一種全程定量檢測肌鈣蛋白i的免疫層析試紙條及其製備方法

2023-06-27 11:38:41

專利名稱：一種全程定量檢測肌鈣蛋白i的免疫層析試紙條及其製備方法
技術領域：
本發明屬於醫學檢驗領域，尤其涉及一種全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試 紙條及其製備方法。
背景技術：
心血管疾病發病率高、致殘率高、死亡率高、併發症多，對健康危害極為嚴重。心血 管檢驗是整個心血管領域中的「瓶頸」學科，只有在儘可能段的時間內正確診斷疾病，才有 可能及時有效的將先進治療手段用於臨床，使患者受益。隨著對心血管診斷標誌物研究的 日益深入，更加明確了相關標誌物對於臨床意義，心臟標誌物的檢測可直接影響心血管疾 病患者的臨床診斷、危險分層、治療方案選擇和預後判斷。因此縮短心臟標誌物檢測的周轉 時間(turn-aroimdtime，TAT)對於臨床早期診斷和早期治療心血管疾病具有重要的意義， 其中心肌肌鈣蛋白(cTn)又是目前心血管疾病臨床敏感性和特異性最好的心肌損傷標誌 物，已成為心肌組織損傷(如心肌梗死)最重要的診斷依據。在心臟疾病的臨床診斷與篩查過程中，各種檢測技術的應用為及時早發現、診斷 和治療提供了嚴格的科學依據。目前常用的心臟疾病檢測診斷方法，主要包括非實驗室診 斷的如家族心臟病史調查、心電圖檢查、X射線胸透檢查、心電圖負荷實驗、心導管術、心臟 超聲波檢查等和實驗室檢驗的如心臟標誌物肌酸激酶(CK)與肌酸激酶同工酶(CK-MB)J^ 鈣蛋白I(cTnl)或肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白(Myoglobin)、BNP或NT-proBNP檢測等。心臟疾病非實驗室檢測操作需要專業的儀器設備和人員，成本高；實驗室方法心 髒標誌物的檢測目前已經廣泛應用於心臟疾病的檢測診斷，但主要集中在檢驗科或生化室 的如貝克曼、西門子、羅氏、德靈等大型生化檢測系統，由於檢測成本高、樣本檢測周轉時間 較長，通常也很難保證心臟標誌物對於時間的要求，血管病發緊急，預後危重，所以心臟標 志物的P0CT(P0INT-0F-CAREteSting)檢測是發展最快的一部分。目前市場上主要的檢測 系統包括美國Biosite的Biosite Triage檢測系統、加拿大的Response的RAMP檢測系 統，美國 Abbott 的 i-SATA 檢測系統以及日本 Mitsubishi Kagaku Iatron 的 Pathfast 檢 測系統等。螢光免疫分析方法(fluoroismmmoassay，FLA)是近年來發展起來的一種微量分 析方法，是目前最靈敏的微量分析技術之一，根據螢光的光譜和螢光強度，對物質進行定性 或定量分析，具有高靈敏度、選擇性強、需樣量少和操作簡便等優點。其檢測靈敏度較放射 免疫分析(RIA)高出多個數量級；其測定靈敏度通常比分光光度法高2-4個數量級，在生化 分析中的應用較為廣泛。但目前的螢光免疫分析絕大多數為液相的均相體系，試劑受制於 保存條件與效期，不利於現場、基層單位的項目開展。而固相螢光免疫分析法則在保持高靈 敏度的同時，又很好的解決試劑的保存、現場操作的問題，成為可攜式診斷醫療器械的研究 熱點。該技術尚未在疾病診斷領域獲得較廣泛的運用，在國際上屬於領先技術，在國內處於 初級研究階段。

發明內容
本發明的目的在於針對現有技術中存在的不足，提供一種靈敏度高、穩定性強、測 定準確的全程肌鈣蛋白I檢測試紙條。為實現上述目的，本發明採取了以下技術方案一種全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，所述試紙條由樣品墊、玻璃纖 維膜標記墊、硝酸纖維膜包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成，所述玻璃纖維膜標記 墊上包被有螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體；所述硝酸纖維膜包被膜包括檢測 區和質控區，所述檢測區包被有與所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體處於不 同表位的另一種肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質控區包被羊抗鼠IgG。優選地，所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. 1-lmg/ml, 按1 20-1 500的稀釋度，100 μ l/20-30cm的噴膜用量塗覆在玻璃纖維膜標記墊上。 所述檢測區包被的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. 5 2mg/ml，在試紙條上的噴膜用量 為100μ l/20-30cm。所述羊抗鼠IgG的濃度為1. 0 2mg/ml，在試紙條上的噴膜用量為 100 μ l/20-30cmo優選地，所述螢光膠乳微粒的直徑為lOO-lOOOnm。所述螢光膠乳微粒受激發後發 射的波長為600nm-700nm。本發明還提供了一種製備全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條的方法，採 取了以下技術方案包括以下步驟A.按常規方法共價活化螢光膠乳；B.製備玻璃纖維膜標記墊將活化後的螢光膠乳超聲波200W處理30秒後，按照1 μ g 125 μ g抗體/100 μ 1 螢光膠乳的比例加入肌鈣蛋白I單克隆抗體，混勻後室溫攪拌反應1. 5-3小時，離心洗滌 2-4次，每次10000 15000xg、離心5 15分鐘，沉澱用PBS-TBN溶解並超聲波100W處理 30秒，用PBS-TBN恢復離心前體積，按100 μ l/20-30cm的噴膜用量塗覆到玻璃纖維膜標記
