻入各種抗原和免疫調節劑，但是一旦冷卻其形成固體穩定相(Aldwell，F. Ε.，et al. , Infect Immun, 2003. 71 (1) :p. 101-8)。本發明疫苗的製造是簡單的廉價機械過程，無專門技能或者設備的需求。儘管脂質體和IC0MS 與其它非脂質輸送載體相比被突出為較廉價的選擇，製造本發明疫苗的簡便性提供更廉價的選擇。本發明的脂質配製物可用於製備免疫原性組合物，用於保護組合物內抗原免於降解。所述脂質配製物特別用於維持活生物體特別是細菌的存活性。所述脂質配製物發揮作用以維持生物體在活的但休眠狀態。這對於配製用於口服施用的包含活生物體的疫苗是特別重要的。脂質也將抗原維持在均勻懸浮液中。即，本發明組合物中免疫原性成分可以均勻分布在整個固體或糊狀脂質基質中。脂質還保護抗原在口服施用時免於被胃腸分泌物破壞。當通過其它途徑施用如皮下施用時保護免受巨噬細胞攻擊也是可能的。這允許通過胃腸黏膜攝取抗原特別是活生物體，隨後在宿主中複製生物體。本發明組合物在儲存條件期間對降解更具抗性。例如，已知脂質體長時間儲存時聚集，在一些情況中，脂質體製備物可能需要正或負電荷必須加入脂質體中，以提供靜電排斥以有利於將脂質體維持在懸浮液中。免疫原性成分通常，疫苗包括一或多種可以產生針對其的免疫應答的物質。這種物質包括脂質、 蛋白質、碳水化合物或者其它生物體特異性成分。要求是簡單的，所述物質必須能被呈遞到免疫細胞並且該免疫細胞必須能產生免疫應答。在許多情況中，蛋白質是免疫原。在其它情況中，使用活生物體。經這個途徑皮下免疫人類後的有效保護通常對於生物體如 BCG 是高度可變的，其範圍為 0-80% (Colditz, G. Α.，etal.，Pediatrics. 1995. p. 29-35 ；Colditz, G. Α. ， et al. ， JAMA. 1994. p. 698-702 ；Fine, P. Ε. ， Lancet. 1995. p.1339-45)。最近發明人之一和同事使用了基於脂質的口服輸送系統，脂質C，用於在動物中口服輸送疫苗(Aldwell FE, et al. , Infect Immun 2003 ；71(1) 101-8 ；Aldwell, F., et al. , Vaccine,2003. 22(1) :ρ· 70-6 ;PCT International PatentApplication No :PCT/ NZ2002/00132)。給小鼠餵食摻入脂質C中的牛分支桿菌(Mycobacterium bovisss)卡介苗(Bacille Calmette-Geurin, BCG)疫苗產生了對感染的抗性(Aldwell, FE, et al.， Infect Immun 2003 ;71 (1) 101-8)。類似結果在白尾鹿(Nol P, et al. J Wildl Dis 2008Apr ；44(2) :247-59)、豚鼠(Clark S，et al. ,Infect Immun 2008 Jun 2)及刷尾負鼠 (brushtail possum) (Aldwell FE, et al. ,Vaccine 2003Dec 8 ；22(1) :70-6)中發現,其中用基於脂質C的疫苗針對用活牛分支桿菌的氣霧劑攻擊進行保護。保護水平觀測為高於在用非摻入BCG免疫的動物中見到的，並且等價於通過皮下途徑施用的BCG，並且伴有全身和黏膜T細胞的強幹擾素γ (IFNa)產生。因為脂質C-活減毒疫苗生物體BCG的摻入在口服輸送後大大增加其免疫原性，我們確定脂質C也可以增強針對經口服途徑輸送的衣原體或者幽門螺桿菌的限定的亞單位蛋白質抗原的免疫應答。但是，在病原生物體情況中，重要的是保證免疫動物不被病原體嚴重及不利地影響。與使用上述活生物體抗BCG成功免疫相反，使用非活性、非複製性BCG抗原不引起免疫原性有效的免疫應答(Μ· I. Cross，et al. , Immunology and Cell Biology，1-4， 13November 2007)。因此，現有技術中有另外問題，即使用非感染性抗原產生對病原生物體的有效免疫應答。許多疫苗依賴於使用生物體的凍幹製備物。例如，目前用於人類TB的疫苗基於稱為卡介苗(BCG)的活減毒細菌的凍幹製備物。但是，已經示出凍幹程序導致BCG存活性喪失 30% -50%及剩餘活細菌回收受損(Gheorghiu, M.，et al.，Dev. Biol. Stand. Basel, Karger. 