具有α－糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物及其製劑的質量控制方法

2023-06-27 17:42:26

專利名稱：具有α－糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物及其製劑的質量控制方法
技術領域：
本發明涉及一種具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物及其製劑的質量控制方法，其中包括鑑別法和含量測定方法，屬新藥質量檢測控制方法技術領域。
背景技術：
糖尿病是以血糖升高為臨床特點的代謝內分泌疾病。糖尿病可分為I型和II型，對於II型糖尿病的治療，α-葡萄糖苷酶抑制劑是一類具有降低餐後血糖、調節並改善糖代謝異常的有效藥物之一。
本課題組在大量實驗的基礎上，以抑制α-糖苷酶生物活性功能為指導，從龍血竭全粉中有針對性地提取分離得到了具有很強α-糖苷酶抑制活性的降血糖提取物，該提取物對實驗動物體內降血糖試驗的良好結果，為取得具有自主智慧財產權的降血糖中藥新藥奠定了基礎。
為了完善龍血竭提取物及其製劑的臨床前研究成果，保證具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物及其製劑的質量，本課題組研究並建立了龍血竭提取物及其製劑的質量控制方法。

發明內容
本發明目的在於提供一種具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭降血糖提取物及其製劑的質量控制方法。
本發明的質量控制方法包括鑑別方法和含量測定方法。
1.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的質量控制方法之一--鑑別法A.高效液相色譜鑑別法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液配製取本品細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，並經微孔(0.45μm)濾膜濾過；
b.對照品溶液的配製精密稱取對照品劍葉龍血素A適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素A溶液；精密稱取對照品劍葉龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素B溶液；精密稱取對照品龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作為對照品龍血素B溶液；精密稱取劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含劍葉龍血素A 0.001-0.005mg、劍葉龍血素B 0.001-0.005mg和龍血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作為混合對照品溶液；c.色譜條件與系統適用性試驗上述三種對照品溶液及其混合溶液，用高效液相色譜儀測定，色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀(0.05mol/L)水溶液洗脫，檢測波長為280nm，理論塔板數按劍葉龍血素A，劍葉龍血素B，龍血素B峰計算，各不低於3000，三種對照品與相鄰峰的分離度≥1.5；d.鑑別步驟分別精密吸取對照品溶液、對照品混合溶液與供試品溶液各2-30μl，注入高效液相色譜儀測定，得各自色譜圖，確定劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B各自的保留時間，在供試品色譜圖中與上述三種對照品相應色譜的保留時間處出現色譜峰，相對應的色譜峰保留時間的相對誤差不超過2％，且供試品中劍葉龍血素B∶劍葉龍血素A∶龍血素B峰面積之比為(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄層色譜鑑別法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液的配製取供試品細粉適量，加甲醇溶解，製成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，作為供試品溶液；b.7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別取7，4』-二羥基黃酮對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光365nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；c.劍葉龍血素B薄層色譜鑑別取劍葉龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；d.龍血素B薄層色譜鑑別取龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
2.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的質量控制方法之二----含量測定法以龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行含量測定；a.供試品溶液的配製取供試品細粉適量，精密稱定，加甲醇配製成每1ml含本品1-2mg，搖勻，精密量取1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液；b.對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取(1)龍血素B標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻，精密量取1.0ml、.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在275nm波長處分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；(2)7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取7，4』-二羥基黃酮對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在330nm波長處，分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；c.對照品劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取；劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取精密稱取劍葉龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.01-0.05mg的對照品溶液，搖勻，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分別置於10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，組成不同濃度x的標準系列溶液。用螢光分析法分析。在激發波長320nm、發射波長355nm處，分別測定標準系列溶液相應的螢光強度y，求得螢光強度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；d.含量測定步驟用分光光度法，在275nm和330nm波長處測定供試品溶液的吸收值，分別從各自的線性回歸方程中，求得龍血素B與7，4』-二羥基黃酮的重量；用螢光分析法在激發波長320nm發射波長355nm處測定供試品溶液的螢光強度，在劍葉龍血素線性回歸方程中求得劍葉龍血素B的重量；本品以龍血素B、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B三者重量之和計算，含量不少於總稱量的50％。