墊上；C.製備硝酸纖維素包被膜分別將與玻璃纖維膜標記墊上的肌鈣蛋白I單克隆抗體位於不同表位另一株肌 鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG用包被緩衝液分別調節至0. 5 2mg/ml和1. 0 ^iig/ ml，按膜包被液量為100μ l/20-30cm，將肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴到硝酸纖維 素包被膜上對應的檢測區和質控區進行包被，涼幹，備用；D.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、玻璃纖維膜標記墊、硝酸纖維素包被膜 和吸水紙，即得。本發明所述的一種肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條的檢測原理是雙抗體夾心法，將 直徑範圍0. 01 μ m 1 μ m的螢光膠乳微球與一種肌鈣蛋白I抗體偶聯，當此螢光膠乳標記 的肌鈣蛋白I抗體與檢測樣本中足夠的肌鈣蛋白I抗原結合形成複合物，該複合物在層析 作用下移動至包被膜的檢測區，在包被膜的檢測區包被有能與肌鈣蛋白I抗原的另一種抗 體，該抗體結合在肌鈣蛋白I抗原的另一表位上，形成雙抗體夾心的複合物。利用螢光定量光譜檢測系統，由光源激發包被膜上檢測區T線處聚積的螢光膠乳，螢光膠乳發射出的熒 光被相應的檢測系統接收，並通過光電變換、光電轉化等過程將光電信號轉化成電信號，並 由系統中設置的自動控制系統將信號輸出，顯示出最終的定量結果。由於選擇的螢光膠乳 的種類的不同，其激發/發射光的波長λ以及自動控制系統也會不同。本發明所述的肌鈣蛋白I免疫層析試紙條與放射性免疫、酶聯免疫法檢測肌鈣蛋 白I抗體相比，具有操作安全(無放射物汙染)、簡便(簡單操作一步完成)、適合單人份 檢測和快速(3分鐘左右即可有結果)等優點；與免疫膠體金標記試紙條相比，本發明具有 靈敏度更高、準確定量、多指標檢測(不同波段的螢光膠乳標記應用於多指標同步定量檢 測)、標記穩定性更好等優點。本發明可以達到僅10秒就能對全程肌鈣蛋白I進行靈敏的定量測定，更快更精確 的診斷疾病和鑑別感染，能檢測感染病情和確定抗生素的療效。


圖1為本發明的全程定量檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條的結構示意圖；附圖標記1、樣品墊；2、玻璃纖維膜標記墊；3、硝酸纖維素包被膜；4、吸水紙；5、 檢測區；6、控制區；7、底板。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例來詳細說明本發明。實施例1在本發明實施例中，所採用的肌鈣蛋白I抗體為常規單克隆抗體技術製備的單 抗，利用雙抗體夾心法檢測肌鈣蛋白I抗原的原理檢測標本。如圖1所示，在該實施例中，全程定量檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條，包括遠端 和近端，樣品墊1位於試紙條的近端，它含有一個親水性的孔狀隔膜，樣品墊1是加樣區，用 於吸取待檢測肌鈣蛋白I檢測樣本。樣品墊1與遠端之間，依次搭接有玻璃纖維素膜標記 墊2、硝酸纖維素膜包被膜3和吸水紙4。樣品墊1、玻璃纖維膜標記墊2、硝酸纖維素包被 膜3和吸水紙4都設置在底板7上。在該實施例中，玻璃纖維膜標記墊2上是使用特定的激發光G70nm)/發射光 (525nm)波長的螢光膠乳(直徑約300nm)標記1株肌鈣蛋白I單克隆抗體(0. 5mg/ml)；硝 酸纖維素包被膜3的檢測區5(T線)處採用肌鈣蛋白I的另一株單克隆抗體(0. 5mg/ml) 來包被。在包被膜3的質控區6處使用濃度為lmg/ml的羊抗鼠IgG進行包被，起到過濾的 作用，防止血清中的非特異性鼠IgG對質控區、檢測區處反應的影響。在該實施例中，全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條的製備包括以下步 驟1.螢光膠乳的共價活化超聲波處理膠乳微球體30秒後，調節膠乳微球體濃度為1.0X IO12 1.0X IO13/ ml, 10000 15000xg離心10分鐘，離心後收集沉澱物用蒸餾水或者IOOmM pH6. 0磷酸鈉溶 液溶解，並超聲波200W處理30秒；先加入50 μ 1的lOOmg/mlEDC,震蕩混勻，再加入50 μ 1 的50mg/ml N-羥基硫代琥珀醯亞胺(S μ lfo-NHS)，震蕩混勻；室溫孵育30分鐘後10000 15000xg、離心5 15分鐘，沉澱用IOOmM, ρΗ5· 0 6. 