一種用於檢測BRCA1和BRCA2基因大片段重組的引物組合、方法及試劑盒與流程
2023-06-28 07:30:56
本發明涉及生物
技術領域：
，具體地涉及一種用於檢測brca1和brca2基因大片段重組的引物組合、方法及試劑盒。
背景技術：
：brca1和brca2是重要的抑癌基因，參與染色體損傷修復過程。brca1和brca2的突變可能造成基因功能的降低或缺失，進而增加細胞癌變的風險。現有的數據顯示，這兩個基因的胚系突變是造成遺傳性乳腺及卵巢癌的最重要因素，突變攜帶者一生中罹患乳腺癌的機率可高達87％，卵巢癌的機率可高達44％。因此，對高危人群進行brca1/2基因突變檢測，對於癌症的預防，發現和治療有著重要的指導意義。brca1/2的突變分為兩種。第一種是單個鹼基的突變或少量鹼基的缺失和插入，可以造成胺基酸序列的改變，翻譯提前終止，或信使rna加工的異常，進而影響蛋白的功能。第二種是大片段dna重組，可以造成一個或多個外顯子的缺失或重複，從而擾亂基因功能。這兩種突變中，第一種佔大部分，並且可通過基因片段pcr擴增和sanger測序相結合的常規方法進行檢測。第二種佔少部分，需要通過southern雜交，多重連接探針擴增技術mlpa(multiplexligation-dependentprobeamplification)，定量pcr或cgh(comparativegenomichybridization)等較為複雜的方法來檢測。第二代高通量測序技術也被運用到了brca1/2突變的檢測中。通過高通量測序，兩種類型的突變可以被同時檢測。但是，利用二代測序技術進行大片段dna重組的檢測，對基因組目的區域的富集方式、測序深度和信息分析等都有特定的要求，對於很多實驗室現有的檢測平臺來說都是非常大的挑戰。所以，一種快速有效的brca1/2大片段重組檢測技術，無論是作為獨立的大片段重組檢測項目，還是作為常規點突變檢測的補充，都有非常重要的應用價值。brca1和brca2共有48個外顯子。用southern雜交或實時定量pcr來檢測工作量大。cgh可同時檢測整個基因區域，但對技術平臺有很高的要求。以多重pcr為基礎的檢測技術操作簡單，方便快捷。mlpa技術被廣泛用於brca1/2及許多其它基因大片段dna重組的檢測，目前還存在數據變異較大的缺點，檢測精確度有待提高。技術實現要素：為了解決現有技術中存在的技術問題，本發明針對brca1和brca2的所有外顯子開發了一套引物，根據產物片段大小，將一套引物分為五組，利用gexp原理，通過五組引物對待測樣本進行多重擴增。利用五組引物進行多重pcr的產物片段大小分布在180至500bp的範圍之間。利用一條通用引物上的螢光修飾使所有擴增片段一端帶上螢光基團，通過毛細管電泳dna分析儀進行片段分析後，通過片段大小識別特徵片段，通過峰高判定每個外顯子所在區域的擴增強度，進而判斷各外顯子在基因組中的拷貝數和相應區域的大片段重組情況。本發明所提供的檢測方法具有操作簡單，成本低廉的優點。為實現本發明的技術目的，本發明第一方面提供一種用於檢測brca1和brca2基因大片段重組的引物組合，所述引物組合包括：從其擴增區段包含brca1和brca2基因的各個外顯子所在區域的特徵片段的多對引物中獲得五個引物組；其中，所述五個引物組是根據混合所述多對引物對brca1和brca2基因進行多重pcr擴增，並根據擴增片段長度差異及其在brca1和brca2基因上的分布優化分組得到的；其中，所述五個引物組中，每組引物中的每對引物所擴增的擴增產物片段長度均不相同，且每個擴增產物均代表brca1和brca2基因上的至少一個外顯子所在的區域，從而通過檢測擴增產物的峰高即可獲得brca1和brca2基因大片段重組的信息。其中，所述五組引物對為：如seqidno.1-seqidno.20所示的第一組引物對；如seqidno.21-seqidno.44所示的第二組引物對；如seqidno.45-seqidno.64所示的第三組引物對；如seqidno.65-seqidno.84所示的第四組引物對；如seqidno.85-seqidno.104所示的第五組引物對。其中，所述五組引物組＝對中的每對引物上均嵌有低退火溫度的通用引物序列。其中，所述通用引物序列如seqidno.105-seqidno.106所示。