一種缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法
2023-06-09 16:48:56 1
專利名稱：一種缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法
技術領域：
本發明涉及用於醫學鑑定的人蛋白基因的PCR檢測方法。
人α珠蛋白基因簇位於人第16號染色體短臂末端上(16p13.3)，由3個珠蛋白功能基因、2個假珠蛋白基因和1個尚未闡明功能的基因組成，他們在染色體上的排列順序為5＇-ζ2-ψζ1-ψα2-ψα1-α2-α1-θ-3＇，其中α2和α1是2個最重要的珠蛋白功能基因，丟失這2個基因(或其中之一)在內的α類珠蛋白基因簇基因區的大段缺失是一種常見的先天性遺傳缺陷現象，在人基因組DNA中檢測出這一現象具有理論和實用價值。本技術所針對的類型是從ψα2近5＇端到θ 3＇端下遊約4kb的一種缺失範圍約20kb的中國人中常見的基因缺失( —SEA/缺失基因)。檢測這種基因缺失最早期的技術是溶液分子雜交法(molecularhybridization in solution)(Kan YW,1976)，這一方法通過測定cDNA探針形成雜交分子後的退火百分率來完成檢測，該法的缺點是準確性差且一次分析需準備大量DNA。1978年美國人Orkin SH首次採用由Southern於1975年發明的Southern blotting印跡雜交法進行缺失型α珠蛋白基因的檢測(OrkinSH,1978)，該法可根據電泳帶型圖普分析確定是否有基因缺失，結果準確可靠，但其因操作複雜、耗時，且需同位素而難以被作為實驗室的常規方法。1985年正式面世的PCR(polymerase chain reaction，多聚酶鏈式反應)技術為檢測基因缺失提供了一個有用的工具，檢測α珠蛋白基因缺失的PCR技術首先報告於1987年(Chehab FF,1987)。由於其引物所擴增的區域位於基因缺失區內，故它是一種憑陰性擴增結果診斷2條染色體人α-珠蛋白基因都缺失的一種方法。本法最大的缺陷是只能診斷遺傳學上的缺失純合子而不能區分正常和雜合子樣品，又因PCR過於敏感，產生假陽性結果的風險甚大。在此基礎上改進的採用跨越斷裂點的PCR技術(也稱裂口PCR,gap-PCR)進行人缺失型α珠蛋白基因的方法診斷是近幾年方法學上的一個重要進展。gap-PCR採用三引物構成兩對獨立的跨越2個斷裂點的PCR反應的新型設計，其擴增產物分別代表正常和—SEA/缺失基因，能明確區分正常、—SEA/缺失基因雜合子和—SEA/缺失基因純合子三種基因型。該法最先由臺灣人Chang JG報導(Chang JG,1991年)，隨後又有多名研究者發表了同一設計思想的而採用不同引物的方法學學術論文(KoTM,1992；Bowden DK,1992；Chen TP,1993；Liu TC,1994；Fucharoen G,1994；Kuo PL,1994；Winichagoon P,1995；Kitsirisakul B,1996；Chan AY,1996；SimkinsRA,1998.)。我們也於1992年於國內最先報告了有自主引物設計的檢測人α珠蛋白基因缺失的gap-PCR技術(徐湘民等，1992)。根據在方學法研究中選用各種引物進行的的大量實驗觀測，我們發現由於現有方法均採用三引物設計方案及傳統的引物序列構成，使在同一反應體系中進行2個PCR反應時，引物的濃度難以把握，從而導致檢測結果重複性差同時也由於該設計方案在選擇引物位點上的局限性，其檢測結果只能提供是否存在—SEA/基因這一單一信息量。
本發明的目的是針對目前對人缺失型α珠蛋白基因檢測技術所存在的問題而提出一種能簡化操作、提高檢測的重複性和可靠性、一次檢測能提供多種有價值的特定α珠蛋白基因缺失信息的缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測新方法。
本發明的技術方案包括對人基因組DNA待測樣品的PCR擴增和對經PCR擴增後的產物進行電泳分析，其特徵在於採用4個(2對)引物P1、P2、P7、P4組成2對PCR反應，分別針對正常等位基因和缺失等位基因(—SEA/基因)，該PCR體系的引物設計方案包括(1)引物P1和P2組成一對擴增—SEA/基因的引物，這2個引物採用上述跨越斷裂點的gap-PCR引物設計方案，即這2個引物分別位於該缺失基因5』斷裂點的上遊和3』斷裂點的下遊；引物P7、P4組成一對擴增正常等位基因的引物，這2個引物的結合點均位於缺失區內，且引物所在區域是—SEA/、-α3.7/和-α4.2/這三種基因的共同缺失點。通過這一新的設計，當被檢人基因組DNA中出現涉及—SEA/、-α3.7/和-α4.2/這三種基因的一些特定組合情況時，該對用作參照的擴增引物的檢測結果將提供新的信息。此外，這一方案因消除了採用3個引物的現有技術中2個特異性引物在反應時競爭同1個共同引物的狀況，有利於確定2對在同一體系下反應的引物濃度和增強特異性。(2)在每條引物的特異性基因序列的5＇端連上一段由20個核苷酸組成的與人類基因不同源的序列，該20個核苷酸長度的寡核苷酸與特異性引物序列直接(不間隔)連接，其合成方式與普通引物相同，這樣，構成此2重PCR體系的4個這種加長的寡核苷酸引物的5』端均含有一個共同尾序列，從而使在PCR反應的退火環節4個引物有儘可能一致的結構基礎並使延伸步驟的起步條件齊同，從而實現在同一反應體系條件下2個不同長度和序列的特異性片段的同時擴增。
本發明所設計的4個優選引物的序列為P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3』；P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3』；P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCACTTCCTGTGTCACGGT-3』；P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3』。
