一種用於檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化試劑的製備及其應用的製作方法

2023-06-27 18:07:21 5

專利名稱：：一種用於檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化試劑的製備及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種用於檢測左旋卡尼汀或和右旋卡尼汀含量的衍生化試劑的製備及應用。
背景技術：
：左旋卡尼汀具有多種生理功能，其最基本的功能是"運載"長鏈脂肪酸通過線粒體內膜，進入線粒體基質進行13氧化。左旋卡尼汀在脂肪酸代謝中起著重要的作用，一旦體內肉鹼合成受阻、肉鹼排出和降解過盛、肉鹼轉移酶降低或喪失，都將造成機體脂類代謝的紊亂，影響能量供應，導致許多疾病。天然左旋卡尼汀的典型提取方法是Cater等在1952年報導的從牛肉中提取，由於肉類食物中左旋卡尼汀的絕對含量很低，並且肉汁中膽鹼的存在(其結構與左旋卡尼汀非常相似)，很難分離，因而直接提取法的步驟比較複雜、得率低、價格昂貴，因此不易於大量獲得天然左旋卡尼汀。目前藥用的左旋卡尼汀通常都是使用人工合成獲得的。一般使用外消旋化合物進行拆分製備左旋卡尼汀，該方法原料易得、價格低廉，工藝簡單方便，易於實現工業化。但是由於傳統的化學拆分法的缺陷，化學拆分不可能完全去除右旋異構體，因此人工合成的左旋卡尼汀不是絕對的左旋卡尼汀，還含有右旋卡尼汀。天然的卡尼汀都是左旋卡尼汀，只有左旋卡尼汀才具有生理活性，而右旋卡尼汀對肉鹼乙醯轉移酶(CAT)和肉鹼脂肪醯轉移酶(PTC)有競爭性抑制作用，大約有10%的患者服用混旋體的卡尼汀後發生重症肌無力樣的症狀(《馬丁戴爾大藥典》第33版Pagel356)，因此準確測定人工合成左旋卡尼汀中的右旋異構體含量非常重要，關係到人類用藥安全。目前一般通過測定比旋度的方法來檢測左旋卡尼汀產品中右旋卡尼汀的含量，但是該方法測定精度不高。為了能精確測定左旋卡尼汀產品中右旋卡尼汀的含量，為人們提供更安全有效的藥物和保健品、食品，我們有必要發展更準確和靈敏的測定左旋卡尼汀中的右旋卡尼汀的方法。
發明內容本發明的目的之一在於提供一種用於測定左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)含量的試劑及其製備方法，本發明的製備方法簡單、經濟，採用本發明製備方法所得到的試劑保存穩定，使用方便。本發明的目的之二在於提供一種測定左旋卡尼汀或右旋卡尼汀原料及含有左旋卡尼汀或/和右旋卡尼汀的各種藥物製劑或生物製劑、保健品、化妝品、人體體液和各種食品中的左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)含量的檢測方法。本發明的檢測方法靈敏度高，方便快捷。本發明公開了的用於檢測左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的衍生化試劑是含有光學活性純的下式(I)化合物formulaseeoriginaldocumentpage5式(I)中帶*的碳原子是手性碳原子，本發明使用的化合物是其單一光學活性的手性化合物，其是D型或L型；R代表具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有6-10個碳原子的芳烷基，或具有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基，或具有3-6個碳原子的環烷基；X代表滷素。本發明使用的式(I)化合物，其中R代表甲基、乙基、異丙基、丁基或苄基；X代表CI或Br。本發明公開了優選(+)a-甲基-6-甲氧基-2-萘乙醯氯作為檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀的衍生化試劑。本發明公開了用於檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的衍生化試劑，優選光學活性純式(I)化合物的固體結晶，與其他任何光學活性純式(I)化合物的溶液相比，固體結晶更加穩定，不易分解，便於保存。本發明公開了光學活性純式(I)化合物固體結晶的製備方法是通過使用適當溶劑進行重結晶，溶劑選自乙醚、丙醚、四氫呋喃、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、丙腈、二氯甲烷、氯仿、正己烷、乙酸乙酯，或它們任意兩種或多種的混合物。本發明公開了光學活性純式(I)化合物重結晶溶劑優選乙腈。本發明同時公開了使用光學活性純式a)化合物的溶液作為衍生化試劑，其製備方法是將光學活性純式a)化合物及其固體結晶溶於溶劑中配置成一定濃度的溶液，溶劑選自乙醚、丙醚、四氫呋喃、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、丙腈、乙酸乙酯，或他們任意兩種或多種的混合物，溶液濃度為0.01100mg/ml。本發明優選乙腈為溶劑，濃度為l-10mg/ml。本發明衍生化試劑包含的有效成分式(I)化合物粗產物的製備方法是通過以下步驟formulaseeoriginaldocumentpage5(+)或(_)a-甲基-6-烷氧基-2-萘乙酸水解，再用其它滷代烴與酚羥基結合，用所得產物進行醯滷反應後製得醯滷粗產物。