一種利用線粒體內膜表達變形紫色紅質篩選淬滅自由基的活性物質和抗衰老產品的方法
2023-06-27 18:29:36
專利名稱：一種利用線粒體內膜表達變形紫色紅質篩選淬滅自由基的活性物質和抗衰老產品的方法
一種利用線粒體內膜表達變形紫色紅質篩選淬滅自由基的活性物質和抗衰老產品的方法技術領域建立篩選抗衰老保健品和藥物的細胞學方法背景技術動物細胞衰老的機理很複雜，其中由於有氧呼吸帶來的自由基的過量產生被認為是主要原因之一，特別是線粒體內自由基的過量產生，常常導致神經細胞和其他不能再分化而補償細胞的死亡，從而引發神經性退行疾病的發生和惡化。研究抵抗自由基引起的細胞凋亡從而成為抗衰老研究的重要方法。目前誘發自由基過量引起的細胞凋亡方法單一，主要是外源性加入過氧化氫等氧化劑。這類方法不能準確體現動物細胞自由基過量的自然發生情況，所以限制了抗衰老藥物的研發。在2000年等科學家報導從變形細菌基因組中克隆出一種新型的紫色紅質(變形紫色紅質，proteorhodospin, PR)的基因。隨後的實驗證明，該蛋白在大腸桿菌內可以表達到細胞膜上，在結合視黃醒後，可以接 受一定波長範圍的光能，逆濃度轉運質子，並且能夠在細胞膜兩側產生質子濃度差，從而驅動鞭毛的運動。在天然表達變形紫色紅質的細菌中，光能的利用對於碳源貧乏的生存環境被認為具有保護作用。2011年Slamovits等在天然真核細胞中也發現該類蛋白的表達,但蛋白主要分布在線粒體以外的細胞器內，其功能尚有待進一步研究確認。參考文獻I.劉樹森，線粒體呼吸與活性氧。生命科學2008，20 (4) =519-527.2. Beja, O et al Bacterial rhodopsin evidence for a new type ofphototrophy in the sea. Science2000,289(5486) :1902-1906.3. Steindler L, et al Energy starved Candidatus Pelagibacter ubiquesubstitutes light-mediated ATP production for endogenous carbon respiration.PLoS One. 2011,6(5) el9725.4. DeLong EF, BejaO, The Iight-driven proton pump proteorhodopsinenhances bacterial survival during tough times. PLoS Biol.2010,8 (4) el000359.5.Gomez-Consarnau L, et al Proteorhodopsin phototrophy promotessurvival of marine bacteria during starvation. PLoS Biol.2010,8(4) el000358.6. Martinez A,et al Proteorhodopsin photosystem gene expression enablesphotophosphorylation in a heterologous host. Proc Natl Acad Sci USA. 2007,104(13) :5590-5.7. Walter JM, et a I Light-powering Escherichia coli withproteorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007Feb 13 ；104 (7) :2408-12.8. Slamovits,CH,et al A bacterial proteorhodopsin proton pump in marineeukaryotes. Nature Comminications 2011,2 :183 (D0I 10. 