一種呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒疫苗及其製備方法和應用的製作方法
2023-06-27 23:02:36
一種呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒疫苗及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及一種呼吸道合胞病毒(RSV)病毒樣顆粒(VLPs)亞單位疫苗、製備方法及應用。本發明涉及的疫苗組分是以B型肝炎病毒核心蛋白(HBc)為載體、與RSVG蛋白的中和抗原表位或同時與M2蛋白T細胞抗原表位融合表達的嵌合抗原蛋白。抗原蛋白能在大腸桿菌高效表達，經體外純化、變性和復性製備了高純度抗原組分，並自組裝成病毒樣顆粒(VLPs)。VLPs所含的RSVG蛋白與M2蛋白T細胞抗原表位同時表達，增強了疫苗誘導特異性免疫應答和抗RSV感染免疫保護的能力，並能誘導平衡的Th1/Th2類免疫應答和防止RSV疫苗增強疾病發生。應用所發明的VLPs疫苗免疫接種動物，誘導機體產生高水平RSV中和抗體、增強的Th1類細胞因子水平和針對RSV攻擊感染的有效保護。
【專利說明】一種呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒疫苗及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種嵌合表達呼吸道合胞病毒多表位抗原的病毒樣顆粒疫苗及其制 備方法和應用，屬於生物【技術領域】，用於人和易感動物呼吸道合胞病毒感染的免疫預防。
【背景技術】
[0002] 呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus,RSV)是全球範圍內引起嬰幼兒 下呼吸道感染並導致其罹患細支氣管炎和肺炎，嚴重可導致支氣管哮喘甚至死亡的重要病 原體之一，幾乎所有兒童兩歲前感染過至少一次RSV(Black, 2003)。年齡越小病情越重，再 感染率高，與哮喘發生密切相關；免疫缺陷者更易感染，臨床症狀更為嚴重，常致死亡（Holt and Sly，2002;Meissner et al.，2004)。老年人和免疫缺陷病人也是RSV的易感染人群。 人感染RSV後不能產生針對RSV感染的有效免疫保護，因此，RSV易反覆感染引起疾病。近 年來，因RSV感染住院並導致死亡的病例逐年上升。
[0003] RSV屬於副粘病毒科、肺炎病毒屬中的成員，其基因組為非節段的單負鏈RNA，由 15225個核苷酸組成。RSV基因組編碼至少11種蛋白質，基因組RNA從3'至5'端編碼的 蛋白依次為NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2(M2-l、M2-2)和L等，其中表面蛋白糖蛋白G和融 合蛋白F是主要中和抗原成分。機體感染RSV後，病毒編碼的G和F抗原蛋白能刺激機體 免疫應答，產生血清IgG中和抗體和呼吸道黏膜的分泌型IgA抗體。血清中和抗體和呼吸 道分泌型IgA是抗RSV感染的主要物質。此外，M2蛋白第82-90位胺基酸是一個有效的細 胞毒了淋巴細胞表位（Cytotoxic T lymphocyte epitopes,CTL)，能夠顯著激活⑶8+T細胞 免疫應答，抑制Th2類反應，降低疫苗增強性疾病（Vaccine Enhance Disease，VED)發生， 在抗RSV感染和減輕VED中具有重要作用。