3.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物製劑膠囊的質量控制方法之一---鑑別法A.高效液相色譜鑑別法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品；a.試品溶液配製取本品膠囊內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液並再經微孔(0.45μm)濾膜濾過；b.對照品溶液的配製精密稱取對照品劍葉龍血素A適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素A溶液；精密稱取對照品劍葉龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素B溶液；精密稱取對照品龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作為對照品龍血素B溶液；精密稱取劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含劍葉龍血素A 0.001-0.005mg、劍葉龍血素B 0.001-0.005mg和龍血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作為混合對照品溶液；c.色譜條件與系統適用性試驗上述三種對照品溶液及其混合溶液，用高效液相色譜儀測定，色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀(0.05mol/L)水溶液洗脫，檢測波長為280nm，理論塔板數按劍葉龍血素A，劍葉龍血素B，龍血素B峰計算，各不低於3000，三種對照品與相鄰峰的分離度≥1.5；d.鑑別步驟分別精密吸取對照品溶液、對照品混合溶液與供試品溶液各2-30μl，注入高效液相色譜儀測定，得各自色譜圖，確定劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B各自的保留時間，在供試品色譜圖中與上述三種對照品相應色譜的保留時間處出現色譜峰，相對應的色譜峰保留時間的相對誤差不超過2％，且供試品中劍葉龍血素B∶劍葉龍血素A∶龍血素B峰面積之比為(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄層色譜鑑別法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液配製取本品膠囊中內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液；b.7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別取7，4』-二羥基黃酮對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光365nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；c.劍葉龍血素B薄層色譜鑑別取劍葉龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；d.龍血素B薄層色譜鑑別取龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
4.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物製劑膠囊的質量控制方法之二----含量測定法以龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行含量測定；a.供試品溶液的配製取本品膠囊內容物適量，精密稱定，加甲醇配製成每1ml含本品1-2mg，濾過，棄初濾液，取續濾液1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。
b.對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取(1)龍血素B標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在275nm波長處分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；(2)7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取7，4』-二羥基黃酮對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在330nm波長處，分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；c.對照品劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取；劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取精密稱取劍葉龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.01-0.05mg的對照品溶液，搖勻，精密量取0.5ml1、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分別置於10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，組成不同濃度x的標準系列溶液。用螢光分析法分析。在激發波長320nm、發射波長355nm處，分別測定標準系列溶液相應的螢光強度y，求得螢光強度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；d.含量測定步驟用分光光度法，在275nm和330nm波長處測定供試品溶液的吸收值，分別從各自的線性回歸方程中，求得龍血素B與7，4』-二羥基黃酮的重量；用螢光分析法在激發波長320nm發射波長355nm處測定供試品溶液的螢光強度，在劍葉龍血素線性回歸方程中求得劍葉龍血素B的重量；本品每粒膠囊內容物以龍血素B、7，4『-二羥基黃酮和劍葉龍血素B三者之和計算，三者重量之和不少於[每粒膠囊內容物標示量×(1-藥劑輔料％)]的50％。
本發明的質量控制方法的幾點說明(1)鑑別法包括高效液相色譜鑑別法和薄層色譜鑑別法，具體檢測鑑別時，可採用兩種鑑別方法中之任一個。
(2)含量測定法為分光光度法和螢光分析法的聯合測定方法。
(3)在本發明質量控制方法中所涉及的對照品及龍血竭提取物供試品皆經過60℃減壓乾燥至恆重預處理操作步驟。
(4)本發明質量控制方法適用於龍血竭提取物製劑的質量控制。
具體實施例方式
現將龍血竭提取物及其製劑的各種質量控制方法具體敘述於後。
實施例1具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的高效液相色譜鑑別法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品。
(1)供試品溶液配製取本品細粉10mg，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.1mg的溶液，並經微孔(0.45μm)濾膜濾過。
(2)對照品溶液的配製精密稱取對照品劍葉龍血素A適量，加甲醇製成每1ml含0.002mg的溶液作為對照品劍葉龍血素A溶液；精密稱取對照品劍葉龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.002mg的溶液作為對照品劍葉龍血素B溶液；精密稱取對照品龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.0005mg的溶液作為對照品龍血素B溶液；精密稱取劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含劍葉龍血素A 0.002mg、劍葉龍血素B 0.002mg和龍血素B 0.0005mg的混合溶液作為混合對照品溶液。