1038/ncommsll88).9. Walter, JM et al Potential of light-harvesting proton pumps forbioenergy applications. Current Opinion in Biotechnology 2010, 21 :265-270.發明內容我們根據變形紫色紅質蛋白質的胺基酸序列，使用人體遺傳密碼的偏愛性，合成出在哺乳動物中可以高量表達的紫色紅質，並且使用細胞色素C氧化酶第四亞基的線粒體內膜信號肽置換原變形紫色紅質的細胞膜信號肽，從而實現在哺乳動物線粒體內膜上安置變形紫色紅質蛋白。該蛋白在一定波長範圍的光能驅動下，使線粒體內膜兩側產生質子濃度差。由於動物細胞的線粒體內膜上腺嘌呤三磷酸(ATP)合成酶是利用膜兩側的質子濃度差來驅動ATP的合成，所以光照條件下，線粒體電子傳遞鏈在滿足ATP合成的同時,產生了過量自由基。由此我們建立了一個產生線粒體內源性過量自由基的細胞模型。該模型中自由基的產生可以通過外設光源的波長，強度和輻射時間來進行定量控制，為篩選抗自由基藥物提供一種新的細胞篩選方法。
附圖I。人造線粒體內膜變形紫色紅質基因的核苷酸序列。附圖2。細胞流式儀檢測碳源缺失培養條件下微光照射可以增加綠色螢光蛋白表達量。· NB :無光照射；WA :微光照射(lOOlux)。Ml :平均綠色螢光蛋白量。
具體實施例方式舉例一合成人造線粒體內膜變形紫色紅質基因並克隆入表達載體質粒pSG5。按附圖I的核苷酸序列進行全基因的合成由北京三博遠志生物技術有限責任公司受委託完成。該基因片段經EcoRI和BamHI內切酶位點連入哺乳動物細胞表達載體pSG5 (Strategene公司，美國)。舉例二轉染人胚腎細胞株HEK293，短期表達人造線粒體內膜變形紫色紅質基因。用DMEM培養基(Hyclone公司，美國)和10%胎牛血清(杭州四季青公司)在48孔細胞培養板培養人胚腎細胞株HEK293(中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤研究所細胞庫)，每孔細胞轉染O. 5微克綠色螢光蛋白表達質粒(GreenLatern)和O. I微克pSG5/proteorhodopsin,使用GeneTranII轉染試劑O. 25微升(Biomiga公司，美國)。細胞培養液添加維生素A至30微摩爾/升。舉例三光照表達人造線粒體內膜變形紫色紅質基因的細胞。在二氧化碳細胞培養箱內使用8瓦白色螢光燈照明，使用XYI-III全數字照度儀(杭州新葉光電工程技術有限公司)對光強進行測量，並使用紙張進行遮光，以達到指定均勻光強。舉例四篩選抗自由基過量表達的保健品和藥物。配製不同濃度的樣品稀釋液，與轉入綠色螢光蛋白和變形紫色紅質表達載體的HEK293細胞共浴，使用100-12001uX光強的光照射48小時和8天。實驗結果顯示，未加藥品的細胞在光照條件下陸續凋亡，而加入維生素C和叔丁基對苯二酚(TBHQ)的細胞凋亡數目很少；加入牛磺酸，輔酶Q，褪黑素的細胞凋亡數目與空白對照結果接近，而加入維生素E或白藜蘆醇則促進細胞凋亡。以上藥品工作濃度各自為維生素C =1-10000微摩爾/升，TBHQ :0. 1-10微摩爾/升，牛磺酸5毫摩爾/升，輔酶Q 30微摩爾/升，褪黑素0. I毫摩爾/升，維生素E :0. I毫摩爾/升，白藜蘆醇0. 5毫摩爾/升。舉例五微光條件下綠色螢光蛋白表達量增加。使用無糖DMEM培養基(Mediatech，美國)(缺丙酮酸和穀氨醯胺)和10%胎牛血清，添加4毫摩爾/升L-穀氨醯胺和30微摩爾/升維生素A，培養HEK293細胞，並按舉例一比例轉染綠色螢光蛋白和變形紫色紅質表達質粒後，在無光或微光(lOOlux)條件下培養24小時，收集細胞，使用FACSCalibur型號細胞流式儀(BD Bioscience公司，美國)進行綠色螢光蛋白表達量的檢測，實驗結果見附圖二。在碳源(葡萄糖和丙酮酸)缺失培養條件下，微光(lOOlux)照射可以增加綠色螢光蛋白表達量。舉例六複製人造線粒體內膜變形紫色紅質基因並連入反轉錄穩定表達載體BABE0 使用寡核苷酸 5』 -aaa gaa ttc tea cta tta ggc gtt gct_3』 和 5』 -ggg gaa ttctaa acc acc atg cttgcc-3』為引物，pSG5/proteorhodopsin 為模板，高保真熱穩定 DNA 聚合酶Pfu為合成酶，進行PCR，擴增產物電泳純化，限制性內切酶EcoRI酶切後克隆入BABE反轉錄表達載體。權利要求I.在體外培養的動物細胞內表達變形紫色紅質，使其定位在線粒體內膜上。在光照條件下培養上述細胞，並且在培養基中加入待測物質，檢測該物質抑制細胞凋亡的效果和活性。