本發明公開了製備光學活性純式(I)化合物固體結晶的方法將以上醯滷反應所得的醯滷粗產物使用適當溶劑進行重結晶製得固體結晶。溶劑選自乙醚、丙醚、四氫呋喃、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、丙腈、二氯甲烷、氯仿、正己烷、乙酸乙酯，或它們任意兩種或多種的混合物。本發明公開了光學活性純式(I)化合物重結晶溶劑優選乙腈而得到光學純度高、保存穩定的高純度的固體結晶。本發明公開了光學活性純式(I)化合物(+)ci-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯固體結晶，其特徵為白色針狀晶體，熔點92.393.5t:;X衍射圖譜數據衍射角(29)在6.579(d=13.4231，1/1。=54.4)，10.979(d=8.0522，1/1。=34.1)，13.218(d=6.6925，1/1。=72.2)，13.499(d=6.5539，1/1。=45.8)，18.222(d=4.8646，1/1。=21.2)，18.780(d=4.7211，1/10=100.0)，19.901(d=4.4577，1/10=21.7)，21.619(d=4.1072，1/1。=26.2)，22.100(d=4.0188，1/1。=75.3)，27.139(d=3.2830，1/1。=19.0)，47.681(d=1.9057，1/1。=15.0)處具有特徵峰；IR:3414.5cm—、2983.2cm—、1786.2cm—、1605.0cm—、1390.6cm—、1270.4cm—、1183.lcm—、823.8cm—、701.6cm—、472.2cm—1;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):1.66(m，3H)，3.78(s，3H)，4.46(m，1H)，7.19(m，1H)，7.29(m，1H)，7.43(m，1H)，7.82(m，1H)，7.83(s，1H)，7.85(s，1H);碳氫氮元素分析C%:67.76(理論值67.61)，H%:5.25(5.27)MS:分子量為248、250，是氯的同位素峰，m/z185是基峰，豐度為100%，推斷碎片本發明公開了一種檢測樣品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法，該檢測方法包括以下步驟(1)配製適量左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的供試品和消旋卡尼汀對照品溶液。(2)取適量本發明的衍生化試劑，與含左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的供試品溶液混勻，使試品溶液中的左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)發生衍生化反應，產生左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)衍生物。(3)用高效液相色譜法檢測，並計算出供試品溶液中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。本發明公開了一種檢測樣品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法，其特徵在於該檢測方法包括以下步驟(1)製備衍生化試劑在避光條件下，使權利要求1-5任一項的含D型_或L型式(I)化合物溶解於權利要求7中所述的溶劑中，配置成濃度為0.01100mg/ml的溶液。其特徵在於式(I)化合物優選(+)a-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯，溶劑優選乙腈，溶液的濃度優選l-10mg/ml。(2)分別製備濃度合適的左旋卡尼汀或右旋卡尼汀供試品溶液和消旋卡尼汀對照品溶液。(3)在溶劑的存在下，在2(TC95t:的水浴中，使上述步驟(1)的衍生化試劑分別與上述步驟(2)的供試品溶液和對照品溶液接觸密閉反應20min180min。(4)通過高效液相色譜儀分離和檢測反應後的對照品溶液和供試品溶液，按外標法分別以峰面積計算樣品中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。詳細檢測方法還包括(1)色譜條件用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，以三乙胺緩衝溶液(磷酸8ml，三乙胺15ml，加水1500ml)-四氫呋喃為流動相進行梯度洗脫。螢光激發波長為230nm260nm，發射波長為340nm380nm。(2)供試品溶液的製備精密稱取樣品適量，加水溶解並稀釋製成含左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)0.1iig/ml3.0iig/ml的溶液，作為供試品溶液。(3)對照品溶液的製備精密稱取消旋卡尼汀適量加水溶解並稀釋製成0.2iig/ml6.0iig/ml的溶液，作為參比對照品溶液。