[0004] 目前，針對RSV感染疾病治療的主要藥物是利巴韋林（Ribavirin)，一類鳥嘌呤核 苷類似物，可以阻止病毒RNA的合成及病毒mRNA的加帽，但該藥物治療效果有限。用於預 防高危嬰幼兒感染RSV的藥物有帕利珠單抗（palivizumab)，一種針對RSV表面融合蛋白F 的單克隆抗體。該藥物生產成本高，需要提前注射且持續注射5個月才能達到預防效果，因 此難以推廣應用。與其它病毒性傳染病一樣，疫苗接種應該成為預防RSV感染有效策略。在 上世紀60年代，人們製備了用福馬林滅活RSV的傳統滅活疫苗（Formalin inactivated RSV vaccine，FIV)，臨床試驗證實，該FIV疫苗接種後不僅沒能防止嬰幼兒感染RSV，疫苗 接種個體在隨後的RSV自然感染中，支氣管炎和肺炎發生率及疾病的嚴重程度均大大增 力口，入院治療人數明顯上升，出現疫苗接種兒童死亡病例（Kim et al.，1969)。隨後，RSV疫 苗研製一直是RSV感染性疾病防治的重點，但至今仍無有效的RSV疫苗獲得批准上市使用。 世界衛生組織（WHO)也將RSV疫苗列為全球疫苗計劃的優先發展疫苗之一。
[0005] FIV疫苗接種不能誘導機體有效的抗病毒免疫應答和引起VED，是當前RSV疫苗研 發的主要障礙。其原因在於，FIV接種不能誘導機體產生高水平中和抗體，未能誘導抗病毒 效應⑶8+T細胞免疫應答，宿主Thl/Th2比例及Thl、Th2產生的細胞因子比例失衡等所致。 而FIV接種誘導機體產生的IgE抗體，以及IL-4、IL-5和IL-10等為主的Th2偏向的⑶4+T 細胞應答在導致VED中起重要作用。提高疫苗誘導產生中和抗體能力、誘導更高效的CD8+T 細胞免疫應答，以及更平衡的Thl/Th2比例，是發展新型RSV疫苗的關鍵（Murata，2009)。
[0006] 亞單位疫苗是發展RSV疫苗的重要方向之一，近年來有諸多文獻報導。已有相 關的專利報導包括：有發明人以無毒型大腸桿菌熱不穩定腸毒素LT為佐劑，融合表達 RSVG蛋白aal30-230區域，並將其中的aal82-186之間胺基酸替換成RSVM蛋白的TCL 表位（YLEKESIYY)，發明了 Gcti亞單位疫苗（專利號：200710066476. 5)。另有發明人採 用DsbA為載體蛋白，表達RSVF/M2肽段，製備用於預防RSV感染的亞單位疫苗（專利號： 200510009119. 6)。特別是近來，有發明人以腺病毒為載體，將RSV的M、F和G蛋白基因重 組至基因組中製備了重組腺病毒，該重組腺病毒感染哺乳動物Vero細胞後，表達M、F和G 蛋白並組裝產生病毒樣顆粒，免疫動物能誘導機體抗RSV感染的有效保護（專利申請號： 201310667523. 7)〇
[0007] 病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLPs)是由病毒結構蛋白自行裝配而成的高 度結構化的蛋白顆粒，缺乏病毒核酸，無感染性。VLPs表面能夠重複高密度展示外源抗原表 位，從而誘導高效免疫應答。近來的研究表明，一些VLPs能有效通過MHCI類和MHCII類抗 原遞呈途徑遞呈抗原，誘導CTL應答，激發Thl和Th2型細胞免疫反應，一些病毒的VLPs可 誘導樹突狀細胞和單核巨噬細胞群的成熟和細胞因子的表達。因此，應用嵌合病毒樣顆粒 抗原製備疫苗具有安全高效的特點。
[0008] 人B型肝炎病毒（HBV)的核心抗原（HBc)在病毒感染過程能夠自發組裝成病毒樣 顆粒，包裹病毒的核酸。HBc自發形成的病毒樣顆粒有兩種大小，分別為由180個和240個 單體核心抗原組成的二十面體（Wynne et al.，1999)。HBc全長為183AA，其中75-82AA為 抗原顯現區，展示在病毒樣粒子表面，構成中間穗狀區。HBc的C末端39個AA富含精氨酸， 具有結合包裝病毒核酸的功能，去除後不影響HBc形成病毒樣顆粒。截短後的HBc能在大 腸桿菌中高效表達，並自主裝配成病毒樣顆粒，HBc的中間穗狀區和截短後的C末段都暴露 在病毒粒子的表面，該區域可融合表達外源的抗原表位（Birkett et al.，2002)。一些融合 外源B細胞抗原表位或T細胞抗原表位的HBc仍可組裝成嵌合VLPs，誘導免疫動物產生強 烈的免疫應答（Pumpens and Grens, 2001)。採用大腸桿菌表達的HBc能形成具有天然結 構的HBc顆粒，可用於構建表達不同抗原片段的VLPs疫苗。作為一種新型的抗原表位遞呈 系統，HBc載體蛋白已應用於流感病毒，愛滋病毒和結核分枝桿菌等病原體的疫苗研製（De Filette et al. , 2006 ；Gonzalez et al. , 2009 ；Yin et al.,2011)〇