0的檸檬酸緩衝液溶解，放置在2 8 °C條件下備用；2.螢光膠乳微粒標記蛋白的製備利用常規方法從體液中分離肌鈣蛋白I，用肌鈣蛋白I免疫小鼠，與骨髓瘤細胞融 合，用ELISA方法鑑別，鑑別出來的雜交瘤在腹水中培養，篩選陽性克隆，分離純化肌鈣蛋 白I單抗。選擇2株不同表位的肌鈣蛋白I單抗，分別作為標記抗體和包被抗體；將活化後的螢光膠乳超聲波200W處理30秒後，按照50 μ g標記抗體/100 μ 1螢光 膠乳的比例加入肌鈣蛋白I單克隆抗體，混勻後室溫攪拌反應2小時，離心洗滌3次，每次 10000 15000xg、離心10分鐘，沉澱用PBS-TBN溶解並超聲波100W處理30秒，用PBS-TBN 恢復離心前體積，按100μ l/20cm的噴膜用量塗覆到玻璃纖維膜標記墊上；3.製備硝酸纖維素包被膜分別將與玻璃纖維膜標記墊上的肌鈣蛋白I單克隆抗體位於不同表位另一株肌 鈣蛋白I單克隆抗體(包被抗體)和羊抗鼠IgG用包被緩衝液分別調節至0. 5mg/ml和Img/ ml，按膜包被液量為100μ l/20cm，將肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴到硝酸纖維素 包被膜上對應的檢測區和質控區進行包被，檢測區和質控區間隔3-8mm，在溼度< 30%、室 溫下涼幹12-M小時，封袋，涼幹，備用；4.在底板5上依次相互搭接地粘貼樣品墊1、玻璃纖維膜標記墊2、硝酸纖維素包 被膜3和吸水紙4得到試紙板，按照要求切割成適當寬度的試紙條。實施例2該實施例中的檢測試紙條結構均與實施例1相同。所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. lmg/ml，在試紙條上 的噴膜用量為100μ l/25cm。所述檢測區包被的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為lmg/ml， 在試紙條上的噴膜用量為100μ l/25cm。所述羊抗鼠IgG的濃度為1. 5mg/ml，在試紙條上 的噴膜用量為100μ l/25cm。該實施例的製備方法除了步驟2中肌鈣蛋白I單克隆抗體螢光膠乳為 15μ g/ΙΟΟμ 1。其餘均與實施例1相同，使用方法也與實施例1相同。實施例3該實施例中的檢測試紙條結構均與實施例1相同。所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. 8mg/ml，在試紙條上 的噴膜用量為100μ l/^8cm。所述檢測區包被的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為2mg/ml， 在試紙條上的噴膜用量為100μ l/^8cm。所述羊抗鼠IgG的濃度為2mg/ml，在試紙條上的 噴膜用量為100μ l/^8cm。該實施例的製備方法除了步驟2中肌鈣蛋白I單克隆抗體螢光膠乳為 100μ g/ΙΟΟμ L·其餘均與實施例1相同，使用方法也與實施例1相同。在本發明的一個實施例中，全程定量檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條，在使用時， 組裝在由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料外殼中，塑料上殼設有兩個開孔，加樣窗和 顯示孔，加樣窗對應於所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條樣品墊1，結果顯示 窗對應於所述全程定量檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條的檢測區5和控制區6，該全程定量 檢測肌鈣蛋白I免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。
本發明的一個實施例中，用來測試免疫層析試紙條的螢光定量光譜檢測系統，主 要包含螢光光源系統、檢測系統及自動軟體分析控制系統。螢光光源系統發出單色激發光，照射在試紙條的檢測區，檢測區通過反應凝集的 螢光膠乳在激發光的作用下，發射出螢光信號，該螢光信號被檢測系統捕獲，檢測系統由光 電倍增管和固態檢測器組成，檢測系統接收入射螢光信號，由光電倍增管實現光信號的放 大，然後由固態檢測器將光信號轉換為電信號，由電信號讀出電路將電信號輸出，再經過自 動軟體分析控制系統處理，在顯示屏上顯示結果。實現對樣本的精確定量。對實施例1-3的試劑條進行了性能方面的測定，利用實施例1-3所述的試劑條對 本發明肌鈣蛋白I的最低檢測限是0. 03ng/ML,以BECKMAN COULTER公司的access2試劑為 對照檢測標準，總符合率達到99. 1 %以上，與臨床結果的相關係數R2 >0. 95 ；P <0.01 ；按 α =0.05;具有正相關關係。在精密度方面，利用實施例1-3的試劑條對含量分別為高值、低值和中值的樣 本，連續檢測至少10次，計算變異係數(CV)。對於肌鈣蛋白I含量高值4ng/ML)、 中值(3. 39ng/ML)、低值(0. 34ng/ML)血液樣本各一例分別測定10次，根據其測定數據， 利用SPSS統計酸鹼分析得(批內肌鈣蛋白重複測定結果以均值+/_標準差表示)高值 (21. 92+/-0. 55)ng/ml, CV2. 5% ；中值(3. 18+/-0. 18)ng/ml, CV5. 5% ；低值(0. 33+/-0. 02) ng/ml, CV7.6% ；檢驗結果CV值均小於15%。