87 :251-261)。在使用前保持生物體更大存活性的組合物會對這種疫苗的有效性有很大貢獻。在其它情況中，希望的是使用來自生物體的特異性蛋白。在衣原體情況中，主要外膜蛋白(major outer membrane protein, Μ0ΜΡ)被用作免疫原性化合物，因為這個蛋白質參與衣原體生物體的功能。衣原體抗原性成分衣原體外細胞壁含有幾種免疫原性蛋白，包括40千道爾頓(kDa)主要外膜蛋白 (MOM)，兩個富半胱氨酸蛋白質，60-62kDa外膜複合物B蛋白(OmcB)和12_15kDa外膜複合物A蛋白(OmcA)，74kDa物種特異性蛋白，及31kDa和ISkDa真核細胞結合蛋白質，它們有相同的一級序列。針對來自血清型L2的40kDa MOMP蛋白的超免疫小鼠抗血清在間接免疫螢光期間與沙眼衣原體血清型Ba、E、D、K、Ll、L2和L3的原體反應，但是不與血清型A、B、C、F、G、H、 I和J或者鸚鵡熱衣原體(C psittaci)反應。事實上，沙眼衣原體MOMP基因的克隆及測序揭示血清變型L2和B的胺基酸數目相同，而血清變型C的MOMP基因含有編碼3個額外胺基酸的密碼子。衣原體MOMP的多樣性反映在4個序列可變結構域，其中兩個是推定的類型特異性抗原決定簇的候選者。沙眼衣原體血清變型中MOMP差異的基礎是對於緊密相關血清變型的簇生(clustered)核苷酸取代及對於遠緣相關血清變型的插入和缺失。當MOMP 插入到外部原體包膜時，MOMP的暴露結構域作為血清分型和保護性抗原決定簇。C和B血清型的主要保守區中散布有短的可變結構域。已知血清變型D、E、F、G、H、I、J和K與人類疾病相關。針對血清變型E、F和G — 起的接種會保護大約75-80%個體。血清變型D、E、F、G、H、I、J、K和L與衣原體生殖器感染相關，血清變型A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K與眼部感染相關。肺炎衣原體也與阿爾茨海默病、冠心病和哮喘相關。識別富半胱氨酸膜蛋白上的表位的3種單克隆抗體與全部15個人類沙眼衣原體血清型相互作用，建立這個抗原的物種特異性。針對OmcA的單克隆抗體顯示生物變型特異性和物種特異性。OmcB和OmcA富半胱氨酸蛋白質在天然感染中是高度免疫原性的，但是抗體不中和沙眼衣原體原體的感染性。因此，開發疫苗的候選抗原是衣原體主要外膜蛋白(MOMP)。我們出人意料地發現用摻入脂質C或者與強黏膜佐劑CT和CpG寡脫氧核苷酸混合的衣原體MOMP來口服免疫的動物針對鼠型沙眼衣原體(Clamydia muridarum)的陰道內攻擊而被保護。令人^(訝地，我們發現脂質C、CpG/CT和MOMP組合在一起改善針對鼠型沙眼衣原體攻擊的免疫應答，比用脂質C加MOMP或者CpG/CT加MOMP觀測到的更大。除了 MOMP介導的免疫，衣原體感染可以通過用除MOMP之外的免疫原性成分免疫易感動物而降低。在沙眼衣原體和鸚鵡熱衣原體中已識別了幾種獨特的免疫原性成分，一些是群特異性，其它是物種特異性。已使用去汙劑從原體和網狀體中提取抗原。肺炎衣原體(TWAR生物體)是血清學獨特的並且與沙眼衣原體物種和所有鸚鵡熱衣原體株不同。可以理解來自鼠型沙眼衣原體的免疫原性成分也可以摻入組合物中用於在小鼠衣原體感染模型中測試。也可以理解有許多衣原體抗原組合可以混合在一起並且摻入本發明口服活性疫苗中。螺桿菌抗原成分為了提供廣譜接種物，可以使用紫外(UV)滅活的全細胞幽門螺桿菌雪梨株(幽門螺桿菌SSl)。使用全生物體避免了需要確定哪種螺桿菌抗原是免疫原性的。可以理解其它螺桿菌菌株可以使用而不偏離本發明範圍。本發明實施方案本發明脂質組合物的製造本發明的組合物可以用本領域已知技術製備。方便地，在需要時加熱脂質配製物以液化，並且加入免疫原性成分及上述其他成分(在使用時)。免疫原性組合物的分散可以通過混合、振蕩或者不負面影響免疫原性成分的存活性的其他技術來實現。在一些實施方案中，抗原均勻分散在整個脂質配製物中。用於本發明中的替代組合物可以基本上不含水性成分包括水。術語「基本上不含」 如本文所用是指組合物含有小於約10%的水性成分，優選小於約5%的水性成分。如上所述，成分特別是水性溶劑的存在降低脂質配製物特別是在腸道中的保護作用。本發明的免疫原性組合物也可以用於產生對上述免疫原性成分類型的第二種或進一步的免疫原性分子的應答，特別是那些弱免疫原性的。這可以通過將免疫原性分子與組合物的另一種免疫原性成分綴合來共輸送免疫原性組合物中的第二種或進一步的免疫原性分子而實現。