(3)色譜條件與系統適用性試驗上述三種對照品溶液及其混合溶液，照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定，色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為30∶5∶65乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀(0.05mol/L)水溶液洗脫，檢測波長為280nm，理論塔板數按劍葉龍血素A計算為11000，按劍葉龍血素B計算為4500，按龍血素B峰計算為9100，各不低於3000。三種對照品與相鄰峰的分離度最少為1.7。
(4)鑑別步驟分別精密吸取對照品溶液、對照品混合溶液與供試品溶液各20μl，注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定，得各自色譜圖，確定劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B各自的保留時間，在供試品色譜圖中與上述三種對照品相應色譜的保留時間處出現色譜峰，相對應的色譜峰保留時間的相對誤差不超過2％，且供試品中劍葉龍血素B∶劍葉龍血素A∶龍血素B峰面積之比應為1∶5.5∶1.2。
實施例2具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的薄層鑑別法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品。
(1)供試品溶液配製取供試品細粉適量，加甲醇使解，製成每1ml含本品1.0mg的溶液，作為供試品溶液。
(2)7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別取7，4』-二羥基黃酮對照品，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取對照品溶液和供試品溶液各4μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以20∶1醋酸乙酯-甲醇為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光365nm波長檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
(3)劍葉龍血素B薄層色譜鑑別取劍葉龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，以3∶2醋酸乙酯-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
(4)龍血素B薄層色譜鑑別取龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以1∶1丙酮-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
實施例3具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的含量測定以龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行定量測定。
(1)供試品溶液的配製取本品細粉30mg，精密稱定，加甲醇配製成每1ml含本品1.0mg，搖勻，精密量取1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。
(2)對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液濃度與吸收度線性回歸方程的獲取龍血素B標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取取龍血素B對照品10mg，加甲醇製成每1ml含0.1mg的對照品溶液，搖勻，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄VD)在波長275nm處分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99。
7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取取7，4』-二羥基黃酮對照品10mg，加甲醇製成每1ml含0.1mg的對照品溶液，搖勻；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液。照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V)在330nm波長處，分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99。
(3)對照品劍葉龍血素B標準溶液濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取取劍葉龍血素B對照品10mg，加甲醇製成每1ml含0.02mg的對照品溶液，搖勻，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml，3.0ml和4.0ml，分別置於10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，組成不同濃度x的標準系列溶液。照螢光分析法(中國藥典2000年版二部附錄IVE)分析。在激發波長320nm、發射波長355nm處，分別測定標準系列溶液相應的螢光強度y，求得螢光強度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99。
(4)含量測定步驟照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V)，在275nm和330nm波長處測定供試品溶液的吸收值，分別從各自的線性回歸方程中，求得龍血素B與7，4』-二羥基黃酮的質量；照螢光分析法(中國藥典2000年版二部附錄IVE)，在激發波長320nm發射波長355nm處測定供試品溶液的螢光強度，在劍葉龍血素線性回歸方程中求得劍葉龍血素B的質量。
本品以7，4』-二羥基黃酮、龍血素B、劍葉龍血素B三者之和計算，含量為15.5mg不少於15mg。[注稱量(30mg)×50％＝15mg]。
實施例4具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物膠囊的高效液相色譜鑑別方法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品。
(1)供試品溶液配製取本品膠囊中內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.1mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液並再經微孔(0.45μm)濾膜濾過。
(2)對照品溶液的配製與實施例1項下的「(2)對照品溶液的配製」相同。
(3)色譜條件與系統適用性試驗與實施例1項下的「(3)色譜條件與系統適用性試驗」相同。
(4)鑑別步驟與實施例1項下的「(4)鑑別步驟相同。
實施例5具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物膠囊的薄層色譜鑑別方法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品。
(1)供試品溶液配製取本品膠囊中內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品1.0mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液。
(2)7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別與實施例2項下的「(2)7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別」相同。
(3)劍葉龍血素B薄層色譜鑑別與實施例2項下的「(3)劍葉龍血素B薄層色譜鑑別」相同。
(4)龍血素B薄層色譜鑑別與實施例2項下的「(4)龍血素B薄層色譜鑑別」相同。
實施例6具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物膠囊的含量測定方法以龍血素B(4『-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4『-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行定量測定。