權利要求
1.一種全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，所述試紙條由樣品墊(1)、玻璃纖 維膜標記墊O)、硝酸纖維膜包被膜(3)、吸水紙(4)順次搭接粘貼在底板(7)上構成，其特 徵在於，所述玻璃纖維膜標記墊( 上包被有螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體； 所述硝酸纖維膜包被膜( 包括檢測區( 和質控區(6)，所述檢測區( 包被有與所述熒 光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體處於不同表位的另一種肌鈣蛋白I單克隆抗體， 所述質控區(6)包被羊抗鼠IgG。
2.根據權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，其特徵在於， 所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. 1-lmg/ml，按1 20_1 500 的稀釋度，100 μ l/20-30cm的噴膜用量塗覆在玻璃纖維膜標記墊上。
3.根據權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，其特徵在於，所 述檢測區包被的肌鈣蛋白I單克隆抗體的濃度為0. 5 2mg/ml，在試紙條上的噴膜用量為 100 μ l/20-30cmo
4.根據權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，其特徵在於，所 述羊抗鼠IgG的濃度為1. 0 2mg/ml，在試紙條上的噴膜用量為100 μ l/20-30cm。
5.根據權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，其特徵在於，所 述螢光膠乳微粒的直徑為lOO-lOOOnm。
6.根據權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，其特徵在於，所 述螢光膠乳微粒受激發後發射的波長為600nm-700nm。
7.—種權利要求1所述的全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條的製備方法，其 特徵在於，包括以下步驟A.按常規方法共價活化螢光膠乳；B.製備玻璃纖維膜標記墊將活化後的螢光膠乳超聲波200W處理30秒後，按照1 μ g 125 μ g抗體/100 μ 1熒 光膠乳的比例加入肌鈣蛋白I單克隆抗體，混勻後室溫攪拌反應1. 5-3小時，離心洗滌2-4 次，每次10000 15000xg、離心5 15分鐘，沉澱用PBS-TBN溶解並超聲波100W處理30 秒，用PBS-TBN恢復離心前體積，按100μ l/20-30cm的噴膜用量塗覆到玻璃纖維膜標記墊 上；C.製備硝酸纖維素包被膜分別將與玻璃纖維膜標記墊上的肌鈣蛋白I單克隆抗體位於不同表位另一株肌鈣蛋 白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG用包被緩衝液分別調節至0. 5 2mg/ml和1. 0 2mg/ml，按 膜包被液量為100μ l/20-30cm，將肌鈣蛋白I單克隆抗體和羊抗鼠IgG噴到硝酸纖維素包 被膜上對應的檢測區和質控區進行包被，涼幹，備用；D.在底襯上順次相互搭接地粘貼樣品墊、玻璃纖維膜標記墊、硝酸纖維素包被膜和吸 水紙，即得。
全文摘要
本發明公開了一種全程定量檢測肌鈣蛋白I的免疫層析試紙條，所述試紙條由樣品墊、玻璃纖維膜標記墊、硝酸纖維膜包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構成，所述玻璃纖維膜標記墊上包被有螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體；所述硝酸纖維膜包被膜包括檢測區和質控區，所述檢測區包被有與所述螢光膠乳微粒標記的肌鈣蛋白I單克隆抗體處於不同表位的另一種肌鈣蛋白I單克隆抗體，所述質控區包被羊抗鼠IgG。本發明具有操作安全、簡便、適合單人份檢測和快速等優點；僅10秒就能對全程肌鈣蛋白I進行靈敏的定量測定，更快更精確的診斷疾病和鑑別感染，能檢測感染病情和確定抗生素的療效。
文檔編號G01N33/558GK102087293SQ20101061973
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月31日 優先權日2010年12月31日
發明者周楠, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術有限公司