人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒的製作方法

2023-05-28 17:11:11 1

人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒的製作方法
【專利摘要】一種人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒，包括盒體（1）和盒體上方的盒蓋（2），其特徵是：所述盒體（1）內設有微孔板（6）和位於盒體（1）底部的支撐板（3），其中微孔板（6）由48或96個微孔（7）組成，支撐板（3）上開有多個孔（4），所述孔（4）內共放置有八個試劑瓶（5），所述八個試劑瓶（5）內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有人附睪上皮分泌蛋白4單克隆抗體包被的磁顆粒。
【專利說明】 人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及一種人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒，用於體外定量測定人血清中的人附睪上皮分泌蛋白4含量。
【背景技術】
[0002]卵巢癌近年來發病率越來越高，在婦科腫瘤中發病率僅次於子宮頸癌和子宮體癌位居第三位，但其致死率卻佔據首位。這主要是因為卵巢深藏在骨腔內，卵巢癌早期症狀十分不明顯，缺乏有效的早期診斷，75%的患者在就診時已屬晚期。
[0003]人附睪上皮分泌蛋白4 (Human epididymis protein4,HE4)是近年來開發出的一種新型腫瘤標誌物，HE4編碼基因最早是由Kichhoff等人於1991年從附睪上皮遠端分離出來，1999年Schummer等人通過cDNA微陣列分析，發現HE4 (又名WFDC2) mRNA在卵巢癌組織中高表達，而在癌旁組織中不表達。之後證實HE4具有卵巢癌診斷的價值，而且在早期卵巢癌診斷中靈敏度和特異性都優於CA125。為了提高卵巢癌早期診斷水平和改善治療效果，從檢測角度上來說，目前臨床上用於測定HE4的方法主要有放射性免疫技術、酶聯免疫技術和化學發光技術等。
[0004]過去以放射性免疫技術為代表的人附睪上皮分泌蛋白4 (HE4)測定試劑盒由於方法學的限制，其靈敏度和抗幹擾能力嚴重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市場；目前應用較多的為酶聯免疫技術和化學發光技術，其中化學發光技術興起於上個世紀80年代，是繼酶聯免疫技術和放射性免疫技術之後發展起來的新興技術，由於其高靈敏度、高特異性，同時方法簡便、快速，標記結合物穩定，無放射性同位素損傷和汙染等特點，在近些年得到了飛速發展。
[0005]目前已公示的人附睪上皮分泌蛋白4(HE4)相關專利共11項，其中包括化學發光技術、酶聯免疫技術、時間分辨螢光檢測相關技術，而未見磁微粒分離技術與化學發光技術相結合應用到免疫分析中。磁微粒分離酶聯免疫檢測技術是一種以磁性微粒為固相分離載體，將免疫磁微粒分離技術與酶聯免疫檢測技術相結合而建立的一種新型免疫檢測方法。

【發明內容】

[0006]本實用新型的目的在於克服上述不足，提供一種靈敏度高、特異性強、操作簡單的人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒。
[0007]本實用新型的目的是這樣實現的:
[0008]一種人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒，包括盒體和盒體上方的盒蓋，所述盒體內設有微孔板和位於盒體底部的支撐板，其中微孔板由48或96個微孔組成，支撐板上開有多個孔，所述孔內共放置有八個試劑瓶，所述八個試劑瓶內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有人附睪上皮分泌蛋白4單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0009]與現有技術相比，本實用新型的有益效果是:[0010]本實用新型人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒具有較高的靈敏度和特異性，更短的獲得檢測結果的時間和更簡便的操作方式，對上皮性卵巢癌的早期診斷、療效監測以及預後判斷、降低卵巢癌患者的病死率中的具有重要應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本實用新型人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒的結構示意圖。