(4)衍生化反應取對照品溶液和供試品溶液各30iU，分別置5ml量瓶中，各加入0.Olmol/L0.5mol/L碳酸緩衝溶液適量，吡啶乙腈溶液(每1ml乙腈中含吡啶1yl50iU適量和本發明的衍生化試劑溶液適量，混勻，密塞，於20°C95t:水浴中加熱密閉反應，取出後立即用乙酸緩衝液稀釋至刻度，搖勻，濾過。(5)含量測定方法分別精密吸取等量的供試品和對照品衍生化反應後的溶液注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法分別以峰面積計算樣品中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(1)中色譜條件的流動相由三乙胺緩衝溶液(磷酸8ml，三乙胺15ml，加水1500ml)和四氫呋喃的混合溶液組成。三乙胺緩衝溶液的pH值為2.09.0。兩組分的梯度為0lOmin，三乙胺緩衝溶液70%90%，四氫呋喃30%10%;10llmin，三乙胺緩衝溶液70%—30%90%—30%，四氫呋喃30%—70%10%—70%;1118min，三乙胺緩衝溶液30X，四氫呋喃70%;1819min，三乙胺緩衝溶液30X—70%30%—90%，四氫呋喃70%—30%70%—10%;1925min，三乙胺緩衝溶液70%90%，四氫呋喃30%10%。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(3)中對照品溶液的具體製備是精密稱量消旋卡尼汀2mg60mg於100mL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容作為對照品溶液。當左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)樣品濃度為0.1iig/ml3.0iig/ml有較好的線性關係，其線性相關係數為r=0.9991，回收率為100.6%。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(4)中衍生化試劑的濃度為0.01100mg/ml，優選l-10mg/ml，最優選5mg/ml。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(4)中碳酸緩衝溶液的具體製備方法為取4.2g碳酸氫鈉加水900ml，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH7.012.O，加水至1000mL。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(4)中碳酸緩衝溶液的加入量為5iU500iU。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(4)中反應溫度為20°C95。C，反應時間為20min180min。本發明左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量檢測方法，上述(4)中乙酸緩衝溶液的具體製備方法為取3.OmL冰醋酸加水900mL，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH2.07.O，加水至lOOOmL。本發明公開了本發明的衍生化試劑和檢測方法，應用於檢測各種含有左旋卡尼汀或/和右旋卡尼汀的藥物製劑、生物製劑、保健品、化妝品和各種食品中左旋卡尼汀或/和右旋卡尼汀含量，如左旋卡尼汀原料藥、注射液、口服液、片、減肥膠囊、飲料等。本發明公開了本發明的衍生化試劑和檢測方法，應用於檢測各種包括人在內的哺乳動物組織和血漿中左旋肉鹼的濃度。本發明公開了本發明的衍生化試劑和檢測方法，適用於檢測各種可食用的動植物食品中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。如豬、牛、羊、雞、蝦、魚、蛋、蔬菜、水果等食物。本發明公開了本發明的衍生化試劑和檢測方法，適用於檢測各種動物飼料中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。本發明公開了本發明的衍生化試劑和檢測方法，適用於檢測各種植物養料中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。本發明公開了本發明的衍生化試劑，應用於檢測其他手性胺基酸的光學活性純的本文中所使用的代號說明D型右旋異構體L型左旋異構體IR:紅外吸收光譜HNMR:核磁共振氫譜MS:質譜HPLC:高效液相色譜(+)MNPC:(+)a-甲基_6_甲氧基_2_萘乙醯氯(+)ENPC:(+)a-甲基_6_乙氧基_2_萘乙醯氯(+)PNPC:(+)a-甲基_6_異丙氧基_2_萘乙醯氯(+)BUNPC:(+)a-甲基_6_丁氧基_2_萘乙醯氯(+)BNPC:(+)a-甲基_6_苄氧基_2_萘乙醯氯附圖1左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)含量測定激發波長光譜掃描圖附圖2左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)含量測定發射波長光譜掃描圖附圖3左旋卡尼汀含量測定高效液相色譜圖左旋卡尼汀(tR=5.139min)附圖4消旋卡尼汀含量測定高效液相色譜圖右旋卡尼汀(tR=4.389min)左旋卡尼汀(tR=5.136min)具體實施例方式下述實施例用於解釋本發明，而不是對本發明範圍的限制。