綴合可以用標準現有技術實現。特別地，感興趣抗原可以與免疫原性載體或者佐劑通過不幹擾體內抗體產生的接頭基團綴合。所述免疫原性載體或佐劑可以是任何免疫原性成分包括上述生物體，但是優選是分支桿菌，更優選是BCG。合適的接頭基團包括甘露糖受體結合蛋白如卵清蛋白和結合Fc受體的那些。第二種或進一步的免疫原性分子優選是蛋白質或者肽。特別優選的蛋白質是免疫避孕蛋白(immimocontraceptive protein)。脂質再一次作為輸送基質。當施用組合物時，產生對綴合分子或共輸送分子的增強的免疫應答。術語「動物」如本文所用是指溫血動物，特別是哺乳動物。人、狗、貓、鳥類、牛、綿羊、鹿、山羊、大鼠、小鼠、兔、負鼠、獾、豚鼠、雪貂、豬和水牛是該術語含義範圍內的動物的例子。單胃動物和反芻動物特別包含在本術語中。術語「抗原」在本發明疫苗組合物上下文中等價於術語「免疫原」，是指在動物中能引起免疫應答的物質或者可以被抗體或者動物的免疫系統細胞特異性結合的物質，所述動物已針對所述物質而進行免疫。
用於各種輸送途徑的配製物除了脂質配製物和一或多種免疫原性成分之外還可以包括添加劑，如填充劑、增充劑、粘合劑、溼潤劑、乳化劑、緩衝劑、表面活性劑、懸浮劑、防腐劑、著色劑、鹽、抗氧化劑包括穀氨酸一鈉(MSG)、維生素如維生素E、丁羥茴醚 (butylated hydroxanisole,BHA)、白蛋白右旋糖-過氧化氫酶(ADC)、保護性包衣、引誘劑和除味劑(odourant)以及幫助生物體或者脂質中含有的其它抗原存活的製劑，但不限於此。保護性包衣或者腸包衣可以選自例如凝膠、石蠟和塑料包括明膠。當選擇口服施用途徑時包衣進一步幫助防止暴露於胃酸和酶。當用於口服施用時，配製物還可以包括添加劑，其例如改善適口性，如調味劑(包括茴香油、巧克力和薄荷)和甜味劑(包括葡萄糖、果糖或者任何其它糖或者人工甜味劑)。從以上可以理解免疫原性成分可以是蛋白質或者肽的複合物，或類似物。在一個實施方案中，組合物包括至少兩個選自上述任一的免疫原性成分，且可包括亞單位抗原的多個組合。三個或更多個免疫原性成分是可行的。組合物中免疫原性成分的濃度可根據已知技術方案變化，只要其以在施用於動物時有效刺激免疫應答的量存在。特別地，腸道中免疫應答與小腸淋巴組織相關。在分支桿菌情況中，IxlO5至IxIOici菌落形成單位(CFU)/ml的範圍是合適的。優選地，濃度為IxlO7至 lxl09CFU/mlo對於蛋白質和肽類型抗原，包括衣原體MOMP和幽門螺桿菌抗原，IO-IOOOFg/ g的配製物範圍是合適的。對於病毒類型抗原，IxlO3至1χ101(ι、優選IxlO5至IxlO8噬斑形成單位(PFU)/ml的範圍是合適的。免疫應答可以是體液的(例如經可溶性成分如抗體或者免疫調節物)或者細胞介導的包括黏膜免疫應答。例如，在一系列體內實驗中，我們研究了胃螺桿菌和衣原體生殖器、胃腸和呼吸道感染的BALB/c小鼠模型。這些系統公知與人類疾病相關，並被用於確定本發明組合物和方法誘導保護性黏膜免疫的有效性。滅活的或者亞單位疫苗提供了活減毒疫苗的安全替代品，具有更低的相關副反應。用滅活全細胞幽門螺桿菌或者純化的衣原體MOMP單獨口服免疫在活細菌攻擊後不保護黏膜表面。我們因此研究了脂質配製的組合物在用非活性全細胞抗原和限定的蛋白質抗原口服免疫後誘導黏膜免疫的潛力，口服免疫添加或者不添加強黏膜佐劑CT和CpG-ODN用於針對螺桿菌和衣原體黏膜感染進行保護。在本公開中，我們證實用配製在本發明脂質組合物中的疫苗口服免疫小鼠增強了在多個黏膜表面針對活細菌攻擊的保護作用。與CpG-ODN和霍亂毒素(CpG/CT)混合的脂質配製的滅活全細胞或者蛋白質抗原不僅在腸道局部引起保護作用，而且在解剖學上遠處的生殖器和呼吸道表面也引起保護作用。口服免疫的主要限制是確定和維持最佳抗原劑量用於免疫接種。口服施用的抗原以不能預測的和有些低的速率在小腸腔被吸收。導入到GALT的蛋白質抗原通常導致誘導耐受而非免疫(Challacombe, S. J. and Τ. B. Tomasi, J Exp Med. 1980. p. 1459—72)。為此， 口服疫苗需要大劑量抗原和/或佐劑以增強獲得性免疫。不幸地，高抗原劑量和毒性佐劑的存在增加了副作用的可能性。在本研究中，單獨施用的衣原體MOMP和滅活全細胞幽門螺桿菌均不能保護黏膜表面免受細菌感染，結果與未免疫對照相當。期望強黏膜佐劑的共施用以使用口服途徑誘導保護性免疫性。