[0012]圖2為圖1去掉盒蓋和微孔板後的俯視圖。
[0013]圖3為圖1中微孔板的結構示意圖。
[0014]其中:
[0015]盒體I
[0016]盒蓋2
[0017]支撐板3
[0018]孔4
[0019]試劑瓶5
[0020]微孔板6
[0021]微孔7。
【具體實施方式】
[0022]參見圖1-圖3，本實用新型人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒，包括盒體I和盒體上方的盒蓋2，所述盒體I內設有微孔板6和位於盒體I底部的由泡沫塑料製成的支撐板3，其中微孔板6由48或96個微孔7組成，支撐板3上開有多個孔4，所述孔4內共放置有八個試劑瓶5，所述八個試劑瓶5內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有人附睪上皮分泌蛋白4單克隆抗體包被的磁顆粒。
[0023]製備方法
[0024]步驟一、磁分離試劑的製備
[0025]一、磁珠緩衝液配製
[0026]1、稱取 TRIS 4.58g和 NaC16.81g 於 IL 容器中，然後稱取 0.96g TWEEN-20 於 20ml容器中加適量水使其完全溶解後，再倒入上述IL容器中；
[0027]2、用移液器將Proclin-300量取0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中，然後在上述IL容器中加入800ml純化水，充分攪拌；
[0028]3、調節PH計測量其PH值，控制PH在7.95-8.05之間；
[0029]4、稱取BSA 3g倒入上述IL容器中；
[0030]5、最後IL容器定容至1000ml,用0.2um濾器過濾；過濾完後貼好標籤於2_8°C冷庫貯存。
[0031]二、磁分離試劑的製備
[0032]1、將1.0mg辛二酸二琥珀醯亞胺酯溶於50ulDMS0中，取2mg抗HE4單克隆抗體溶於PH 9.5的0.lmol/L的PB緩衝液中至總體積為Iml ；
[0033]2、確定辛二酸二琥珀醯亞胺酯的投入量，用移液槍吸取辛二酸二琥珀醯亞胺酯加入到上述HE4單克隆抗體溶液中，置室溫90min ；
[0034]3、然後將抗體溶液加入到Centricon-1O濃縮管中，放入到高速冷凍離心機中在3000g下濃縮30min至體積為0.5ml ；
[0035]4、取0.5ml磁珠加入5ml反應杯中，放入專用試管架，經磁鐵吸附2分鐘後吸取上清；
[0036]5、每次加入1.5ml PH9.5的0.lmol/L的PB緩衝液，混勻30秒，上架，去上清，重複操作3次；將獲得的抗體溶液加入到上述磁珠中，混勻後室溫反應4小時；
[0037]6、加入 0.3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37°C 15 分鐘；
[0038]7、每次加入1.5ml PH7.2的0.lmol/L的PB緩衝液清洗已經標記的磁珠，混勻30
秒，上架，去上清，重複操作3次；
[0039]8、用IOOml磁珠保存液將磁珠轉入125ml玻璃瓶，即為0.05%的HE4磁分離試劑；
[0040]磁珠保存液配方為0.1% 854，0.05%吐溫-20，0.02%似吧，20%乙醇，41:保存。
[0041]9、將獲得的磁分離試劑用磁珠緩衝液按照1:1的比例混勻，即得本實用新型試劑盒中磁分離試劑。
[0042]步驟二、酶反應物的製備
[0043]一、酶反應物稀釋液的配製
[0044]1、取Tris 4.846g、HCl 2847 μ I於燒瓶中，然後在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌使試劑完全溶解；
[0045]2、調 PH,控制 PH 在 7.35-7.45 ；
[0046]3、稱取BSA 4g倒入上述燒杯中；
[0047]4、最後燒杯定容至400ml,用0.2um濾器過濾即得。
[0048]二、辣根過氧化物酶(HRP)與HE4抗原的偶聯
[0049]1、取HE4-3-cmo-BSA抗原Img放置於Iml玻璃管中；
[0050]2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的終濃度到達5mg/ml，然後充分混勻；
[0051]3、按照Imol抗原加入IOmol的辛二酸二琥珀醯亞胺酯的摩爾比例加辛二酸二琥珀醯亞胺酯到上述2溶液中，37°C恆溫箱中反應1.5小時；
[0052]4、按照3mol抗原加入Imol的(HRP)的摩爾比往上述3的溶液中添加(HRP)，然後加入Iml的PH為7.4濃度為0.1M的PB緩衝液，置於37度恆溫箱中反應3小時；