實施例1(+)a-甲某-6-甲氧某-2-萘乙醯氯(即(+)MNPC)的製備在100ml單口瓶中加入4.6g(+)a-甲基-6-甲氧基_2_萘乙酸和50mlTHF，冰水浴冷卻，磁力攪拌，加入2mlS0Cl2，再加入適量吡啶，反應6小時後旋蒸至幹，加入20ml乙腈，冷凍析出淡黃色固體，用15ml乙腈重結晶，得到白色針狀晶體。常溫下真空乾燥產品得2.87g，收率57%，熔點92.393.5°C。IR:3414.5cm—、2983.2cm—、1786.2cm—、1605.Ocm—、1390.6cm—、1270.4cm—、1183.1cm—、823.8cm—、701.6cm—、472.2cm—工。1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):1.66(m，3H)，3.78(s，3H)，4.46(m，1H)，7.19(m，1H)，7.29(m，1H)，7.43(m，1H)，7.82(m，1H)，7.83(s，1H)，7.85(s，1H)。X衍射圖譜數據衍射角(29)在6.579(d=13.4231，1/1。=54.4)，10.979(d=8.0522，I/I0=34.1)，13.218(d=6.6925，I/I0=72.2)，13.499(d=6.5539，I/I0=45.8)，18.222(d=4.8646，1/1。=21.2)，18.780(d=4.7211，1/1。=100.0)，19.901(d=4.4577，1/1。=21.7)，21.619(d=4.1072，1/1。=26.2)，22.100(d=4.0188，1/1。=75.3)，27.139(d=3.2830，1/1。=19.0)，47.681(d=1.9057，1/1。=15.0)處具有特徵峰。MS:分子量為248、250，是氯的同位素峰，m/z185是基峰，豐度為100%，推斷碎片碳氫氮元素分析:C%:67.76(理論值67.61)，H%:5.25(5.27)。實施例2(+)a-甲基-6-乙氧基-2-萘乙醯氯(即(+)ENPC)的製備步驟1將50g(+)a-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸溶於250ml冰醋酸，加熱至回流，每30分鐘加入36%的濃鹽酸20ml，反應6小時後將反應液倒入600g冰水中，抽濾，固體用乙醇-水重結晶，乾燥後得無色晶體9.87g(收率90.5%)。熔點189.4191.3°C;IR:3411.1cm—、1701.4cm—、1632.5cm—、1606.2cm—、1509.1cm—、1384.4cm—、1189.Ocm—、1147.3cm—、865.9cm—、477.8cm—1;;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):S1.53(m，3H)，3.98(m，1H)，7.15(m，1H)，7.20(m，1H)，7.42(m，1H)，7.67(m，1H)，7.73(s，1H)，7.76(m，1H)，8.55(s，1H)。步驟2在200ml甲醇中溶解32.Og氫氧化鉀和41.Og步驟1的產物，再加入35.5ml溴乙烷，加熱回流2h，稍冷卻後加入200ml的5%氫氧化鈉回流反應34h，結束後加入600ml冰水，攪拌後靜置抽濾，濾液用稀鹽酸調pH至12，攪拌均勻後靜置抽濾，並用水洗滌，抽乾後固體用500ml乙醇重結晶，8(TC乾燥4小時得產37.2g，收率80.3%，熔點151.8155.6°C;IR:3453.5cm—、1729.6cm—、1690.5cm—、1604.5cm—、1393.7cm—、1181.9cm—、1158.4cm—、862.4cm—、481.8cm—1;1匪R(CD3C0CD3，500MHz):S1.43(m，3H)，1.53(m，3H)，3.90(m，1H)，4.16(m，2H)，7.15(m，1H)，7.25(m，1H)，7.46(m，1H)，7.75(s，1H)，7.76(s，1H)，7.79(s，1H)。步驟3參照實施例1所用方法，將步驟2所得產物製成醯氯，熔點91.792.9°C。IR:3416.7cm—、2982.1cm—、1785.9cm—、1605.2cm—、1390.5cm—、1269.1cm—、1182.6cm—、823.8cm—、701.8cm—、472.6cm—1;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):S1.43(m，3H)，1.66(m，3H)，4.18(m，2H)，4.46(m，1H)，7.19(m，1H)，7.29(m，1H)，7.43(m，1H)，7.82(m，1H)，7.83(s，1H)，7.85(s，1H)。實施例3(+)a-甲某-6-異丙氣某-2-萘乙醯氯,(即(+)PNPC)的製備用實施例2所用方法，步驟2採用2-溴丙烷為原料製得。