本發明檢測方法的具體檢測過程依次包括如下步驟(1)PCR擴增(1.1)在滅菌eppendorf試管中，分別加入等體積等濃度的4個PCR引物P1,P2,P4和P7貯存液，引物的濃度範圍為0.1～1.0μmol/L；等濃度的4種脫氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP貯存液，每種dNTP的濃度範圍為100～300μmol/L；反應緩衝液，內含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/LKCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明膠0.15mg/ml，再加入人基因DNA待測樣品，混勻；(1.2)短暫離心後進行PCR循環；(2)電泳鑑定PCR產物，通過觀察電泳凝膠上出現的螢光譜帶(DNA擴增帶)的數目分析結果若出現P4+P7擴增產物的長度為正常基因片段；若出現P1+P2擴增產物的長度則為缺失型α珠蛋白基因片段。
根據本發明的新方案所建立的缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法，經實驗證實可在同一試管內同時實現2對特異性PCR引物的擴增，且有很好的重複性。該項技術可通過在電泳凝膠上出現的螢光普帶(DNA擴增帶)的數目和組合情況正確區分以下三種α珠蛋白基因的基因型—SEA/、—SEA/—SEA和αα/αα。其檢測效果有如下4種情形(1)若只有P4+P7擴增產物，排除缺失型α珠蛋白基因(—SEA/基因)。該樣品為正常的基因型(αα/αα)或含點突變的α珠蛋白基因的基因型(ααT/αα或ααT/ααT)。(2)若只有P1+P2擴增產物，樣品的基因型為—SEA/—SEA或α—/—SEA。(3)若同時有P4+P7擴增產物和P1+P2擴增產物，該樣品的基因型為—SEA/αα或ααT/—SEA。(4)若無陽性擴增帶出現，排除樣品質量的原因後，該樣品的基因型為-α/-α(包括-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2和-α3.7/-α4.2)。
實施例一檢測缺失型人α珠蛋白基因的具體操作流程依次包括如下步驟(1)PCR擴增(1.1)取0.5ml滅菌eppendorf試管一支，在50μl總反應體積中，分別加入等濃度(濃度為0.5μmol/L)的4個引物
P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3』、P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3』、P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACTTCCTGTGTCACGGT-3』、P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3』的混合貯存液5μl，等濃度(濃度為200μmol/L)的4種脫氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP的混合貯存液5μl，反應緩衝液，內含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明膠0.15mg/ml，再加入人基因DNA待測樣品0.5μg，混勻；(1.2)短暫離心後置PCR循環儀中循環95℃預變性5分鐘，繼續以95℃變性45秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30循環，最後72℃繼續延伸7分鐘，取出，4℃存放待檢測；(2)電泳鑑定PCR產物取步驟(1.2)中最後產物10μl，加1％的瓊脂糖凝膠，其中含有0.5μg/ml EB染料；電泳100V電壓×30分鐘；在紫外透射儀上觀察結果擴增產物的長度，正常基因片段(P4+P7)為1052db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)為740db。
實施例二本實施例的檢測操作流程基本與實施例一相同，區別在於在步驟(1)PCR擴增採用的引物為P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTGTGTTCTCAGTATTGG-3』、P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTTATATGGGTCTGGAAGTG-3』、P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTACTTCCTGTGTCACGGT-3』、P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTTCCGACCAGCTTAGCAAT-3』；在步驟(2)電泳鑑定PCR產物時，於紫外透射儀上觀察結果為擴增產物的長度，正常基因片段(P4+P7)為1050db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)為736db。
實施例三本實施例的檢測操作流程基本與實施例一相同，區別在於在步驟(1)PCR擴增採用的引物為P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCCAAGTTCCTATCGGTCGTA-3』、
P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTACTCCTGACCTCGTGATCCA-3』、P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCAGAGCACCTTGCGGCCTTA-3』、P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAATG-3』；在步驟(2)電泳鑑定PCR產物時，於紫外透射儀上觀察結果為擴增產物的長度，正常基因片段(P4+P7)為945db；缺失型α珠蛋白基因片段(P1+P2)為538db。