因為CT對於人類是毒性的，因此其是本發明人類免疫原性組合物不希望的成分。 但是因為CT對於一些其他動物不是毒性的，因此CT可以包括在免疫原性組合物中以在其他動物中誘導免疫性。因為CpG是寡核苷酸，其毒性低於CT，CpG可以摻入本發明免疫原性組合物中用於人用。因此，為在人類中誘導免疫性，本發明組合物可以包括衣原體抗原、脂質配製物和CpG 寡核苷酸。在其它實施方案中，本發明組合物可以包括來自衣原體或者幽門螺桿菌的抗原、 包含脂質C、脂質Ca、脂質K、脂質Ka、脂質1 或者脂質SH(的脂質配製物及CpG寡核苷酸。效用本發明組合物和方法可用於提供針對感染黏膜的生物體的免疫性。因為本發明的含脂質組合物提供黏膜免疫，它們可適於多種用途。本發明的免疫原性組合物包括維持抗原在穩定基質中的脂質配製物，它們可以均勻分散在其中。這促進了恆定劑量抗原的施用， 避免劑量傾棄(dumping)和無效低劑量。脂質配製物還保護抗原免於被胃酸和消化酶降解。在基於脂質的配製物中的免疫原性成分存活性的喪失也顯著低於凍乾產物所報導的。 由於配製物的疏水性質也可以實現在潮溼或者水分條件下儲存而不破壞。疫苗製備物中的免疫原的穩定性對於誘導強的持久保護性免疫是重要的。這可以用本發明的組合物來實現。所述組合物還易於製備，生產更廉價，並且發現了提高的消費者接受性及安全性，其中可以避免使用針和注射器。本公開提供了誘導針對衣原體和螺桿菌感染的黏膜免疫的直接證據。我們出人意料地發現，在BALB/c小鼠針對鼠型沙眼衣原體生殖器攻擊的保護中，用摻入脂質C的MOMP 口服免疫小鼠與用與強黏膜佐劑CT和CpG混合的MOMP的免疫一樣有效。這是令人驚奇的， 鑑於與用CT/CpG加MOMP免疫的那些相比用脂質C免疫的小鼠中觀測的較低水平IFNa產生和生殖道抗體水平。重要的是，MOMP和CT/CpG的脂質C摻入導致甚至更高水平的保護作用，提示當佐劑與脂質C組合時的協同作用。我們還出人意料地發現用摻入紫外(UV)滅活的全細胞幽門螺桿菌雪梨株1 (幽門螺桿菌SSl)的本發明脂質組合物口服免疫有效誘導針對活生物體感染的黏膜免疫。另外， 與霍亂毒素(CT)和細菌CpG寡核苷酸(CpG-ODN或者CpG)混合的上述組合物也誘導在胃腸、呼吸道和生殖器黏膜的保護性免疫性。本發明脂質/抗原組合物提供的保護程度與用抗原加CpG/CT作為抗原觀測到的那些相當。因此，本發明的脂質組合物提供黏膜免疫而無CT和CpG的有害副作用。黏膜保護作用與強脾IFNY細胞因子表達及血清和黏膜分泌物中的抗原特異性抗體相關。在血清和BAL液中主要檢測到IgG，而IgA產生在生殖器灌洗液和糞便洗滌液中明顯。在本研究中，在用本發明脂質組合物配製的MOMP 口服免疫後也觀測到無需添加額外佐劑CT和CpG的保護作用。這導致在活細菌攻擊後在呼吸道和生殖道的衣原體負荷降低 50%。用本發明組合物口服免疫在多個黏膜表面有效引起保護性免疫性。儘管口服免疫通常已用於誘導針對胃病原體及程度較低的呼吸道病原體的保護作用，許多研究已證實口服免疫可以靶向婦女生殖道。Challacombe et al. Vaccine 1997 Feb ； 15 (2) :169-75顯示用在聚D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微粒中的卵清蛋白口服免疫引發在陰道灌洗液中顯著OVA特異性抗體。用活流感病毒口服免疫在膀胱、子宮、陰道和在子宮洗滌液勻漿中引發病毒特異性IgA(Briese V，et al. ,Arch Gynecol 1987 ；240 (3)153-7)。用表達精子受體ZP3的重組沙門氏菌(Salmonella) 口服免疫小鼠在陰道分泌物中引起ZP-3特異性 IgA 以及不育(Zhang X et al.，(published erratum appears in Biol Reprod 1997Apr ；56 (4) 1069). Biology of Reproduction 1997 ；56(1) :33_41)。用含有針對衣原體糖脂外抗原的抗獨特型抗體的PLG微粒口服免疫小鼠也針對沙眼衣原體人類株的生殖器攻擊部分地保護小鼠(Whittum-Hudson JA, et al.，Nature Medicine 1996 ；2 (10) :1116-21)。所有上述研究需要使用活(流感病毒)或者減毒(沙門氏菌)生物體或者將抗原摻入PLG微粒以引發生殖道中的免疫。PLG微粒的產生是昂貴的，並且使用的溶劑提取方法可以破壞一些蛋白質抗原的免疫原性。