熔點77.879.4°C;IR:3416.3cm—、1784.5cm—、1604.8cm—、1390.2cm—、1270.3cm—、1182.5cm—、854.6cm—、699.2cm—、469.5cm—1;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):S1.06(m，3H)，1.65(m，3H)，1.83(m，2H)，4.07(m，2H)，4.45(m，1H)，7.19(m，1H)，7.29(m，1H)，7.42(m，1H)，7.81(m，1H)，7.82(s，1H)，7.84(m，1H)。實施例4(+)a-甲某-6-丁氧某-2-萘乙醯氯(即(+)BUNPC)的製備用實施例l所用方法，步驟2採用溴代正丁烷為原料製得。熔點56.357.3°C;IR:3415.7cm—、1785.3cm—、1605.2cm—、1468.3cm—、1392.3cm—、1268.9cm—、1178.3cm—、921.8cm—、819.9cm—、727.45cm—、474.6cm—1;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):S1.00(m，3H)，1.55(m，2H)，1.67(m，3H)，1.82(m，2H)，4.14(m，2H)，4.48(m，1H)，7.19(m，1H)，7.31(m，1H)，7.42(m，1H)，7.82(m，1H)，7.83(s，1H)，7.85(m，1H)。實施例5(+)a-甲基-6-苄氧基-2-萘乙醯氯(即(+)BNPC)的製備用實施例1所用方法，步驟2採用溴化苄為原料製得。熔點77.279.1°C;1HNMR(CD3C0CD3，500MHz):S1.6(d，3H)，3.81(m，1H)，4.14(m，2H)，4.48(m，1H)，5.26(s，2H)，7.19(m，1H)，7.22(m，1H)，7.38(m，3H)，7.42(m，1H)，7.47(m，2H)，7.83(m，1H)，7.87(m，1H)，7.90(m，1H)。實施例6衍生化反應及色譜條件1.色譜條件與系統適用性試驗AgilentIIOO型高效液相色譜儀；螢光檢測器；色譜柱C18-0DS柱(4.6X150mm，5踐);總流速:lml/min;流動相以三乙胺緩衝溶液(磷酸8ml，三乙胺15ml，加水1500ml，調pH至5.4)-四氫呋喃混合液為流動相，時間梯度如下表1:表IHPLC時間梯度表tableseeoriginaldocumentpage11理論板數按右旋卡尼汀計算大於5000，左旋卡尼汀和右旋卡尼汀各峰分離度均大於1.5。2.檢測波長的選擇將衍生化反應之後的產物進行光譜掃描(附圖1，2)。最終選用234nm作為激發波長，360nm作為發射波長。3.對照品溶液的製備精密稱量消旋卡尼汀20mg於100mL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容作為對照品溶液。4.衍生化反應取對照品溶液和供試品溶液各30iU，分別置5ml量瓶中，各加入0.05mol/L碳酸緩衝溶液100iil(取4.2g碳酸氫鈉加水900ml，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8.4)，吡啶乙腈溶液(每lml乙腈中含吡啶25y1)100y1和的衍生化試劑溶液(0.5%的(+)a-甲基-6_甲氧基-2-萘乙醯氯乙腈溶液)200ia，混勻，密塞，於4(TC水浴中加熱，密閉反應60min，取出後立即用乙酸緩衝液(取3.OmL冰醋酸加水900mL，用5mo1/L的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，加水至1000mL)稀釋至刻度，搖勻，濾過。5.含量測定方法分別精密吸取供試品和對照品衍生化反應後的溶液各10iU注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法分別以峰面積計算樣品中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。當左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)樣品濃度為0.33iig/ml1.64iig/ml有較好的線性關係，其線性相關係數為r=0.9991，回收率為100.6%。實施例7式(I)化合物固體結晶和i亥化合物溶液的穩定件研究首先要保證衍生化試劑的含量準確，才能保證測定結果準確。由於式(I)化合物為醯氯，性質活潑，遇水極易分解，因此必須尋找合適的保存方式和使用條件，包括選擇合適的溶劑，保證式(I)化合物穩定，從而減少測定的誤差。選用乙醚、丙醚、四氫呋喃、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、丙腈、乙酸乙酯等作為溶劑，將式(I)化合物固體結晶配成相應的溶液，並與式(I)化合物固體結晶一起進行考察其穩定性。選取5mg/ml的(+)a-甲基-6-甲氧基_2_萘乙醯氯(即(+)MNPC)乙腈溶液、丙酮溶液、乙酸乙酯溶液及固體結晶分別進行了穩定性試驗考察，實驗數據見表2、表3、表4、表5。