(1)供試品溶液的配製取本品膠囊內容物30mg，精密稱定，置於25ml容量瓶中，加甲醇使溶解，並稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄初濾液，取續濾液1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
(2)對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液濃度與吸收度線性回歸方程的獲取與實施例3項下的「(2)對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液濃度與吸收度線性回歸方程的獲取」相同。
(3)對照品劍葉龍血素B標準溶液濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取與實施例3項下的「(3)對照品劍葉龍血素B標準溶液濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取」相同。
(4)含量測定步驟含量測定步驟與實施例3項下的「(4)含量測定步驟」相同。本品每粒膠囊內容物以7，4『-二羥基黃酮，龍血素B與劍葉龍血素B三者之和計算，三者重量之和為171mg，大於167mg[注膠囊內容物標示量(370mg)×(1-10％)×50％＝166.5mg]。
權利要求
1.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的質量控制方法之一---鑑別法A.高效液相色譜鑑別法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液配製取本品細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，並經微孔(0.45μm)濾膜濾過；b.對照品溶液配製精密稱取對照品劍葉龍血素A適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素A溶液；精密稱取對照品劍葉龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素B溶液；精密稱取對照品龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作為對照品龍血素B溶液；精密稱取劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含劍葉龍血素A 0.001-0.005mg、劍葉龍血素B 0.001-0.005mg和龍血素B0.0001-0.001mg的混合溶液作為混合對照品溶液；c.色譜條件與系統適用性試驗上述三種對照品溶液及其混合溶液，用高效液相色譜儀測定，色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀(0.05mol/L)水溶液洗脫，檢測波長為280nm，理論塔板數按劍葉龍血素A，劍葉龍血素B，龍血素B峰計算，各不低於3000，三種對照品與相鄰峰的分離度≥1.5；d.鑑別步驟分別精密吸取對照品溶液、對照品混合溶液與供試品溶液各2-30μl，注入高效液相色譜儀測定，得各自色譜圖，確定劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B各自的保留時間，在供試品色譜圖中與上述三種對照品相應色譜的保留時間處出現色譜峰，相對應的色譜峰保留時間的相對誤差不超過2％，且供試品中劍葉龍血素B∶劍葉龍血素A∶龍血素B峰面積之比為(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄層色譜鑑別法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液的配製取供試品細粉適量，加甲醇溶解，製成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，作為供試品溶液；b.7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別取7，4』-二羥基黃酮對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光365nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；c.劍葉龍血素B薄層色譜鑑別取劍葉龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；d.龍血素B薄層色譜鑑別取龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
2.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物的質量控制方法之二---含量測定法以龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行含量測定；a.供試品溶液的配製取供試品細粉適量，精密稱定，加甲醇配製成每1ml含本品1-2mg，搖勻，精密量取1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液；b.對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取(1)龍血素B標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度的標準系列溶液，用分光光度法在275nm波長處分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；(2)7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取7，4』-二羥基黃酮對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在330nm波長處，分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；c.對照品劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取；精密稱取劍葉龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.01-0.05mg的對照品溶液，搖勻，精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml，分別置於10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，組成不同濃度x的標準系列溶液。用螢光分析法分析。在激發波長320nm、發射波長355nm處，分別測定標準系列溶液相應的螢光強度y，求得螢光強度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；d.含量測定步驟用分光光度法，在275nm和330nm波長處測定供試品溶液的吸收值，分別從各自的線性回歸方程中，求得龍血素B與7，4』-二羥基黃酮的重量；用螢光分析法在激發波長320nm發射波長355nm處測定供試品溶液的螢光強度，在劍葉龍血素線性回歸方程中求得劍葉龍血素B的重量；本品以龍血素B、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B三者重量之和計算，含量不少於總稱量的50％。