[0009] 本發明在充分借鑑已有成果的基礎上，通過優化設計、實驗篩選，發明了基於HBc 為載體蛋白，包含有RSVG蛋白保守抗原結構和M2蛋白CTL表位，在大腸桿菌中表達形成病 毒樣顆粒的亞單位疫苗，該病毒樣顆粒亞單位疫苗可用於預防人和動物抵抗RSV的感染， 具有重要的科學和應用價值。
【發明內容】
[0010] 技術問題
[0011] 本發明的目的是提供一種新型的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒疫苗及其製備方法 和應用。該疫苗安全高效，不含感染性病毒核酸，抗原純度高，模擬抗原蛋白的天然結構，免 疫接種能誘導機體產生抗呼吸道合胞病毒感染的保護性免疫應答。用於人和動物呼吸道合 胞病毒感染引起的呼吸道疾患的免疫預防。
[0012] 技術方案
[0013] 本發明提供了一種呼吸道合胞病毒樣顆粒，包含以截短的B型肝炎病毒核心蛋白 (HBcl-144aa)為載體，嵌合其中的RSV G蛋白中和抗原表位，可自主裝配的病毒樣顆粒。
[0014] 本發明進一步提供一種在上述B肝病毒核心蛋白C末端還融合了 RSV M2蛋白的 CTL表位，可自主裝配的病毒樣顆粒。
[0015] 其中以截短的B型肝炎病毒核心蛋白（HBcl-144aa)為載體，將RSV編碼的G蛋 白保守 B 細胞表位的抗原片段（G144_204aa) (Plotnicky-Gilquin et al.，1999)插入 HBc 肽段的Asp78與Pro80之間；或同時將RSV編碼的M2蛋白的CTL表位82-90aa (M282_9Q)融 合在截短蛋白HBcl-144aa的C末端，該M282_ 9Q表位能有效激活機體⑶8+T淋巴細胞免疫反 應（Srikiatkhachorn and Braciale, 1997)。經密碼子優化設計、篩選，獲得了由編碼HBc 的l-144aa與RSVG蛋白的144_204aa核苷酸序列融合的基因片段（HBc-tG，SeqNO. 2)和 由編碼HBc的l-144aa與RSV G蛋白的144-204aa及M2蛋白82-90aa核苷酸序列融合的 基因片段（耶^6肩282_ 9(|，5叫勵.4)，將其分別克隆到表達載體？￡128中，構建重組表達質 粒 pHBc-tG 和 pHBc-tG/M282_9(l。將 pHBc-tG 和 pHBc-tG/M282_9(l 轉化大腸桿菌，篩選用於病 毒樣顆粒（VLPs)疫苗生產、特性穩定的工程菌株；經優化培養條件，高效表達了融合蛋白 HBc-tG和HBc-tG/M2 82_9(l。採用包涵體分離、蛋白質親和層析純化及體外復性自組裝等相結 合的技術路線，純化製備用於免疫接種的VLPs製品。
[0016] 呼吸道合胞病毒樣顆粒抗原用PBS稀釋至適當濃度，製備成本發明所述的呼吸道 合胞病毒樣顆粒疫苗。
[0017] 本發明獲得的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒抗原還可用於呼吸道合胞病毒感染診 斷試劑或診斷試劑盒。
[0018] 有益效果
[0019] 呼吸道合胞病毒顆粒疫苗接種小鼠誘導產生病原特異性中和抗體，第三次免疫2 周后，小鼠獲得抵抗致死劑量（3X IO6PFU/只）呼吸道合胞病毒攻擊感染的效力，並顯示出 較強的免疫記憶，誘導高效的⑶8+T細胞應答，平衡的Thl/Th2比例和對呼吸道合胞病毒強 毒攻擊感染小鼠100 %保護效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為設計合成的RSV嵌合抗原蛋白基因克隆載體質粒（為本發明設計，委託商 業公司合成）。