表2(+)MNPC固體穩定性考察實驗數據tableseeoriginaldocumentpage12備註保存條件，棕色玻璃瓶分裝，密封冷凍(-15°C)保存表3(+)MNPC乙腈溶液穩定性考察實驗數據tableseeoriginaldocumentpage12備註保存條件，棕色玻璃瓶分裝，密封冷凍(-15°C)保存表4(+)MNPC丙酮溶液穩定性考察實驗數據tableseeoriginaldocumentpage12備註保存條件，棕色玻璃瓶分裝，密封冷凍(-15°C)保存表5(+)MNPC乙酸乙酯溶液穩定性考察實驗數據tableseeoriginaldocumentpage12備註保存條件，棕色玻璃瓶分裝，密封冷凍(-15°C)保存對比上面表2表5中的實驗數據，可以看出在所有固體結晶和溶液樣品中，MNPC固體結晶穩定性比其任何溶液的穩定性都好，在MNPC溶液中以乙腈做溶劑的溶液的穩定性最好，到60天時含量開始明顯下降，而用其他溶劑做溶液的穩定性更差。因此，MNPC固體結晶的穩定性最好，適宜作為衍生化試劑長期保存、運輸；在所有溶液中MNPC的乙腈溶液最為穩定，乙腈適宜作為衍生化試劑的溶劑用於配置衍生化試劑溶液和進行衍生化反應。實施例8測I^A工A成,白勺力i+尼"巾力i+尼"白勺^i精密稱取左旋卡尼汀樣品100mg於lOOmL容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液；另精密稱量消旋卡尼汀20mg於lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取lml於100ml容量瓶中，加水定容，作為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各30iU，分別置5ml量瓶中，各加入0.05mol/L碳酸緩衝溶液100iil(取4.2g碳酸氫鈉加水900ml，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8.4)，吡啶乙腈溶液(每lml乙腈中含吡啶25y1)100y1和的衍生化試劑(0.5%的(+)a-甲基-6-甲氧基-2-萘乙醯氯乙腈溶液)200ill，混勻，密塞，於4(TC水浴中加熱，密閉反應60min，取出後立即用乙酸緩衝液(取3.OmL冰醋酸加水900mL，用5mo1/L的氫氧化鈉溶液調節pH至7.O，加水至1000mL)稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密吸取供試品和對照品衍生化反應後的溶液各10iU注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法分別以峰面積計算樣品中右旋卡尼汀的含量，結果見表6。表6合成的左旋卡尼汀中右旋卡尼汀的含量測定結果tableseeoriginaldocumentpage13實施例9測l定左旋卡尼汀的含量精密稱取左旋卡尼汀樣品10mg於100mL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取lml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液；另精密稱量消旋卡尼汀20mg於100mL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取lml於100ml容量瓶中，加水定容，作為對照品溶液。分別精密吸取30iiL對照品溶液、供試品溶液至5mL棕色容量瓶中，再各自加入0.05mol/L碳酸緩衝液(pH=8.4)100yL、吡啶乙腈溶液100yl禾P0.5%的衍生化試劑的乙腈溶液200iiL，混勻，密塞於4(TC水浴中反應60min，取出，用0.05mol/L乙酸緩衝液(pH=7.0)稀釋至刻度，過濾。分別精密吸取供試品和對照品衍生化反應後的溶液各10iU注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法分別以峰面積計算樣品中右旋卡尼汀的含量，結果見表8。表8左旋卡尼汀的含量測定結果tableseeoriginaldocumentpage13實施例10^W測l^力l^+尼"原、M巾力l^+尼"禾P力l^+尼"白勺^i精密稱取左旋卡尼汀供食供試品lOOmg於lOOmL容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液；另精密稱量消旋卡尼汀20mg於lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，即為對照品溶液1;精密移取"對照品溶液1"lml於100ml容量瓶中，加水定容，作為對照品溶液2。分別精密吸取對照品溶液1，2和供試品溶液各30iU，分別置5ml量瓶中，各加入0.05mol/L碳酸緩衝溶液100ill(取4.2g碳酸氫鈉加水900ml，用5mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8.4)，吡啶乙腈溶液(每lml乙腈中含吡啶25y1)100y1和的衍生化試劑(0.5%的(+)a-甲基-6-甲氧基-2-萘乙醯氯乙腈溶液)200ill，混勻，密塞，於4(TC水浴中加熱，密閉反應60min，取出後立即用乙酸緩衝液(取3.OmL冰醋酸加水900mL，用5mo1/L的氫氧化鈉溶液調節pH至7.0，加水至lOOOmL)稀釋至刻度，搖勻，濾過。