3.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物製劑膠囊的質量控制方法之一---鑑別法A.高效液相色譜鑑別法以劍葉龍血素A(4』-羥基-2，6-二甲氧基雙氫查耳酮)、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為高效液相色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液配製取本品膠囊內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.05-0.5mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液並再經微孔(0.45μm)濾膜濾過；b.對照品溶液的配製精密稱取對照品劍葉龍血素A適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素A溶液；精密稱取對照品劍葉龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.001-0.005mg的溶液作為對照品劍葉龍血素B溶液；精密稱取對照品龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含0.0001-0.001mg的溶液作為對照品龍血素B溶液；精密稱取劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B適量，加甲醇製成每1ml含劍葉龍血素A 0.001-0.005mg、劍葉龍血素B 0.001-0.005mg和龍血素B 0.0001-0.001mg的混合溶液作為混合對照品溶液；c.色譜條件與系統適用性試驗上述三種對照品溶液及其混合溶液，用高效液相色譜儀測定，色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑，流動相為(30-40)∶(4-6)∶(66-54)乙腈-甲醇-磷酸二氫鉀(0.05mol/L)水溶液洗脫，檢測波長為280nm，理論塔板數按劍葉龍血素A，劍葉龍血素B，龍血素B峰計算，各不低於3000，三種對照品與相鄰峰的分離度≥1.5；d.鑑別步驟分別精密吸取對照品溶液、對照品混合溶液與供試品溶液各2-30μl，注入高效液相色譜儀測定，得各自色譜圖，確定劍葉龍血素A、劍葉龍血素B和龍血素B各自的保留時間，在供試品色譜圖中與上述三種對照品相應色譜的保留時間處出現色譜峰，相對應的色譜峰保留時間的相對誤差不超過2％，且供試品中劍葉龍血素B∶劍葉龍血素A∶龍血素B峰面積之比為(0.5-2.0)∶(4-6)∶(0.5-2.5)；B.薄層色譜鑑別法以7，4』-二羥基黃酮、劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]和龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)為薄層色譜鑑別法的對照品；a.供試品溶液配製取本品膠囊中內容物細粉適量，精密稱定，加甲醇製成每1ml含本品0.5-2.0mg的溶液，濾過，棄初濾液，取續濾液；b.7，4』-二羥基黃酮薄層色譜鑑別取7，4』-二羥基黃酮對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(18-25)∶1醋酸乙酯-甲醇為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光365nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；c.劍葉龍血素B薄層色譜鑑別取劍葉龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上，(1-5)∶2醋酸乙酯-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點；d.龍血素B薄層色譜鑑別取龍血素B對照品，加甲醇製成每1ml含0.05-0.5mg的溶液，作為對照品溶液。用薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液及對照品溶液2-10μl，分別點於同一矽膠G薄層板上以(0.5-2.0)∶1丙酮-石油醚為展開劑，展開後，晾乾，置於紫外光254nm波長處檢視，在供試品薄層色譜中，與對照品相應色譜的斑點位置上顯相同顏色的螢光斑點。
4.具有α-糖苷酶抑制活性的龍血竭提取物製劑膠囊的質量控制方法之二---含量測定法以龍血素B(4』-羥基-2，4，6-三甲氧基雙氫查耳酮)、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B[6-羥基-7-甲氧基-3-(4』-羥苄基)色原烷]為含量測定的對照品。分別代表查耳酮、黃酮和黃烷等黃酮類化合物。前兩者用紫外分光光度法後者用螢光分析法進行含量測定；a.供試品溶液的配製取本品膠囊內容物適量，精密稱定，加甲醇配製成每1ml含本品1-2mg，濾過，棄初濾液，取續濾液1.0ml，置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液；b.對照品龍血素B和7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取(1)龍血素B標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取龍血素B對照品適量，加甲醇製成每lml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻，精密量取1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml和5.0ml，分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在275nm波長處分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；(2)7，4』-二羥基黃酮標準溶液的濃度與吸收度線性回歸方程的獲取精密稱取7，4』-二羥基黃酮對照品適量，加甲醇製成每lml含0.05-1.00mg的對照品溶液，搖勻；精密量取0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml和4.0ml分別置於25ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；組成不同濃度x的標準系列溶液，用分光光度法在330nm波長處，分別測定標準系列溶液相應的吸收度y，求得吸收度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；c.對照品劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取劍葉龍血素B標準溶液的濃度與螢光強度線性回歸方程的獲取精密稱取劍葉龍血素B對照品適量，加甲醇製成每1ml含0.01-0.05mg的對照品溶液，搖勻，精密量取0.5ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml和5.0ml，分別置於10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，組成不同濃度x的標準系列溶液。用螢光分析法分析。在激發波長320nm、發射波長355nm處，分別測定標準系列溶液相應的螢光強度y，求得螢光強度y與濃度x的線性回歸方程以及相關係數r，r不低於0.99；d.含量測定步驟用分光光度法，在275nm和330nm波長處測定供試品溶液的吸收值，分別從各自的線性回歸方程中，求得龍血素B與7，4』-二羥基黃酮的重量；用螢光分析法在激發波長320nm發射波長355nm處測定供試品溶液的螢光強度，在劍葉龍血素線性回歸方程中求得劍葉龍血素B的重量；A.本品每粒膠囊內容物以龍血素B、7，4』-二羥基黃酮和劍葉龍血素B三者之和計算，三者重量之和不少於[每粒膠囊內容物標示量×(1-藥劑輔料％)]的50％。
全文摘要
本發明涉及一種具有α－糖苷酶抑制活性的龍血竭降血糖提取物及其製劑的質量控制方法。其中包括鑑別法和含量測定法，屬新藥質量檢測控制方法技術領域。本發明質量控制方法中的鑑別法包括高效液相鑑別法和薄層色譜鑑別法；質量控制方法中的含量測定法是採用分光光度法和螢光分析法的聯合測定的方法。本發明的質量控制方法，對血竭提取物的其他製劑也同樣適用。
文檔編號G01N33/15GK1745803SQ20051002823
公開日2006年3月15日 申請日期2005年7月28日 優先權日2005年7月28日
發明者呂敬慈, 雍克嵐, 陳旭, 劉培培, 周曉惠, 顧慧娟, 欒梅, 張天寶 申請人:上海大學