其中，所述通用引物中的一條5』端是經過螢光修飾的。為實現本發明的技術目的，本發明第二方面提供一種用於檢測brca1和brca2基因大片段重組的方法，包括：設計用來分別特異擴增brca1和brca2基因各個外顯子所在區域特徵片段的多對引物；通過將所述多對引物混合進行多重pcr擴增，得到包括從各個外顯子所在基因區域擴增來的多個擴增片段；根據所得到多個擴增片段長度，對所述多對引物進行分組，使每組引物對中的所有引物分別對應於不同長度的擴增片段，從而得到五組引物對；利用所述五個引物組中的每組引物對分別對待測樣本進行多重pcr處理，獲得每組均有多個有明顯長度差異的brca1和brca2基因的擴增產物的五組產物；根據所獲得的每組中的多個有明顯長度差異的brca1和brca2基因的擴增產物的峰高，獲得brca1和brca2基因各個外顯子所在區域的大片段重組突變信息。其中，每組擴增產物中的各個片段間至少存在10bp的長度差異。本發明的引物所擴增出的每個片段長度均具有10bp以上的差異，因此利用每組多重擴增產物中各片段的長度可以識別這一片段所代表的外顯子區域，利用毛細管電泳所獲得每個片段的峰高數據就可以反映出得brca1和brca2基因各個外顯子的信息，通過對峰高數據進行歸一化後，即可獲得各個片段的相對含量信息，從而得到基因區域在基因組中的相對含量，進而判斷各個外顯子所在區域的大片段重組突變信息。其中，所述五個引物組為：如seqidno.1-seqidno.20所示的第一引物組；如seqidno.21-seqidno.44所示的第二引物組；如seqidno.45-seqidno.64所示的第三引物組；如seqidno.65-seqidno.84所示的第四引物組；如seqidno.85-seqidno.104所示的第五引物組。其中，所述五個引物組中的每一個引物上均嵌有低退火溫度的通用引物序列。其中，所述通用引物序列如seqidno.105-seqidno.106所示。其中，所述利用所述五個引物組對待測樣本進行多重pcr處理時還包括如seqidno.105-seqidno.106所示通用引物。其中，所述通用引物的5』端具有螢光修飾。其中，所述利用五個引物組中的每組引物對分別對待測樣本進行多重pcr處理的反應體系為：特別是，所述多重pcr處理包括三個階段。其中，第一階段的退火溫度低於第二個階段的退火溫度，第二階段的退火溫度高於第三階段的退火溫度。特別是，第一階段的循環數低於第三階段的循環數，第二階段的循環數低於第三階段的循環數。尤其是，所述第一階段的退火溫度為56℃，第二階段的退火溫度為65℃，第三階段的退火溫度為48℃。特別是，所述多重pcr處理的第一個階段是，5℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸30s，十個循環。特別是，所述多重pcr處理的第二個階段是，5℃變性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s，十個循環。特別是，所述所述多重pcr處理的第三個階段是，5℃變性30s、48℃退火30s、72℃延伸30s，二十個循環。採用多重pcr及毛細管電泳進行大片段重組檢測時，為使pcr維持線性擴增，需要嚴格控制pcr反應的模板量和pcr循環數，但是這樣的控制會降低檢測的效率和可信度的冗餘，因此本發明採用了低退火溫度的通用引物，一方面將通用引物添加到每對引物的5』端，另一方面將通用引物與每組引物對配合進行pcr，並將pcr的反應條件控制為三個階段，第一、二個階段的擴增僅為10個循環數，使每對引物為主導進行pcr擴增，然後在第三個階段降低退火溫度，以通用引物為主導進行pcr擴增，保證了擴增產物中各片段的相對濃度不會偏離原始模板dna中各區段相對濃度，後期的通用引物的擴增為無差別擴增，也不會造成偏差，並且循環數要求不再嚴格，使毛細管電泳檢測可以準確獲得峰高信息。為實現本發明的技術目的，本發明第三方面提供一種用於檢測brca1和brca2基因大片段重組的試劑盒，包括第一方面所述的引物組合。其中，所述引物組合中的每組引物對包括多個引物，每對引物的濃度不完全相同。其中，所述第一組引物對包括10對引物，其中至少有兩對以上的引物的濃度不完全相同，從而實現每個目的片段的高效擴增。