分別精密吸取供試品和對照品衍生化反應後的溶液各10注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按外標法分別以峰面積計算樣品中左旋卡尼汀和右旋卡尼汀的含量，結果見表9。表9左旋卡尼汀原料的測定結果tableseeoriginaldocumentpage14實施例11測l站,尼碰身寸麵賴精密移取左旋卡尼汀注射液(5ml:lg)lmL於100mL的容量瓶中，加水定容，再精密移取lml於100ml容量瓶中，加水定容，再精密移取5ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液。用實施例9所用方法測得結果見表10。表10左旋卡尼汀注射液的含量測定結果(標示量)tableseeoriginaldocumentpage14實施例12測l站,尼"□月g*巾白勺賴精密移取左旋卡尼汀口服液(lOml:lg)lmL於lOOmL的容量瓶中，加水定容，再精密移取lml於100ml容量瓶中，加水定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液。用實施例9所用方法測得結果見表11。表11左旋卡尼汀口服液的含量測定結果(標示量)tableseeoriginaldocumentpage15實施例13測驚戲隨巾力,尼"白勺賴取含左旋卡尼汀的減肥膠囊20粒，精密稱定後，傾出內容物(不得損失膠囊殼)，膠囊殼用小刷拭淨後精密稱定；取膠囊內容物混合均勻，研細，精密稱取適量(約相當於左旋卡尼汀10mg)置100ml容量瓶中，加水超聲溶解30min，完全溶解後加水定容，濾過，再精密移取1ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為供試品溶液。用實施例9所用方法測得其中左旋卡尼汀的含量結果見表12。表12某品牌左旋卡尼汀減肥膠囊中左旋卡尼汀含量檢測結果tableseeoriginaldocumentpage15實施例14測驚人血糾,m麵餅血漿供試液預處理吸取血漿(血站購買)100iU，加入含10%甲醇的乙腈400iil，搖勻後，於漩渦混合器上振蕩5min，10000r.min-1離心10min後，取上清液為供試液。對照品溶液精密稱取消旋卡尼汀35mg於lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取1ml於100ml容量瓶中，加水定容即得。用實施例9所用方法測得人體血漿中游離肉鹼的濃度見表13。表13人血漿中游離肉鹼水平的測定結果tableseeoriginaldocumentpage15實施例15測定肉類中的肉鹼水平肉類樣品預處理先將鮮肉粉碎，稱取粉碎後的樣品2g，加入含10%甲醇的乙腈25ml均質5min，超聲處理30min，lOOOOr.min-1離心lOmin後，轉移上清液，殘渣中加入含10X甲醇的乙腈25ml混合，超聲處理30min，10000r.min-1離心lOmin後，合併上清液作為供試品溶液。另精密稱取消旋卡尼汀lOOmg於lOOmL的容量瓶中，加水溶解，定容，再精密移取10ml於100ml容量瓶中，加水定容，作為對照品溶液。用實施例9所用方法測得肉中的肉鹼含量結果見表14。表14豬、牛、羊肉中肉鹼水平檢測結果tableseeoriginaldocumentpage16權利要求含有光學活性純的下式(I)的化合物作為衍生化試劑在分離左旋卡尼汀或右旋卡尼汀或測定樣品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量中的用途。式(I)中帶*的碳原子是手性碳原子，本發明使用的化合物是其單一光學活性的手性化合物，其是D型或L型；R代表具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有6-10個碳原子的芳烷基，或具有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基，或具有3-6個碳原子的環烷基；X代表滷素。F2008101953305C0000011.tif2.權利要求l所述的用途，其中在式(I)化合物中，R代表甲基、乙基、異丙基、丁基或苄基；X代表C1或Br。3.權利要求l所述的用途，其中式(I)化合物為固體結晶形式。4.權利要求3所述的用途，其中所述的式(I)化合物選自(+)a-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯，(_)a_甲基-6-甲氧基-2-萘乙醯氯，(+)a-甲基_6_乙氧基_2_萘乙醯氯和(_)a_甲基_6-乙氧基-2-萘乙醯氯。5.權利要求l-4任一項所述的用途，其中將光學活性純式(I)化合物以其固體結晶溶於溶劑中配置成一定濃度的溶液使用。其溶劑選自乙醚、丙醚、四氫呋喃、丙酮、甲基乙基酮、乙腈、丙腈、乙酸乙酯，或他們任意兩種或多種的混合物；其溶液濃度為0.01100mg/ml。6.權利要求5的用途，其中所述的溶劑是乙腈，濃度為l-10mg/ml。7.