另外，使用活衣原體疫苗不太可能被批准，這是因為在活疫苗和滅活疫苗防止沙眼試驗後見到的增強的炎性應答所致(Grayston JT,Wang SP.SexuallyTransmitted Diseases 1978 ；5 (2) :73_7)。因為脂質C僅由作為正常飲食部分常規消費的食品級脂質組成並且可以通過簡單混合成分而容易地製備，它們可以提供優於其它顆粒輸送系統如脂質體和PLG微粒的在製備容易性和成本方面的明顯優勢。另外，因為脂質C在33°C以下形成固體，其可以保護成分抗原免於儲存期間降解，由此延長疫苗的有效儲存壽命。BCG摻入脂質C的確增強其在 4°C 和室溫長期儲存期間的存活性(Aldwell FE, et al. ,Vaccine 2006 Mar 15 ；24(12) 2071-8)。本發明脂質配製物的作用機制不完全了解。不受任何特定作用機制限制，但是， 脂質C的佐劑或者載體作用可能是由於各種因素所致。首先，因為脂肪在小腸中通過胰酶降解而在胃中不降解(Armand M. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 2007 Mar ； 10 (2) 156-64)，本發明組合物可以保護抗原免受胃消化過程和酸性pH的破壞並且輸送抗原至誘導部位如小腸中的淋巴集結或者小腸樹突細胞(Rescigno M, et al. Nat Immunol 2001 ； 2(4) :361-7)。脂質還可以通過它們對脂膜筏和膜流動性的影響而直接影響這些誘導部位中的免疫細胞的功能。脂膜筏對於免疫細胞之間的信號傳導是關鍵的，因為信號傳導分子如MHC 分子、T細胞和B細胞受體需要在脂膜筏中聚集以進行有效細胞-細胞信號傳導(Horejsi V. Immunol Rev 2003Feb；191 :148-64 ；Dykstra M, et al.，Annu Rev Immunol 2003 ；21 457-81 ；Anderson HA,et al. , Nat Immunol 2000Aug ； 1 (2) :156-62)。脂膜筏正常含有比周圍細胞膜區域更高量的飽和脂肪酸，可能脂膜筏功能可由脂質C中的飽和脂肪酸增強。相反，增加比例的不飽和脂肪酸可以增加膜流動性，其可以增強胞吞，由此潛在增加APC對抗原的攝取(Mahoney EM, et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 1977Nov ；74(11) :4895-9 ；Weatheri11 AR, et al.，J Immunol 2005May 1 ；174(9) 5390-7 ；Schweitzer SC, etal. J Lipid Res 2006Nov ；47 (11) :2525-37)。也已報導各種脂質具有抗炎作用及抑制淋巴細胞刺激(Calder PC, et al., Biochem Soc Trans 1989 Dec ； 17 (6) :1042-3 ；Calder PC,et al. ,Biochem SocTrans 1990 Oct ；18(5) :904-5)。其可以用於確定哪些基質對於脂質C的佐劑作用是重要的。從食品級脂質配製的佐劑的低毒性可以提供黏膜免疫的另一種顯著優勢。黏膜應答通常壽命較短， 這是由於漿細胞的短半衰期所導致以及由於婦女生殖道中作為正常生殖周期一部分的組織重塑所致。由此，可能需要頻繁加強以維持保護性免疫水平。在使用脂質C的這些及其它研究中，我們觀測到脂質C多劑量口服沒有副作用，提示頻繁使用是耐受良好的。載體動物免疫接種降低動物中的疾病的一個方式是降低動物對病原體的暴露。在一些病原體情況中，載體動物可以提供病原體的「庫」，即使所述動物不顯示疾病跡象或者症狀。因此，野生動物如負鼠、獾、牛、齧齒動物、鹿等的免疫可以有效降低由病原體引起的疾病的發生。為了接種載體動物，希望的是經黏膜途徑輸送疫苗。因此口服疫苗代表實用的和成本有效的輸送選擇。因此，在一些實施方案中，本發明的脂質組合物可以包括引誘劑、調味劑和除味劑， 它們可以基於待免疫載體動物而選擇。人類的口服免疫也是更成本有效的接種方法並且可以發現用戶愛好。另外，當以其它方式如皮下施用時，本發明的脂質配製物可以提供保護免於例如巨噬細胞或者其它清除細胞的攻擊。使用皮下施用或者注射施用，脂質庫(depot)的配製允許緩釋以模擬感染過程，並且促進免疫應答的引發。所述組合物可以有效誘導針對廣泛感染性生物體包括生殖器、眼部、胃腸和呼吸道病原體的免疫應答。例如，脂質C可以有效引發生殖道和胃腸道中的免疫應答，脂質1 可以有效引發上消化道和下消化道及呼吸道中的免疫應答。本發明組合物還可以用作疫苗輸送系統用於廣泛抗原，或者用於共輸送或者綴合輸送免疫原性分子，特別是由於劑量或者免疫原性原因而具弱免疫原性的那些分子。本發明組合物還可用作疫苗佐劑，並且可以與常規佐劑(例如弗氏完全佐劑或者弗氏不完全佐劑)一起輸送。