其中，所述第組引物對如表1所示，包括：表1第一組引物對的引物信息優選地，所述每組引物對的濃度如表2所示，為：表2第一組引物對的優選濃度引物對編號12345678910濃度(um)0.360.230.240.20.50.270.210.30.460.31其中，所述第二組引物對包括12對引物，其中至少有兩對以上的引物對的濃度不完全相同，從而實現每個目的片段的高效擴增，如表3所示，包括：表3第二組引物對的引物信息優選地，所述每對引物的濃度如表4所示，為：表4第二組引物對優選濃度其中，所述第三組引物對包括10對引物，其中至少有兩對以上的引物對的濃度不完全相同，從而實現每個目的片段的高效擴增，如表5所示，包括：表5第三組引物對的引物信息優選地，所述第三組引物對中的每對引物的濃度如表6所示，為：表6第三組引物對的優選濃度其中，所述第四組引物對包括10對引物，其中至少有兩對以上的引物對的濃度不完全相同，從而實現每個目的片段的高效擴增，如表7所示，包括：表7第四組引物對的引物信息優選地，所述第四組引物對中每對引物的濃度如表8所示，為：表8第四組引物對的優選濃度其中，所述第五組引物對中包括10對引物，其中至少有兩對以上的引物對的濃度不完全相同，從而實現每個目的片段的高效擴增，如表9所示，包括：表9第五組引物對的引物信息優選地，所述第五組引物對中每對引物的濃度如表10所示，為：表10第五組引物對的優選濃度其中，所述每組引物對的用量為：在25μl的pcr反應體系中，其用量為2.5μl。其中，所述試劑盒還包括用於配合所述多個引物組合的通用引物，所述通用引物序列如seqidno.105-seqidno.106所示。其中，所述通用引物的用量為，在25μl的pcr反應體系中，其用量為0.5μl。特別是，本發明所稱的待測樣本不包括甲醛固定石蠟包埋組織。本發明的有益效果：1、本發明提供的引物組中每對引物特異性好，其所擴增出的每個基因片段大小都不相同，均分布在180至500bp的範圍之間，不會發生引物與模板的非特異性結合，擴增結果可以真實準確反映brca1和brca2基因的遺傳信息，為判斷各外顯子在基因組中的拷貝數和相應區域的大片段重組情況提供基礎。2、本發明提供的引物、方法或試劑盒利用gexp原理對待測樣本進行多重擴增，根據片段大小和峰高就可以直觀的判定每個外顯子的擴增強度，判斷各外顯子在基因組中的拷貝數和相應區域的大片段重組情況，可見，本發明所提供的方法操作簡單，成本低廉，普適性廣。附圖說明圖1是本發明實施例3的電泳圖；圖2是本發明在對引物進行濃度分組時的採用其他濃度分組進行多重pcr獲得電泳圖；圖3是本發明實施例3的擴增產物所擴增的位置及分布圖，圖中，圓點表示擴增產物。圖4是本發明實施例3的各擴增片段相對含量對比圖。具體實施方式為了能夠更清楚地理解本發明的上述目的、特徵和優點，下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行進一步的詳細描述。在下面的描述中闡述了很多具體的細節以便於充分理解本發明，但是，本發明還可以採用不同於在此描述的其他方式來實施，因此，下面公開的具體實施例的限制並非用於限定本發明。實施例1引物組1、本發明採用常規的引物設計方法設計擴增區段包含brca1和brca2基因的各個外顯子所在區域的特徵片段的引物，篩選出擴增效率高，特異性強的，獲得52對引物，52對引物如seqidno.：001-seqidno.：104所示，具體如表11所示：表11引物組信息表其中，表11中「f」表示上遊引物，「r」表示下遊引物。2、將篩選獲得的52對引物對brca1和brca2基因擴增處理得到大小不完全相同的擴增片段，根據擴增片段的大小分成五組，根據不同擴增片段所對應的不同引物，將52對引物分為5組，獲得5組引物對，其中，每組引物對中的每對引物濃度都不完全相同。由於利用本發明的五個引物組對待測樣本進行擴增後，每組引物中的每對引物所擴增的擴增產物長度均不相同，且每個擴增產物均對應brca1和brca2基因上的至少一個外顯子區域，因此，只需通過檢測擴增產物的峰高即可獲得brca1和brca2基因上所有區域的大片段重組的信息。實施例2試劑盒本發明提供的試劑盒包括了實施例1的5組引物對，還包括低退火溫度的通用引物，以及extaq酶體系。