—種檢測樣品中左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的方法，其特徵在於，該檢測方法包括以下步驟(1)配製適量左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的供試品和消旋卡尼汀對照品溶液。(2)取適量本發明的衍生化試劑，與含左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的供試品溶液混勻，使試品溶液中的左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)發生衍生化反應，產生左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)衍生物。(3)用高效液相色譜法檢測，並計算出供試品溶液中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含8.權利要求7所述的方法，，其特徵在於該檢測方法還包括以下步驟(1)製備衍生化試劑在避光條件下，使權利要求l-5任一項的含D型-或L型式(I)化合物溶解於權利要求6所述的溶劑中，配置成濃度為0.01100mg/ml的溶液。其特徵在於式(I)化合物優選(+)a-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯，溶劑優選乙腈，溶液的濃度優選1-10mg/ml。(2)分別製備濃度合適的左旋卡尼汀或右旋卡尼汀供試品溶液和消旋卡尼汀對照品溶液。(3)在溶劑的存在下，在2(TC95t:的水浴中，使上述步驟(1)的衍生化試劑分別與上述步驟(2)的供試品溶液和對照品溶液接觸密閉反應20min180min。(4)通過高效液相色譜儀分離和檢測反應後的對照品溶液和供試品溶液，按外標法分別以峰面積計算樣品中左旋卡尼汀(或右旋卡尼汀)的含量。9.權利要求7或8所述的方法，其中所述供試品包括各種含有左旋卡尼汀或/和右旋卡尼汀的藥物製劑、生物製劑、保健品、化妝品和各種食品，如左旋卡尼汀原料藥及其注射液、口服液、片、減肥膠囊、飲料等。10.權利要求7或8所述的方法，其中所述供試品包括含人在內的各種哺乳動物組織和血漿。11.權利要求7或8所述的方法，其中所述供試品包括各種可食用的動、植物食品，如豬、牛、羊、雞、蝦、魚、蛋、蔬菜、水果等食物。12.權利要求7或8所述的方法，其中所述供試品包括各種動物飼料。13.權利要求7或8所述的方法，其中所述供試品包括各種植物養料。14.權利要求l-4任一項中所述的光學活性純式(I)化合物在檢測手性胺基酸含量中的用途。15.光學活性純的下式(I)的化合物式(I)中帶*的碳原子是手性碳原子，本發明使用的化合物是其單一光學活性的手性化合物，其是D型或L型；R代表具有1-6個碳原子的直鏈或支鏈烷基，或具有6-10個碳原子的芳烷基，或具有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烯基或炔基，或具有3-6個碳原子的環烷基；X代表滷素。16.權利要求15所述的式(I)化合物，其中R代表甲基、乙基、異丙基、丁基或苄基；X代表C1或Br。17.權利要求15所述的式(I)化合物，其為固體結晶形式。18.權利要求17所述的式(I)化合物選自(+)a-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯，(-)a-甲基-6-甲氧基-2-萘乙醯氯，(+)a_甲基_6_乙氧基_2_萘乙醯氯和(_)a-甲基-6_乙氧基_2-萘乙醯氯。19.權利要求18所述的式(I)化合物其是(+)a-甲基_6-甲氧基-2-萘乙醯氯，其X衍射圖譜衍射角(29)時，在6.579(d=13.4231,1/1。=54.4)，10.979(d=8.0522，1/1。=34.1)，13.218(d=6.6925，1/10=72.2)，13.499(d=6.5539，1/10=45.8)，18.222(d=4.8646，1/1。=21.2)，18.780(d=4.7211，1/1。=100.0)，19.901(d=4.4577，1/1。=21.7)，21.619(d=4.1072，1/10=26.2)，22.100(d=4.0188，1/10=75.3)，27.139(d=3.2830，1/1。=19.0)，47.681(d=1.9057，1/1。=15.0)處具有特徵峰。全文摘要本發明提供了一種用於檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量的試劑的製備方法及其用途。本發明提供的試劑性能穩定，檢測左旋卡尼汀或右旋卡尼汀含量準確、靈敏，可以廣泛應用於檢測人工合成和天然提取的左旋卡尼汀的含量以及其中含有右旋異構體的雜質的含量，以及用於檢測含有左旋卡尼汀或/和右旋卡尼汀的各種藥物製劑或生物製劑、保健品、化妝品、人體體液和各種食品中手性異構體的含量，以及用於測定其他手性胺基酸的光學異構體的含量。文檔編號G01N30/02GK101726546SQ200810195330公開日2010年6月9日申請日期2008年10月13日優先權日2008年10月13日發明者李慶宜,王學成,顧書華申請人:常州高新技術產業開發區三維工業技術研究所有限公司