實施例下述實施例用於示出本發明具體實施方案.可以理解本領域技術人員可以容易地適應本公開及教導而無需過度實驗以產生其它實施方案。所有這些實施方案均被認為是本發明一部分。實施例1 製備重組衣原體MOMP小鼠中的衣原體及其感染性質與在人類疾病中發現的那些非常類似，因此，這種感染研究、它們的性質及它們的治療對於人類治療是高度預測性的。為進行衣原體感染研究，通過來自 Berry et al. (Berry, LJ.，et al.，Infect Immun,2004. 72(2) :ρ· 1019—28) 的經適應的方法純化主要外膜蛋白(MOMP)。簡而言之，表達編碼重組麥芽糖結合蛋白 (MBP)-MOMP融合蛋白的pMAL-c2載體的經轉化大腸桿菌(DH5 α {pMMM3})(來自Harlam Caldwell-Rocky Mountain Labs, Hamilton, Mont. (Su, H. ,et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. 93(20) :p. 11143-8)的惠贈)在氨苄青黴素營養瓊脂上生長後分離，通過超聲處理收穫(根據Berry et al)。鼠型沙眼衣原體的主要外膜蛋白(MOMP)通過Berry et al的方法從表達編碼重組麥芽糖結合蛋白(MBP)-MOMP融合蛋白的pMAL-c2載體的經轉化大腸桿菌 (DH5a {pMMM3})(來自 Harlam Caldwell-Rocky Mountain Labs，Hamilton，MT 惠贈)中純化。鼠型沙眼衣原體是導致小鼠生殖道感染的介質。用根據廠商指導製備的透析管從8M尿素到PBS (pH7. 2)純化並重摺疊MOMP (Sigma-Aldrich, Castle Hill，Australia)。用 Pierce BSA 蛋白質評估試劑盒評估蛋白質濃度，儲存在-20°C備用。實施例2 用於針對幽門螺桿菌免疫的抗原的製備為進行幽門螺桿菌感染研究，用生長在彎曲桿菌(Campylobacter)選擇性瓊脂 (CSA)上的幽門螺桿菌雪梨株 1 (Dr Hazel Mitchell, University of New South Wales 惠贈(Lee, A.，et al.，Gastroenterology, 1997. 112(4) :ρ· 1386-97))產生全滅活抗原 (whole killed antigen)，所述瓊脂由 5% (ν/ν)無菌馬血與血瓊脂基 No. 2 (Oxoid Ltd., Basingstoke, England)及 Sutton et al. (Sutton, P. , et al. , Vaccine,2000. 18(24) p. 2677-85)公開的Skirrow' s補充物組成。平板收穫至無菌PBS中，用Mci^arland標準建立濃度(菌落形成單位/ml)。活細菌通過暴露於紫外(UV)照射以及培養建立的細菌存活性缺乏而進行失活。滅活的全細胞幽門螺桿菌儲存在_20°C備用。實施例3 免疫組合物I的製備脂質C 配製物由 Immune Solutions Ltd(Dunedin, New Zealand)供應，其由含有豆蔻酸、25%棕櫚酸、15%硬脂酸、50%油酸和6%亞油酸的分級分離及純化的甘油三
酯組成。為進行衣原體感染研究，使用200 μ g MOMP作為抗原，IO7Cfu滅活全細胞幽門螺桿菌被用作螺桿菌免疫。免疫組包括(1)未免疫對照動物，( 用混合有IOyg CpG-ODN 1826(5' -TCC ATGACG TTC CTG ACG TT-3' ；SEQ ID NO 1) (Geneworks)禾口 10 μ g 霍亂毒素(Sapphire Biosciences) (CpG/CT)的抗原處理的動物，(3)脂質C和抗原單獨，及(4)脂質C加混合有CpG/CT的抗原。