[0053]5、將上述4的溶液用ro-ΙΟ柱純化，收集純化液，按照1:3000的體積添加獲得的酶反應物稀釋液，混合均勻即得酶反應物。
[0054]步驟三、反應增強劑的配製
[0055]1、稱取TRIS1.56g和NaCl 4.23g於IL容器中；用移液器將Proclin-300量取
0.2ml於IOml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；
[0056]2、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解，然後調PH值，控制PH在7.35-7.45之間；
[0057]3、稱取Mak33 0.9g於上述IL容器中；最後定容至1000ml,完全溶解後,用0.2um濾器過濾。
[0058]步驟四、校準品稀釋液的配製[0059]1、稱取 Tris 7.268g 和 Hcl 4270 μ I 於 IL 的容器中，定容至 600ml ;
[0060]2、用量筒量取小牛血清300ml，加入上述溶液中，校準品稀釋液備用。
[0061]步驟五、校準品和質控品的配製
[0062]校準品濃度分別為4，8，16，32，64pmol/L ;質控品濃度分別為0.75，7.5ng/ml。
[0063]步驟六、清洗濃縮液的配製
[0064]1、稱取 Kcl 4g、NaC140g、鹿糖 IOg 於 IL 容器中；
[0065]2、稱取0.225g Tween-20於IOOml容器中加15ml水使其完全溶解後，倒入上述IL
容器中；
[0066]3、用移液器將Proclin-300量取0.225ml於盛有15ml純化水的燒杯中完全溶解後，倒入上述IL容器中；
[0067]4、用量筒量取800ml純化水於上述IL容器中，充分攪拌直至完全溶解；
[0068]5、調PH，控制其範圍在7.35-7.45之間；
[0069]6、最後定容至1000ml,完全溶解後用0.2um濾器過濾即得。
[0070]步驟七、底物溶液的配製
[0071]一、底物溶液A的配製步驟
[0072]1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、魯米諾1.0g和對碘苯酚0.1mg於IL燒杯中；
[0073]2、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH，控制其範圍在7.95-8.05之間；
[0074]3、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻後即得。
[0075]二、底物溶液B的配製
[0076]1、稱取硼砂5.721g、硼酸2.474g、過氧化脲0.1g和PC300 250ul於IL燒杯中；
[0077]2、用量筒量取400ml純化水於IL燒杯中，充分攪拌直至完全溶解，調PH控制其範圍在7.95-8.05之間；
[0078]3、用0.2um濾器過濾收集濾液,用純化水定容至500ml,混勻後即得。
[0079]所得的產品分裝即為半成品，抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定性檢定合格才能組裝成人附睪上皮分泌蛋白4 (HE4)微孔板式磁顆粒化學發光免疫分析測定試劑盒，組裝成試劑盒後還需抽檢合格後才能出廠。
[0080]工作原理:
[0081]本實用新型為雙抗體夾心法化學發光免疫分析法與磁微粒分離技術相結合的一種檢測方法。在標本、校準品和質控品中加入定量的酶標HE4抗原、結合著磁性微粒的HE4單克隆抗體及穩定增強劑。37°C孵育後，酶標HE4抗原與標本、校準品和質控品中HE4競爭的與結合著磁性微粒的HE4單克隆抗體發生特異性結合。在外加磁場中直接沉澱，不需離心即可分離。倒去上清液，清洗沉澱的複合物，然後加入酶促化學發光底物。底物在酶作用下被催化裂解，形成不穩定的激發態中間體，當激發態中間體回到基態時便發出光子，形成發光反應，即可使用發光儀檢測反應的發光強度。在檢測範圍內，反應的發光強度與樣本中的HE4濃度成反比。
[0082]使用方法
[0083](I)樣品的前處理:
[0084]使用本試劑盒進行實驗前，需先取出辣根過氧化物酶標記的HE4抗體、校準品/待測樣品、HE4抗體磁顆粒、發光底物液和洗滌液，在室溫放置15-30min，使它們平衡到室溫；之後，將恆溫箱或者水浴鍋調至37°C ;準備好合適的微量加樣器及對應吸頭並且檢查化學發光儀是否工作正常。
[0085](2)操作步驟:
[0086]1、加50 μ I ΗΕ4校準品、質控品、待測標本至對應微孔底部；