權利要求
1．一種缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法，包括對人基因DNA待測樣品的PCR擴增和對經PCR擴增後的產物進行電泳分析，其特徵在於採用4個(2對)引物P1、P2、P7、P4組成2對PCR反應，該PCR體系的引物設計方案為(1)引物P1和P2組成一對擴增—SEA/基因的引物，這2個引物分別位於該缺失基因5』斷裂點的上遊和3』斷裂點的下遊；引物P7、P4組成一對擴增正常等位基因的引物，這2個引物的結合點均位於中國人常見的α地貧基因缺失區內，即引物所在區域是—SEA/、-α3.7/和-α4.2/這三種基因的共同缺失點；(2)在每條引物的特異性基因序列的5』端連上一段由20個核昔酸組成的與人類基因不同源的高GC含量的序列，該20個核苷酸長度的寡核苷酸與特異性引物序列直接(不間隔)連接，其合成方式與普通引物相同，這樣，構成此2重PCR體系的4個這種加長的寡核苷酸引物的5』端均含有一個共同尾序列。
2．根據權利要求1所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法，其特徵在於所採用的4個優選引物的序列為P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3』；P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3』；P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCACTTCCTGTGTCACGGT-3』；P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3』。
3．根據權利要求1或2所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測過程依次包括如下步驟(1)PCR擴增(1.1)在滅菌eppendorf試管中，分別加入；等體積等濃度的4個PGR引物P1,P2,P4和P7貯存液，引物的濃度範圍為0.1～1.0μmol／L；等濃度的4種脫氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP貯存液，每種dNTP的濃度範圍為100～300μmol/L；反應緩衝液，內含10mmo/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明膠0.15mg/ml，再加入人基因DNA待測樣品，混勻；(1.2)短暫離心後進行PCR循環(2)電泳鑑定PCR產物，通過觀察電泳凝膠上出現的螢光譜帶(DNA擴增帶)的數目分析結果若出現P4+P7擴增產物的長度為正常基因片段；若出現P1+P2擴增產物的長度則為缺失型α珠蛋白基因片段。
4．根據權利要求3所述的缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法，其特徵在於其檢測過程依次包括如下步驟(1)PCR擴增(1.1)取0.5ml滅菌eppendorf試管一支，在50μl總反應體積中，分別加入等濃度的4個引物P1:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCTGTGTTCTCAGTATTGGAG-3』、P2:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTATATATGGGTCTGGAAGTGTATC-3』、P7:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCACTTCCTGTGTCACGGT-3』、P4:5』-GGGGTCCCAAAAGGGTCAGTCTCCGACCAGCTTAGCAAT-3』的混合貯存液5μl，等濃度的4種脫氧三磷酸核苷酸dAP、dCTP、dGTP和dTTP的混合貯存液5μl，反應緩衝液，內含10mmol/L Tris-HCl,pH9.0；50mmol/L KCl；1.50mmol/L MgCl2；0.15％Triton X-100和明膠0.15mg/ml，再加入人基因DNA待測樣品0.5μg，混勻；(1.2)短暫離心後置PCR循環儀中循環95℃預變性5分鐘，繼續以95℃變性45秒，57℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30循環，最後72℃繼續延伸7分鐘，取出，4℃存放待檢測；(2)電泳鑑定PCR產物取步驟(1.2)中最後產物10μl，加1％的瓊脂糖凝膠，其中含有0.5μg/ml EB染料；電泳100V電壓×30分鐘；在紫外透射儀上觀察結果擴增產物的長度，正常基因片段為1052db；缺失型α珠蛋白基因片段為740db。
全文摘要
本發明提供一種缺失型人α珠蛋白基因的PCR檢測方法,本發明採用4個(2對)引物P1、P2、P7、P4組成2對PCR反應,分別針對正常等位基因和缺失等位基因(－SEA/基因),提供了引物的設計方案和結果的解釋。根據本發明的新方案所建立的檢測－SEA缺失基因的方法,經實驗證實可在同一試管內同時實現2對特異性PCR引物的擴增,且有很好的重複性。本方法除提供－SEA缺失基因檢測信息外,還能一次檢測提供多種有價值的特定α珠蛋白基因缺失的信息。
文檔編號G01N33/50GK1307235SQ0011406
公開日2001年8月8日 申請日期2000年2月3日 優先權日2000年2月3日
發明者徐湘民, 肖維威, 鍾雄霖, 劉忠英 申請人:中國人民解放軍第一軍醫大學