其中，通用引物的具有如seqidno.：159-seqidno.：160所示的序列。其中，本發明所使用的extaq酶為市售的extaq酶試劑盒，其中包含了緩衝液、dntp以及extaq酶等成分，在本發明的一個實施例中，採用的是例如takara公司的extaq酶試劑盒。1、五組引物對的配製將所有引物按照表12所示的每組引物對的每對引物濃度配比進行配製：表12.五組多重引物混合物中各條引物的濃度發明人根據篩選獲得的引物進行分組過程中，進行過大量的濃度配比試驗，試驗發現，除表12所示濃度以外，其它濃度配比均不能獲得如圖1所示的五組均具有多條明亮的條帶，而是如圖2所示的當每個引物濃度相同時，每組只有幾條沒有明確邊界區分的條帶。2、向每組引物對配製extaq酶體系、通用引物以及擴增模板，其中，每組引物對與酶體系、通用引物、模板的濃度比例為：3、使用試劑盒的反應條件：採用如表13所示的溫度轉變pcr(temperature-switchpcr)的反應條件進行擴增：表13反應條件以下，結合具體的實施步驟進一步說明本發明的特點。本發明採用中科院腫瘤醫院保留的已知的5個核酸樣本作為待測樣本，分別為lr0、lr1、lr2、lr3、lr4，其相關信息如表14所示：其中lr0為無大片段重組的樣本，lr1、lr2、lr3、lr4為發生了大片段重組的已知陽性樣本，經螢光定量pcr檢測發現lr突變，並以長片段擴增技術驗證。四個樣本突變情況如下表14：表14樣本信息樣品編號突變情況dna濃度(ng/μl)lr0無突變67.2lr1brca1第8至第9外顯子區段缺失43.5lr2brca1第14至第21外顯子區段缺失20.9lr3brca2第1至第2外顯子區段缺失45.1lr4brca1第14至第15外顯子區段重複63.2實施例3brca1和brca2基因檢測brca1和brca2的大片段重組突變表現為基因區段的缺失或重複，本發明通過從基因各區段上擴增特徵片段，並分析特徵片段含量變化的方式檢測各區段是否存在大片段重組突變。利用本發明提供的引物及方法對樣本進行檢測，具體方法如下：1、目的片段的擴增將5個核酸樣本作為擴增模板，建立擴增反應體系，擴增目的基因片段：並將上述反應體系按照以下反應條件進行多重pcr擴增，獲得擴增產物：第一階段十個循環：95℃30s、56℃30s、72℃30s；第二階段十個循環：95℃30s、65℃30s、72℃30s；第三階段二十個循環：95℃30s、48℃30s、72℃30s。將所得產物經瓊脂糖凝膠電泳後，發現到每個樣品均可以獲得如圖1所示的具有5組條帶分明的電泳圖，每組條帶中的每個條帶大小都不相同，每個條帶大小均在180至500bp的範圍內。可見，本發明提供的引物組中52對引物都具有非常好的特異性，可以與模板不同位置的外顯子特異性結合，獲得不同大小的擴增產物，從而反映brca1和brca2基因的所有外顯子所在區段的信息。其中，擴增產物所擴增的位置及分布如圖3所示，圖中，圓點表示擴增產物。2.擴增產物片段分析取擴增產物1μl，與0.5μlliz-500及8.5μl去離子甲醯胺混合後，95℃變性3分鐘，冰浴2分鐘，放置在3730xldna分析儀上進行毛細管電泳分析，獲得生成.fsa文件的電泳分析數據。3.數據分析將得到的分析數據導入genemapper軟體進行dna片段分析，獲得峰高信息。將各組片段的峰高分別進行歸一化，使總峰高為1，每個片段的相對含量為此片段峰高佔總峰高的比例，然後參照已知野生型樣本的峰高值，將每個樣本的5組片段分別進行歸一化，獲得表15所示的峰高相對含量值，以及如圖3所示的各擴增片段相對含量對比圖，當歸一化之後的值小於0.75判斷為缺失，大於1.3判斷為重複。表15峰高相對含量值根據表15的數據可以得到如表16的判斷結果：表16判斷結果：由於本發明的引物可以準確的擴增出brca1和brca2基因上所有外顯子所在區域的特徵片段，因此本發明的引物及方法不但可以準確檢測出大片段重組，而且成本低廉，檢測結果可以經過直觀的判斷得出。需要說明的是，本發明將引物組合應用於brca1和brca2大片段重組的檢測，雖然在某些情況下，對這些基因的檢測對於相關癌症的診斷、預防和治療有重要的輔助意義，但這些突變不是必然導致所述疾病的發生，因此對這些基因的檢測並不一定涉及疾病的診斷或治療方法。當前第1頁12