[0087]2、加50 μ I酶反應物至每一微孔中；
[0088]3、加50 μ I反應增強劑至每一微孔中；
[0089]4、加50 μ I磁分離試劑至每一微孔中；
[0090]5、用塑料薄膜覆蓋微孔，多管混勻器輕輕振蕩微孔板30s後，置37°C水浴30分鐘；
[0091]6、微孔板放至磁分離器上，確保每個微孔都與分離器表面接觸，沉澱2分鐘；緩慢的倒轉分離器倒出上清液，把倒轉的微孔板連同分離器一起放在濾紙上，用力拍擊分離器底部以除去粘在微孔上的所有液滴；
[0092]7、清洗濃縮液用純化水稀釋20倍後，加200 μ I稀釋後的清洗液至每一微孔中，置多管混勻器上輕輕振蕩混勻30s ;加樣時應避免加樣力度過大而導致磁珠濺出，且混勻要徹底；
[0093]8、重複步驟6、7、6 —遍；
[0094]9、加100 μ I底物溶液至微孔中混勻3秒，迅速用準備好的發光檢測儀進行檢測；
[0095]10、如遇到高值HOOK樣本，為了避免出現高值HOOK效應，建議臨床醫師根據其餘測試指標選擇合適的稀釋倍數對樣品進行稀釋。
[0096]以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪製出標準曲線(雙對數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清的HE4的濃度，其中縱坐標為發光強度，橫坐標為HE4濃度(單位為pmol/L)。
[0097]性能指標
[0098]I)準確性:試劑盒校準品與國家校準品同時測定，兩條劑量-反應曲線不顯著偏離平行。以國家校準品為對照品，試劑盒校準品試劑盒的實際值與標示值之比應該在
0.90-1.10的範圍內
[0099]2)劑量-反應曲線的線性:用雙對數數學模型擬合，在4-64pmol/L濃度範圍內，劑量-反應曲線的相關係數(r)的絕度值不低於0.9900
[0100]3)精密性:CV ≤15%
[0101]4)最低檢出量:〈2pmol/l
[0102]5)質控血清測定值:應在質控範圍內
[0103]6)特異性:交叉反應率應小於0.2%
[0104]7)穩定性:將試劑盒37°C放置7天，測定結果應符合上述I)~5)項要求
[0105]本實用新型具有以下優點:
[0106]1、本實用新型將化學發光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種接近均相的反應體系，與現有技術相比，靈敏度高，特異性強，檢測範圍寬，操作簡單，無放射性汙染，試劑盒成本低，臨床適用性強。
[0107]2、本實用新型對所用的原材料進行篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性，磁顆粒的吸附性能和變異大小，(HRP)的活性、化學發光底物的發光強度及發光持續時間等，對於(HRP)的標記可以有不同的方法，通過反覆探索和對比試驗最終找到了簡單、產率高、成本低、質量可靠的標記方法。
[0108]3、本實用新型採用一種新的專用穩定增強劑以及清洗濃縮液，使得反應過程更加穩定可靠，實驗數據靈敏有效，在提高產品性能的同時，並且大大降低了產品成本。
[0109]4、試劑盒中的磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品，清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液均是該反應體系下的最優配方，給該試劑盒的使用效期及檢測性能提供了有力保障。
[0110]5、本實用新型採用微孔板磁顆粒整合了兩種技術，主要體現在:(1)利用磁顆粒在相同體積的情況下表面積最大的原理，能夠結合更多的抗體，從而使得反應的靈敏度更高，線性範圍更寬；(2)可以同時批量測量，適合大批量血清篩查。
【權利要求】
1.一種人附睪上皮分泌蛋白4定量測定試劑盒，包括盒體(I)和盒體上方的盒蓋(2)，其特徵是:所述盒體(I)內設有微孔板(6)和位於盒體(I)底部的支撐板(3)，其中微孔板(6)由48或96個微孔(7)組成，支撐板(3)上開有多個孔(4)，所述孔(4)內共放置有八個試劑瓶(5)，所述八個試劑瓶(5)內分別含有磁分離試劑、酶反應物、穩定增強劑、校準品、質控品、清洗濃縮液、稀釋液以及底物溶液，其中磁分離試劑含有人附睪上皮分泌蛋白4單克隆抗體包被的磁顆粒。
【文檔編號】G01N33/577GK203414474SQ201320476898
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年8月6日 優先權日:2013年8月6日
【發明者】奚偉紅, 王布強, 王京, 史偉鋒, 高淑舫 申請人:江蘇福隆生物技術有限公司