2.權限I中的動物細胞是原代細胞或細胞株，包括人胚腎細胞株HEK293。3.權限I中變形紫色紅質的人造基因是5 『-GGGG MT TOG OGG OOG CTT CTA GAG TM AOC AOC ATG CTT GCC ACT AGG GTG TTC AGT CTG GTCGGG AM OGG GCA Απ TCT AOC AGC GTC TGT GTG AGA GCC GGC GGA GGC GAT TTG GAC GCT TCTGAT TAT ACA GGA GTG AGT TTT TGG TTG GTC AOC GCA GCT CTT TTG GOG TOG ACA GTG TTT TTCΤΓΤ GTG GAG AGG GAC OGC GTA TCA GCA AM TGG MG AOC TOC TTG ACT GU AGT GGC CTC GTCACA GGA ATA GCT ΤΓΤ TGG CAC TAT ATG TAC ATG AGG GGC GTT TGG ATC GM AOG GGA GAT TOCOOC ACA GTT ΤΓΤ AGG TAT ATC GAC TGG CTC CTT ACT GTC OOC TTG CTG ATT TGT GAG TTC TATTTG ATC πΑ GCC GCT GCA AOC MT GTG GCT GGA TCA CTG TTC MG AM TTG TTG GTG GGG TOC Α GTG ATG TTG GTG TTC GGT TAC ATG GGC GM GCT GGA ATC ATG GCA GCC TGG OCA GCC ΤΓΤΑπ ATC GGC TGC CTC GCC TGG GTA TAT ATG ΑΤΑ TAC GAG CTC TGG GCA GGC GM GGA MG AGTGCT TGC MC ACA GCT AGC OCT GCG GTC CAG TOG GCC TAC MC ACA ATG ATG TAT Απ ATC ATCTTC GGC TGG GCG ΑΤΑ TAT OCT GTG GGC TAC TTC AOC GGT TAC TTG ATG GGC GAC GGG GGA AGTGCG CTT MT πΑ MC CTT Απ TAT MC CTC GCC GAT TTC GTG MC AM Απ m ΤΓΤ GGC CTGΑπ ATC TGG MC GTC GCT GTC AM GM TCA AGC MC GCC TM TAG TGA GGA TOC ACT AGT Μ_3 『4.權限I中表達變形紫色紅質基因的方式是將該基因克隆入表達載體質粒，比如PSG5質粒，或BABE反轉錄表達質粒，然後使用轉染方法，比如脂質體介導的方法導入細胞。如使用反轉錄載體，可以篩選整合該基因和帶抗性基因的細胞克隆。該基因可以在細胞內短時間或長時間表達。5.權限I中光照條件為可見光，光強範圍l-50001ux。最適光強範圍25-10001ux。6.權限I中光照時間為12小時至14天。最適光照時間為24小時至7天。7.權限I中待測化合物是天然產物或合成化合物。使用權限I篩出的陽性物質包括維生素C，叔丁基對苯二酚(TBHQ)。8.使用權限I篩選出的陽性物質，可以用於抗衰老和治療衰老引起的疾病，包括神經退行性疾病。
權利要求
1.在體外培養的動物細胞內表達變形紫色紅質，使其定位在線粒體內膜上。在光照條件下培養上述細胞，並且在培養基中加入待測物質，檢測該物質抑制細胞凋亡的效果和活性。
2.權限I中的動物細胞是原代細胞或細胞株，包括人胚腎細胞株HEK293。