[0021] 圖2為重組表達質粒pHBc-tG和pHBc-tG/M282_9Q構建示意圖。
[0022] 圖3為本發明設計的HBc-tG和HBc-tG/M282_9Q重組疫苗蛋白組分鑑定。
[0023] A、工程菌表達HBc-tG和HBc-tG/M282_9(l重組疫苗蛋白組分SDS-PAGE分析（M :分 子量Marker ;1、3為表達HBc-tG工程菌加IPTG誘導前後的菌體蛋白；2、4為表達HBc-tG// M282_ 9Q工程菌加IPTG誘導前後的菌體蛋白）；B、SDS-PAGE檢測純化的疫苗成分（M:分子 量 Marker ;1 :HBc-tG ;2 :HBc-tG/M282_9Q) ;C、Western Blot 檢測疫苗成分的免疫反應性 (anti-tG 抗體；M :分子量 Marker ;1 :HBc_tG ;2 :HBc_tG/M282_90)。
[0024] 圖4為磷鎢酸負染後病毒樣顆粒（VLPs)透射電鏡TEM觀察。
[0025] A、HBc-tG 顆粒；B、HBc-tG/M282_9Q 顆粒；
[0026] 圖5為UV滅活RSV和兩種病毒樣顆粒（VLPs)疫苗免疫小鼠體液免疫應答檢測（A、 血清總IgG和IgGl及IgG2a亞類抗體滴度；B、亞類IgG2a/IgGl比值；C、中和抗體滴度。
[0027] 圖6為UV滅活RSV和兩種病毒樣顆粒（VLPs)疫苗免疫小鼠脾淋巴細胞分泌ThU Th2類細胞因子水平。
[0028] A、Thl類細胞因子；B、Th2類細胞因子；
[0029] 圖7為UV滅活RSV和兩種病毒樣顆粒（VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染後肺組 織分泌Thl和Th2類細胞因子水平。
[0030] A、Thl類細胞因子；B、Th2類細胞因子；
[0031] 圖8為UV滅活RSV和兩種病毒樣顆粒（VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染後肺組 織RSV滴度比較。
[0032] 圖9為UV滅活RSV和兩種病毒樣顆粒（VLPs)疫苗免疫小鼠RSV攻毒感染後肺組 織病理分析（肺組織切片染色觀察）。
[0033] A、UV滅活RSV疫苗免疫小鼠；B、HBc-tG顆粒疫苗免疫小鼠；C、HBc-tG/M282_ 9Q顆 粒疫苗免疫小鼠；D、正常小鼠；
【具體實施方式】
[0034] 現結合以下實施例來更加詳細地描述本發明。提供這些實施例的目的僅在於示例 性地說明本發明，不能將其理解為是對本發明的範圍和實質的限制。
[0035] 下列實施例中未註明的具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯 克等主編，科學出版社，1992,分子克隆實驗指南（第三版）；D. L斯佩克特等，科學出版社， 2001，細胞實驗指南等書中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0036] 本發明中所使用的術語，除非有另外說明，一般具有本領域普通技術人員通常理 解的含義。
[0037] 【實施例1】呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒（VLPs)的構建與檢測
[0038] L 1、質粒 pUC57 (HBc-tG/M282_9Q)的結構示意圖
[0039] 質粒pUC57-HBc-tG/M282_9Q是包含有本發明經密碼子優化設計、篩選的RSVG蛋白 保守抗原區與M2的CTL表位嵌合編碼基因序列的質粒載體。該基因序列所編碼的蛋白 質是將RSV編碼的G蛋白保守B細胞表位的抗原片段（G144_204aa) (Plotnicky-Gilquin et al.，1999)插入HBc肽段的Asp78與Pro80之間，同時將RSV編碼M2蛋白的CTL表位 82-90aa(M2 82_9Q)融合在截短蛋白HBcl-144aa的C末端，M282_9Q表位能有效激活機體CD8+T 淋巴細胞免疫反應（Srikiatkhachorn and Braciale, 1997)。由發明人委託商業公司合成， 智慧財產權歸發明人所有，如圖1所示。