脂質C、MOMP, CT和CpG用3路活塞(3_way stopcock)和2個注射器混合，從而 150 μ 1脂質C含有200 μ g MOMP單獨或者其與CT (IOyg)和CpG(IOyg) —起。先前已發現與用免疫原但是不加CT或CpG處理的動物相比，這些劑量的CT和CpG提供最佳佐劑作用，因此，代表足以使免疫應答最大化的劑量。對於非脂質配製的疫苗，在PBS中製備MOMP 單獨或者與MOMP與CT和CpG組合。所有配製疫苗均在第一次免疫前製備並儲存在4°C備用。未配製疫苗需要在每次免疫當天製備。實施例4:免疫小鼠無特異病原體(SPF)的雌性BALB/c 小鼠得自 Animal Resource Centre (ARC) (Perth,WA)。動物在標準日-夜周期下籠養並無限制地提供無菌食物和水。The University of Newcastle 『 s Animal Care and Ethics Committee 批准所有禾呈序。每周間隔在異熒烷(isofluorane)麻醉下通過用球端針經口服強飼法用150il免疫溶液免疫小鼠3次，3周後加強。對照動物相同處理但是不免疫。用衣原體或螺桿菌感染的小鼠代表現有技術已知的系統，其能合理預測在人類中觀察的作用。因此，用本發明組合物在這些小鼠系統中獲得的結果是在衣原體或螺桿菌影響的人類中觀察到的作用的代表。實施例5 樣品收集及MOMP特異性IgG和IgAELISA分析I根據上述實施例4免疫動物的最終免疫後一周，通過用50 μ 1無菌PBS衝洗陰道穹窿而收集陰道灌洗液(VL)。在施用致死劑量戊巴比妥鈉後通過心臟放血收集血液。經ELISA 確定血清和 VL 中的 MOMP 特異性 IgG 和 IgA。Greinerimmunopure ELISA 平板(Interpath Ltd,Australia)用在硼酸鹽緩衝溶液(pH9. 6)中稀釋的鼠型沙眼衣原體MBP-MOMP包被O μ g/孔)，在4 °C保溫過夜。平板用在PBS中的0. 05 % Tween 20 (PBST) 洗滌3次，在37°C用100 μ 1含有5%胎牛血清的PBST在37°C封閉1小時。平板在PBST中洗滌3次，一式二份加入100 μ 1樣品並在PBST中二倍系列稀釋。血清在PBST中稀釋至從 1/100到1/12，800，VL稀釋至從1/20到1/2，560。使用無菌PBS作為每個ELISA的陰性對照。覆蓋平板並在37°C保溫1小時，然後用PBST洗滌3次。用分別稀釋1/500和1/1000 的 HRP 綴合的抗 IgA 或者抗 IgG(Sourthern Biotechnology Associates,Birmingham, AL) 及隨後的四甲基benzidine (TMB)顯色系統檢測MOMP結合的抗體。終點效價(Ε. P. T)定義為PBS對照孔的平均值+2標準偏差。通過用「測試」組免疫樣品的Ε. P. T除以非免疫對照的Ε. P. T計算抗原特異性抗體比率。實施例6 =T細胞增殖及細胞因子產生I脾淋巴細胞如上述實施例1處理的動物所述製備，用CFSE標記，然後以切106細胞 /ml懸浮於完全RPMI (補加5% FCS,L-穀氨醯胺、5χ1(Γ5Μ2-巰基乙醇、HEPES緩衝液、青黴素-鏈黴素的RPMI 1640，均來自TraceBiosciences)。細胞(100 μ 1) 一式三份加入到96 孔平板中(未染色細胞用作陰性對照)。培養基(背景對照)、抗原MOMP (2 μ g/孔)或者 ConAQ μ g/孔)(陽性對照)加入到合適孔中。平板在37°C於5%C02中保溫96小時，然後離心收集細胞。細胞用PECy7預綴合的CD3抗體(Becton Dickinson)染色，用FACSCanto 流式細胞儀(Becton Dickinson, Sydney, Australia)分析增殖的T細胞。與抗原的體外培養誘導的增殖T細胞百分比(> 3次細胞分裂)用Weasel軟體(Walter and Elisa Hall Institute, Melbourne, Australia)石角定。實施例7 =MOMP特異性T細胞應答IT細胞增殖使用CFSE經染料稀釋測定而測定，並表示為已經歷> 3個細胞分裂的 CD3+細胞的百分比。體外再刺激來自用ΜΟΜΡ+CT/CpG免疫的小鼠的細胞導致10. 2% (範圍7-13%)細胞經歷>3輪分裂，而9. 7% (範圍8-11%)來自用在脂質C中的MOMP免疫的動物的CD3+脾細胞增殖。用MOMP及CT/CpG組合在脂質C中免疫導致體外刺激後9. 9% (範圍8-11% )CD3T細胞增殖(表1)。表 權利要求