3.權限I中變形紫色紅質的人造基因是 5 『-GGGG MT TOG OGG COG CTT CTA GAG TM ACC ACC ATG CTT GCC ACT AGG GTG TTC AGT CTG GTCGGG AM OGG GCA ATT TCT ACC AGC GTC TGT GTG AGA GCC GGC GGA GGC GAT TTG GAC GCT TCTGAT TAT ACA GGA GTG AGT TTT TGG TTG GTC ACC GCA GCT CTT TTG GCG TOG ACA GTG TTT TTCTTT GTG GAG AGG GAC OGC GTA TCA GCA AM TGG MG ACC TCC TTG ACT GTT AGT GGC CTC GTCACA GGA ATA GCT TTT TGG CAC TAT ATG TAC ATG AGG GGC GTT TGG ATC GAA AOG GGA GAT TCCCCC ACA GTT TTT AGG TAT ATC GAC TGG CTC CTT ACT GTC CCC TTG CTG ATT TGT GAG TTC TAT TTG ATC TTA GCC GCT GCA ACC MT GTG GCT GGA TCA CTG TTC MG AM TTG TTG GTG GGG TCCTTA GTG ATG TTG GTG TTC GGT TAC ATG GGC GAA GCT GGA ATC ATG GCA GCC TGG CCA GCC TTTATT ATC GGC TGC CTC GCC TGG GTA TAT ATG ATA TAC GAG CTC TGG GCA GGC GAA GGA MG AGTGCT TGC AAC ACA GCT AGC CCT GCG GTC CAG TOG GCC TAC AAC ACA ATG ATG TAT ATT ATC ATCTTC GGC TGG GCG ATA TAT CCT GTG GGC TAC TTC ACC GGT TAC TTG ATG GGC GAC GGG GGA AGTGCG CTT MT TTA AAC CTT ATT TAT AAC CTC GCC GAT TTC GTG AAC AM ATT TTA TTT GGC CTGATT ATC TGG MC GTC GCT GTC AM GAA TCA AGC MC GCC TM TAG TGA GGA TOC ACT AGT M-3『。
4.權限I中表達變形紫色紅質基因的方式是將該基因克隆入表達載體質粒，比如pSG5質粒，或BABE反轉錄表達質粒，然後使用轉染方法，比如脂質體介導的方法導入細胞。如使用反轉錄載體，可以篩選整合該基因和帶抗性基因的細胞克隆。該基因可以在細胞內短時間或長時間表達。
5.權限I中光照條件為可見光，光強範圍1-50001UX。最適光強範圍25-lOOOlux。
6.權限I中光照時間為12小時至14天。最適光照時間為24小時至7天。
7.權限I中待測化合物是天然產物或合成化合物。使用權限I篩出的陽性物質包括維生素C，叔丁基對苯二酚(TBHQ)。
8.使用權限I篩選出的陽性物質，可以用於抗衰老和治療衰老引起的疾病，包括神經退行性疾病。
全文摘要
本發明建立了一種利用線粒體內膜表達變形紫色紅質篩選淬滅自由基的活性物質和抗衰老保健品和藥物的方法。該方法使用人造變形紫色紅質基因，在動物細胞內表達後進入線粒體內膜，在光照條件下使線粒體內膜產生跨膜質子濃度差。利用該基因可以製造出受外源光照定量控制的促使線粒體內源產生自由基的細胞模型。該模型可以用於抗衰老產品的開發。
文檔編號C07K14/00GK102952796SQ201110242410
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月23日 優先權日2011年8月23日
發明者宋青, 姚文清, 李芳 , 張雯景, 王丹陽, 周陸軍, 柯翰中, 張懷 申請人:北京科技大學