[0040] 1. 2、重組表達載體 pHBc-tG 和 pHBc-tG/M282_9Q 構建
[0041] 1)重組表達質粒pHBc-tG構建
[0042] (1)以質粒pUC57-HBc-tG/M282_9Q為模板，以P1'和P2'為引物，PCR擴增目的基因 片段HBc-tG(序列見SEQIDN0. 2);引物由上海生物工程有限公司合成。
[0043] P1'（上遊引物）:5 ' -ATCGAATTCATGGATATCGACCCG-T3 ' (SEQ ID NO. 5)，下劃線標 注序列為EcoR I酶切位點；
[0044] P2'（下遊引物）:5' -TGCACTCGAGTTACTACGGTGGTTTCC-3' (SEQ ID NO. 6)，下劃線 標註序列為Xho I酶切位點。
[0045] (2)按照下表列出的PCR擴增體系組成依次加入各組分。
[0046] 表I PCR擴增體系
【權利要求】
1. 一種呼吸道合胞病毒（RSV)病毒樣顆粒，其特徵在於，以截短的B型肝炎病毒核心 蛋白胺基酸序列中第1-144位胺基酸為載體，包含嵌合其中的RSV G蛋白中和抗原表位，可 自主裝配的病毒樣顆粒。
2. 根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，在B型肝炎病毒 核心蛋白C末端還融合了 RSV M2蛋白的CTL表位。
3. 根據權利要求1所述的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，所述的RSV G蛋白 中和抗原表位是G蛋白的胺基酸序列中第144-204位胺基酸所示的序列，其胺基酸序列為 Seq NO. 1。
4. 根據權利要求2所述的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，所述的RSV M2蛋 白的CTL表位是M2蛋白的胺基酸序列中第82-90位胺基酸所示的序列。
5. 根據權利要求3所述的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，經密碼子優化設 計，獲得了由HBcl-144aa與RSV G144-204aa編碼序列融合的基因片段HBc-tG，其核苷酸 序列為Seq NO. 2。
6. 根據權利要求4所述的呼吸道合胞病毒樣顆粒，其特徵在於，所述的RSV G蛋白中 和抗原表位是G蛋白的胺基酸序列中第144-204位胺基酸所示的序列，其胺基酸序列為Seq NO. 3。
7. 根據權利要求6所述的呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒，其特徵在於，經密碼子優化設 計，獲得了由HBcl-144aa與RSV G144-204aa及M2(82-90aa)編碼序列融合的基因片段 HBc-tG/M282_9Q，其核苷酸序列為 Seq NO. 4。
8. 含有編碼權利要求1-7任一所述呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒的核酸的重組表達載 體。
9. 轉化了權利要求8所述的重組表達載體的宿主細胞。
10. 權利要求1-9任一所述呼吸道合胞病毒病毒樣顆粒用於製備預防、診斷和治療呼 吸道合胞病毒感染的藥物中的用途。
【文檔編號】C12N15/70GK104293741SQ201410531649
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月10日 優先權日:2014年10月10日
【發明者】潘茲書, 喬磊, 柴楓 申請人:武漢大學