1.一種免疫原性組合物，包含含有至少30% C16至C18脂肪酸的脂質配製物，所述配製物具有高於約30°C的固體至流體轉變溫度；及來自衣原體(Chlamydia)或者螺桿菌(Helicobacter)的抗原性成分，所述組合物在經口服或者胃腸途徑接受所述組合物的動物中能引起黏膜免疫應答。
2.權利要求1的組合物，其中所述脂質配製物包含約豆蔻酸、約25%棕櫚酸、約 15%硬脂酸、約50%油酸和約6%亞油酸(脂質C)。
3.權利要求1的組合物，所述脂質配製物包含脂質C、脂質Ca、脂質K、脂質Ka、脂質1 或者脂質SPK。
4.權利要求1-3任一項的組合物，其中來自所述衣原體生物體的所述抗原性成分是主要外膜蛋白(MOMP)、60kDa-62kDa富半胱氨酸蛋白質膜蛋白、15kDa富半胱氨酸膜蛋白、 74kDa物種特異性蛋白質、31kDa真核細胞結合蛋白或者ISkDa真核細胞結合蛋白中的一或多種。
5.權利要求4的組合物，其中所述MOMP是選自由A、B、Ba、C、D、E、F、G、Hi、I、J、K、Ll、 L2或L3所組成的組的血清型。
6.權利要求4的組合物，其中所述螺桿菌的抗原性成分是來自幽門螺桿菌OLpylori) 的全滅活抗原。
7.權利要求1-6的組合物，進一步包含額外的佐劑。
8.權利要求7的組合物，其中所述額外的佐劑是霍亂毒素(CT)和CpG寡脫氧核苷酸 (「CpG-ODN" =SEQ ID NO 1)中的一或多種。
9.一種包含MOMP和脂質C的口服免疫原性組合物。
10.一種治療由衣原體科生物體引起的黏膜感染的方法，包括將權利要求1-5或者7-9 任一項的組合物施用給需要其的動物。
11.權利要求10的方法，其中所述的治療通過在所述動物中誘導黏膜免疫應答而發生。
12.權利要求10的方法，其中所述動物是人類。
13.權利要求10的方法，其中所述組合物包含Μ0ΜΡ、脂質C以及CT和CpG-ODN中的一或多種。
14.一種給動物提供針對衣原體或螺桿菌引起的感染的免疫學保護的方法，包括將權利要求1-9任一項的組合物施用給所述動物，其中所述動物具有指示免疫應答的發現。
15.權利要求14的方法，其中所述發現選自由以下組成的組胸腺細胞(T細胞)增殖、 幹擾素Y (IFNa), γ免疫球蛋白(IgG)、白介素12 (IL-12)和白介素IO(IL-IO)的產生或者所述衣原體或所述螺桿菌的釋放的降低。
16.含有至少30% C16至C18脂肪酸和至少一種來自衣原體的抗原的脂質配製物在製備用於預防、降低或者治療由所述衣原體引起的黏膜感染的口服藥物中的用途。
17.權利要求16的用途，其中所述至少一種抗原選自由如下組成的組主要外膜蛋白 (MOMP)、60kDa-62kDa富半胱氨酸蛋白質膜蛋白、15kDa富半胱氨酸膜蛋白、74kDa物種特異性蛋白、31kDa真核細胞結合蛋白或者ISkDa真核細胞結合蛋白。
18.權利要求16的用途，其中所述MOMP是選自由A、B、Ba、C、D、E、F、G、Hi、I、J、K、Ll、L2或L3所組成的組的血清型。
19.權利要求17的用途，其中所述血清型選自由034、6、!1、1、、1(和1^所組成的組， 並且所述用途是預防、降低或者治療由衣原體引起的生殖器感染。
20.權利要求17的用途，其中所述脂質選自由脂質C、脂質K、脂質1 和脂質SH(組成的組。
21.含有至少30% C16至C18脂肪酸和至少一種來自螺桿菌的抗原的脂質配製物在製備用於預防、降低或者治療由所述螺桿菌引起的黏膜感染的口服藥物中的用途。
22.權利要求21的用途，其中所述至少一種抗原是滅活的全細胞幽門螺桿菌 (Helicobacter pylori)。
23.—種試劑盒，含有權利要求1-9任一項的組合物；及使用說明。
全文摘要
本發明的實施方案包括基於脂質的免疫原性組合物(佐劑或者載體)，其用於口服或者胃腸施用以改善經接種動物對各種細菌感染的黏膜免疫應答。在一些實施方案中，本發明的脂質組合物包括具有不同鏈長的脂肪酸的混合物，由此提供希望的物理-化學性質。當細菌抗原與基於脂質的佐劑或者載體混合時，所得組合物引發改善的黏膜免疫應答並由此降低由衣原體或者螺桿菌引起的感染和疾病後遺症。
文檔編號A61K39/118GK102176907SQ200980140172
公開日2011年9月7日 申請日期2009年10月7日 優先權日2008年10月8日
發明者F·E·阿爾德維爾, K·W·比格利 申請人:免疫解決方案有限公司